專利名稱：毛竹理化復(fù)合誘變育種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種植物種子的物理與化學(xué)復(fù)合誘變育種方法，具體是對(duì)毛竹種子進(jìn)行銫的Y射線輻照與疊氮化鈉(NaN3 )或甲基磺酸こ酯(EMS)誘變劑處理液浸潰的復(fù)合誘變育種方法。
背景技術(shù)：
毛竹(Phyllostachysheterocycla cv. Pubescens)是一種生長(zhǎng)極快、成材早、產(chǎn)量高、收益期長(zhǎng)的優(yōu)良竹種。毛竹很少開(kāi)花結(jié)籽，一旦開(kāi)花隨即走向衰敗，因而無(wú)法進(jìn)行雜交育種，毛竹的遺傳改良工作相對(duì)冷落?！栋不辙r(nóng)業(yè)科學(xué)》37卷17期刊登了蔡新玲等學(xué)者的“毛竹輻射誘變育種苗的研究初報(bào)” 一文，介紹了用6tlCo-Y為輻射源，劑量率為1.86Gy/min、最佳輻照劑量為25Gy，對(duì)毛竹種子進(jìn)行輻射誘變處理的情況，用単一的Y輻照這一物理方法對(duì)毛竹種子進(jìn)行誘變處理，比自然變異擴(kuò)大了變異譜，増加了突變體數(shù)量，作出了有益的貢獻(xiàn)。物理誘變與化學(xué)誘變的機(jī)理不同，誘導(dǎo)的突變類型不盡相同，將兩種誘變方式結(jié)合即復(fù)合誘變對(duì)毛竹種子進(jìn)行處理，以期獲得更廣的變異譜、更多的突變體量，有其一定的現(xiàn)實(shí)意義和科研價(jià)值，經(jīng)檢索，尚未見(jiàn)有ー套完整的方法公諸于世。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供ー種毛竹理化復(fù)合誘變育種方法。解決上述技術(shù)問(wèn)題采用如下技術(shù)方案本毛竹理化復(fù)合誘變育種方法，是按如下步驟進(jìn)行(I)毛竹種子的采集每年9月?lián)竦夭杉蠓N子凈度> 90%，千粒重> 28g，含水率10% -14%，在密封袋中存放，4°C環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?2)輻照射線與化學(xué)誘變劑的選定采用137Cs- Y射線輻照與疊氮化鈉即NaN3誘變劑處理液浸泡的復(fù)合誘變，或用137Cs-Y射線輻照與甲基磺酸こ酯即EMS誘變劑處理液浸泡的復(fù)合誘變。(3)誘變劑處理液的配制①NaN3誘變劑處理液的配制用4. 11ml、濃度為
0.lmol/L的磷酸氫ニ鈉溶液與15. 89ml、濃度為O. lmol/L的檸檬酸溶液混勻，分別加入O、6. 5、13、26、52、65和130mg的NaN3，用蒸餾水定容至I升，即成濃度為0,0. 1,0. 2,0. 4,0. 8、
1.O和2. 0mmol/L，pH為3. O的NaN3誘變劑處理液EMS誘變劑處理液的配制用3. 05ml、濃度為O. 2mol/L的磷酸氫ニ鈉溶液與O. 65ml、濃度為O. 2mol/L的磷酸ニ氫鈉溶液混勻，分別加入0、1、2、4、8、1和2ml的EMS，用蒸餾水定容至I升，即成體積比濃度為0,0. 1%,
O.2%,O. 4%,O. 8%、1%和 2%，pH 為 3. O 的 EMS 誘變劑處理液。(4)理化復(fù)合誘變處理先對(duì)毛竹種子用137Cs- Y射線輻照處理，將毛竹種子剝?nèi)シf包后裝入塑料封ロ袋內(nèi)進(jìn)行輻照處理，輻射劑量率為lGy/min，輻射劑量為30Gy，再用38-42°C溫水浸種12-16h，用吸水紙吸干種子表面的水分后分別用濃度為O. 04mmol/L、pH為3. O的NaN3溶液或體積比濃度為O. 05%、pH為7. O的EMS溶液進(jìn)行浸種誘變處理8h，邊浸種邊攪拌，然后取出種子，用清水反復(fù)沖洗2h，即成為經(jīng)理化復(fù)合誘變處理后的毛竹種子。(5)種子的發(fā)芽試驗(yàn)、幼苗早期及幼苗成株后的各相關(guān)形態(tài)參數(shù)的測(cè)定。本發(fā)明的有益效果是對(duì)難以進(jìn)行雜交改良的毛竹提供一種復(fù)合誘變育種的新方法，在短時(shí)期內(nèi)獲得突變率高、性狀變異多祥、優(yōu)良性狀選擇余地大的突變體，推進(jìn)毛竹新品種改良的進(jìn)程。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明下面結(jié)合實(shí)施例予以詳述本毛竹理化復(fù)合誘變育種方法，是按如下步驟進(jìn)行 (I)毛竹種子的采集每年9月?lián)竦夭杉?，要求種子凈度彡90%，千粒重彡28g，含水率10% -14%，在密封袋中存放，4°C環(huán)境中保存?zhèn)溆茫?2)輻照射線與化學(xué)誘變劑的選定采用137Cs- Y射線輻照與NaN3誘變劑處理液浸泡的復(fù)合誘變，或用137Cs- Y射線輻照與EMS誘變劑處理液浸泡的復(fù)合誘變；(3)誘變劑處理液的配制①NaN3誘變劑處理液的配制用4. 11ml、濃度為
0.lmol/L的磷酸氫ニ鈉溶液與15. 89ml、濃度為O. lmol/L的檸檬酸溶液混勻，分別加入O、6. 5、13、26、52、65和130mg的NaN3，用蒸餾水定容至I升，即成濃度為0,0. 1,0. 2,0. 4,0. 8、
1.O和2. 0mmol/L，pH為3. O的NaN3誘變劑處理液EMS誘變劑處理液的配制用3. 05ml、濃度為O. 2mol/L的磷酸氫ニ鈉溶液與O. 65ml、濃度為O. 2mol/L的磷酸ニ氫鈉溶液混勻，分別加入0、1、2、4、8、1和2ml的EMS，用蒸餾水定容至I升，即成體積比濃度為0,0. 1%,O. 2%,O. 4%,O. 8%、1%和 2%，pH 為 3. O 的 EMS 誘變劑處理液。(4)理化復(fù)合誘變處理先對(duì)毛竹種子用137Cs-Y射線輻照處理，將毛竹種子剝?nèi)シf包后裝入塑料封ロ袋內(nèi)進(jìn)行輻照處理，輻射劑量率為lGy/min，輻射劑量為30Gy，再用38-42°C溫水浸種12-16h，用吸水紙吸干種子表面的水分后分別用濃度為O. 04mmol/L、pH為3. O的NaN3溶液或體積比濃度為O. 05 %的EMS溶液進(jìn)行浸種誘變處理8h，邊浸種邊攪拌，然后取出種子，用清水反復(fù)沖洗2h，即成為經(jīng)理化復(fù)合誘變處理后的毛竹種子；(5)種子的發(fā)芽試驗(yàn)、幼苗早期及幼苗成株后的各相關(guān)形態(tài)參數(shù)的測(cè)定。下面將與本發(fā)明有關(guān)的試驗(yàn)與測(cè)定情況介紹如下一、預(yù)處理設(shè)計(jì)U137Cs-Y射線預(yù)處理將種子剝?nèi)ネ饷娣f苞后裝入塑料封ロ袋內(nèi)在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所輻照中心進(jìn)行137Cs-Y射線輻照處理，輻射劑量率為lGy/min。輻射劑量分別為0、50、100、150、200、250、350和450Gy，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)種子數(shù)量為100粒。2、NaN3 預(yù)處理將種子剝?nèi)ネ饷娣f苞后，先用溫水(40°C左右)浸種12-16h，用吸水紙吸干表面水分后，分別用0、0. 1,0. 2,0. 4,0. 8、I. 0,2. OmmoI/L的NaN3誘變劑處理液進(jìn)行浸種誘變處理8h，處理期間不斷攪動(dòng)處理液，使?jié)舛染鶆?。?jīng)不同濃度NaN3處理后的種子分別再用清水反復(fù)沖洗2h。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)100粒種子,保持I粒種子至少ImL的處理液。3、EMS 預(yù)處理
將種子剝?nèi)ネ饷娣f苞后，先用40°C左右溫水浸種12-16h，用吸水紙吸干表面水分后，分別用0、0. 1%,0.2%,0.4%,0.8%U%>2% (V/V)的EMS誘變劑處理液進(jìn)行浸種誘變處理8h，處理期間不斷攪動(dòng)處理液，使?jié)舛染鶆?。?jīng)不同濃度EMS處理后的種子分別再用清水反復(fù)沖洗2h。每種處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)100粒種子,保持I粒種子至少ImL的處理液。對(duì)各個(gè)誘變處理后的種子進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，根據(jù)種子發(fā)芽率的情況，進(jìn)ー步選出進(jìn)行復(fù)合誘變效應(yīng)研究的處理劑量。ニ、種子萌發(fā)期指標(biāo)參數(shù)的測(cè)定I、發(fā)芽試驗(yàn)將上述復(fù)合誘變處理的種子置于鋪有潤(rùn)濕的2層濾紙或紗布的發(fā)芽盒(13X19 X IOcm)中進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，每種處理設(shè)3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)100粒種子，于溫度設(shè)為 25±2°C的人工氣候箱(寧波萊?？萍加邢薰?中萌發(fā)，種子萌發(fā)后，以胚根長(zhǎng)不短于種子長(zhǎng)度，胚芽長(zhǎng)不短于種子長(zhǎng)度的一半時(shí)記為發(fā)芽，每天記載發(fā)芽種子數(shù)，并計(jì)算發(fā)芽終期的發(fā)芽率發(fā)芽率(％)=(全部正常發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù))X 100%。2、幼苗苗高增長(zhǎng)量、分蘗數(shù)、展葉數(shù)的測(cè)定在室內(nèi)人工培養(yǎng)箱的發(fā)芽盒中培養(yǎng)30d后的幼苗，其中Y射線選擇經(jīng)0、30、60、90、120、150Gy6個(gè)劑量輻照(180Gy輻照種子后沒(méi)有一粒長(zhǎng)成完整植株)后的幼苗，其他誘變處理濃度參照發(fā)芽試驗(yàn)，將幼苗以盆栽的形式移至浙江林學(xué)院智能溫室中。塑料盆的規(guī)格為上口徑10cm，下口徑7cm，高8cm，盆栽所用基質(zhì)為以體積I : I : I的比例混合的蛭石、泥炭、珍珠巖混合物。幼苗培育期間水分供給一致，進(jìn)行正常的栽培管理。移載后每隔8d測(cè)量一次苗高和展葉數(shù)，此時(shí)苗高以盆內(nèi)基質(zhì)水平面至第一片完全展開(kāi)葉的長(zhǎng)度為準(zhǔn)；自第一株幼苗分蘗開(kāi)始，每隔8d測(cè)定其分蘗數(shù)。每個(gè)處理選擇10株長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗進(jìn)行測(cè)定。3、畸變率和畸變類型調(diào)查經(jīng)復(fù)合誘變處理后的毛竹種子，在室內(nèi)人工培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，30d后對(duì)幼苗的形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行觀察，調(diào)查統(tǒng)計(jì)發(fā)生矮小型、條紋或斑點(diǎn)葉、畸形葉等畸變類型的株數(shù)進(jìn)行畸變率的計(jì)算；仔細(xì)觀察各畸變類型隨著幼苗的生長(zhǎng)特別是成株后的變化。三、幼苗成株后指標(biāo)參數(shù)的測(cè)定由于高劑量或高濃度的誘變劑處理后的種子無(wú)法長(zhǎng)成ー個(gè)完整的植株或完整植株的數(shù)量太少不能滿足試驗(yàn)條件，所以在進(jìn)行光色素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)等指標(biāo)測(cè)定時(shí)，對(duì)處理劑量或濃度進(jìn)行了篩選，137Cs-Y射線輻照的劑量為0、30、60、90、120Gy ；NaN3處理濃度為 0,0. 04,0. 08,0. 16mmol/L ；EMS 處理濃度為 0,0. 1%,0. 2%,0. 4% ;復(fù)合誘變處理濃度分別為 30Gy+0. 04mmol/L,30Gy+0. 08mmol/L,30Gy+0. lmmol/L 和 30Gy+0. 0530Gy+0. I %、30Gy+0. 2 %、30Gy+0. 4 %。I、光合色素含量的測(cè)定分別于2008年8月6日選取經(jīng)137Cs- Y射線、化學(xué)誘變劑NaN3和EMS處理后一年生實(shí)生苗，于2008年10月8日選取經(jīng)復(fù)合誘變處理后4個(gè)月大的實(shí)生苗進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)劑量或濃度處理任選5盆植株，每盆摘取頂部新長(zhǎng)出的完全展開(kāi)葉1-2片，將其剪成l_2mm的細(xì)絲或小塊，混勻后，采用丙酮こ醇水=4. 5 4.5 I (V/V)混合液浸提法至葉片無(wú)色時(shí)測(cè)定，每個(gè)處理劑量3次重復(fù)。采用UV-2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)檢測(cè)波長(zhǎng)在663、645nm等處的吸光度值，按Lichtenthaler和Wellburn對(duì)Arnon法的修正公式，計(jì)算葉片光合色素的含量。經(jīng)不同誘變處理方式處理后的毛竹種子，在室內(nèi)人工培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，一個(gè)月后 對(duì)其形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)ー些特殊性狀，表現(xiàn)在植株矮小、葉片畸形，包括葉片卷曲，葉片皺縮，葉分叉等、葉有斑點(diǎn)或條紋等等。其統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)下表。不同誘變處理對(duì)幼苗畸變率的影響
權(quán)利要求
1.一種毛竹理化復(fù)合誘變育種方法，其特征是按如下步驟進(jìn)行(1)毛竹種子的采集每年9月?lián)竦夭杉?，要求種子凈度>90%，千粒重> 28g，含水率 10% -14%，在密封袋中存放，4°C環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?2)輻照射線與化學(xué)誘變劑的選定采用137Cs-Y射線輻照與NaN3誘變劑處理液浸泡的復(fù)合誘變，或用137Cs- Y射線輻照與EMS誘變劑處理液浸泡的復(fù)合誘變。(3)誘變劑處理液的配制①NaN3誘變劑處理液的配制用4.11ml、濃度為O. lmol/L 的磷酸氫二鈉溶液與15. 89ml、濃度為O. lmol/L的檸檬酸溶液混勻，分別加入0、6. 5、13、 26、52、65和130mg的NaN3，用蒸餾水定容至I升，即成濃度為0,0. 1,0. 2,0. 4,0. 8、I. O和2.OmmoI/L, pH為3. O的NaN3誘變劑處理液 ’②EMS誘變劑處理液的配制用3. 05ml、濃度為O. 2mol/L的磷酸氫二鈉溶液與O. 65ml、濃度為O. 2mol/L的磷酸二氫鈉溶液混勻，分別加入0、1、2、4、8、1和2ml的EMS，用蒸餾水定容至I升，即成體積比濃度為0、0. 1%,0. 2%,O.4%,O. 8%、1%和2%，pH為3. O的EMS誘變劑處理液。(4)理化復(fù)合誘變處理先對(duì)毛竹種子用137Cs-Y射線輻照處理將毛竹種子剝?nèi)シf包后裝入塑料封口袋內(nèi)進(jìn)行輻照處理，輻射劑量率為lGy/min，輻射劑量為30Gy，再用 38-42°C溫水浸種12-16h,用吸水紙吸干種子表面的水分后分別用濃度為O. 04mmol/L的 NaN3誘變劑處理液或體積比為O. 05 %的EMS誘變劑處理液進(jìn)行浸種誘變處理8h，邊浸種邊攪拌，然后取出種子，用清水反復(fù)沖洗2h，即成為經(jīng)理化復(fù)合誘變處理后的毛竹種子。(5)誘變處理后種子的發(fā)芽試驗(yàn)、幼苗早期及幼苗成株后的各相關(guān)形態(tài)參數(shù)的測(cè)定。
全文摘要
一種毛竹理化復(fù)合誘變育種方法，按如下五個(gè)步驟進(jìn)行—是毛竹種子的采集，種子凈度≥90％，千粒重≥28g，含水率10％-14％，密封后4℃中保存?zhèn)溆?。二是輻照射線選定為原子量137的銫γ射線作照射源，與兩種誘變劑處理液。三是兩種誘變劑處理液的配制。四是理化復(fù)合誘變處理，輻射劑量率1Gy/min，輻射劑量為30Gy，再用溫水浸種十幾小時(shí)吸水紙吸干表面水后，用濃度為0.04mmol/L的疊氮化鈉(NaN3)溶液或甲基磺酸乙酯(EMS)溶液進(jìn)行浸種誘變處理8h后取出用清水反復(fù)沖洗2h即成復(fù)合誘變處理的毛竹種子，再用該種子進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，驗(yàn)證誘變效果和確定誘變劑量。本方法誘變的突變體多、性狀變異多樣，育種所需的優(yōu)良性狀選擇余地大。
文檔編號(hào)A01H1/06GK102696478SQ20121021546
公開(kāi)日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月19日
發(fā)明者劉亞迪, 方偉, 桂仁意, 湯定欽 申請(qǐng)人:浙江農(nóng)林大學(xué)