植物耐逆性相關(guān)蛋白GmNF-YB6及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種植物耐逆性相關(guān)蛋白GmNF-YB6及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；（b）將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加,且與植物耐逆性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所提供的GmNF-YB6可以在低溫、干旱和高溫的誘導(dǎo)性下表達(dá)，可以特異的調(diào)控含有CCAAT-box順式元件（核心元件CCAAT）的基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，可以提高植物的耐旱性、抗凍性和耐高溫能力。本發(fā)明的GmNF-YB6為人為控制抗逆和耐逆相關(guān)基因的表達(dá)提供了基礎(chǔ)，將在抗逆性和耐逆性增強(qiáng)的植物育種中發(fā)揮重要的作用這為人為控制耐逆相關(guān)基因的表達(dá)提供了基礎(chǔ)，將在耐逆性增強(qiáng)的植物育種中發(fā)揮重要作用。
【專利說明】植物耐逆性相關(guān)蛋白GmNF-YB6及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種植物耐逆性相關(guān)蛋白GmNF-YB6及其編碼基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]干旱、高鹽和低溫等逆境脅迫嚴(yán)重制約著大豆的生長、發(fā)育。因此，了解大豆對逆境條件的應(yīng)答與信號傳導(dǎo)機(jī)制，提高大豆品種的抗逆性，成為大豆遺傳研究及品種改良的重要任務(wù)之一。
[0003]在逆境脅迫下植物體內(nèi)會產(chǎn)生一系列應(yīng)答反應(yīng)，伴隨著許多生理生化及發(fā)育上的變化。明確植物對逆境的反應(yīng)機(jī)制，將為抗逆基因工程研究和應(yīng)用提供科學(xué)論據(jù)。目前，植物抗逆性研究已逐漸深入到細(xì)胞、分子水平，并與遺傳學(xué)和遺傳工程研究相結(jié)合，探索用生物技術(shù)來改進(jìn)植物生長特性，其目的是提高植物對逆境的適應(yīng)能力。
[0004]在干旱、高鹽和低溫等環(huán)境脅迫的逆境條件下，植物能夠在分子、細(xì)胞和整體水平上做出相應(yīng)的調(diào)整，以最大程度上減少環(huán)境所造成的傷害并得以生存。許多基因受脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，這些基因的產(chǎn)物不僅能夠直接參與植物的脅迫應(yīng)答，而且能夠調(diào)節(jié)其它相關(guān)基因的表達(dá)或參與信號傳導(dǎo)途徑，從而使植物避免或減少傷害，增強(qiáng)對脅迫環(huán)境的抗性。與脅迫相關(guān)的基因產(chǎn)物可以分為兩大類:第一類基因編碼的產(chǎn)物包括離子通道蛋白、水通道蛋白、滲透調(diào)節(jié)因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜堿等)合成酶等直接參與植物脅迫應(yīng)答的基因產(chǎn)物;第二類基因編碼的產(chǎn)物包括參與脅迫相關(guān)的信號傳遞和基因表達(dá)調(diào)節(jié)的蛋白因子，如蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子等。其中，轉(zhuǎn)錄因子在植物脅迫應(yīng)答的基因表達(dá)調(diào)控中起著重要作用。
[0005]轉(zhuǎn)錄因子也稱為反式作用因子，是能夠與真核基因啟動子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性作用的DNA結(jié)合蛋白，通過它們之間以及與其它相關(guān)蛋白之間的相互作用，激活或抑制轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)`決定了它與順式作用元件結(jié)合的特異性，而轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)決定了它對基因表達(dá)起激活或是抑制作用。此外，其自身活性還受到核定位及寡聚化等作用的影響。
[0006]目前已知在植物中與脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子主要有:具有AP2結(jié)構(gòu)域的AP2(APETALA2) /EREBP (乙烯應(yīng)答兀件結(jié)合蛋白，ethylene responsive element bindingprotein)轉(zhuǎn)錄因子家族、含有堿性區(qū)域和亮氨酸拉鏈的bZIP (basic region/leucinezipper motif transcription factors)類轉(zhuǎn)錄因子、含有保守的WRKY氨基酸序列的WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族、結(jié)合CCAAT-box的主要核轉(zhuǎn)錄因子的CBF (CCAAT binding factor)類轉(zhuǎn)錄因子、含有堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)和亮氨酸拉鏈的MYC家族和具有色氨酸簇(Trpcluster)的 MYB 家族。
[0007]NF-Y是一類結(jié)合順式作用元件CCAAT-box的轉(zhuǎn)錄因子，特異的識別并結(jié)合許多真核生物組成型、誘導(dǎo)性和細(xì)胞周期依賴性基因的啟動子或增強(qiáng)子中的順式作用元件CCAAT-box,進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控這些基因的表達(dá)。NF-Y是由NF-YA、NF-YB和NF-YC三個(gè)不同亞基組成的雜合三聚體。NF-YB蛋白與NF-YC蛋白通過彼此的HFM保守域，采用頭尾相接的方式形成異源二聚體互作平臺，吸引NF-YA蛋白結(jié)合到這個(gè)二聚體平臺從而形成具有活性的異源三聚體核轉(zhuǎn)錄因子。NF-Y通過NF-YA亞基上的DNA結(jié)合域結(jié)合到靶基因啟動子部分的CCAAT盒，執(zhí)行轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制功能。NF-Y的三個(gè)亞基的保守域分別具有不同的蛋白結(jié)構(gòu)域，其中NF-YA保守域具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNAbinding domain)和與NF-YB/C異源二聚體互作結(jié)構(gòu)域(subunit interaction domain)。NF-YB和NF-YC蛋白保守域則由組蛋白折疊基序(Histone-fold motif)構(gòu)成。其中NF-YB與H2B組蛋白折疊基序相似，而NF-YC與H2A組蛋白折疊基序相似，組蛋白基序由三個(gè)α螺旋和兩個(gè)環(huán)組成，負(fù)責(zé)Η2Α/Η2Β 二聚體的形成。
[0008]由于植物的逆境耐性是由多基因調(diào)控的復(fù)雜性狀，依靠導(dǎo)入單個(gè)功能性蛋白基因很難實(shí)現(xiàn)植物抗逆性的綜合提高。因此，利用一個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)多個(gè)功能基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物的抗逆性，已經(jīng)成為植物抗逆基因工程的研究熱點(diǎn)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是提供一種與植物耐逆性相關(guān)的蛋白質(zhì)。
[0010]本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)是一種結(jié)合CCAAT-box的核轉(zhuǎn)錄因子蛋白，名稱為GmNF_YB6,來源于大豆屬大豆(Glycine max L.),是如下(a)或(b):
[0011](a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0012](b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且與植物耐逆性相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
[0013]序列I的蛋白質(zhì)由122個(gè)氨基酸殘基組成。
[0014]為了使(a)中的GmNF-YB6便于純化，可在由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上`如下表所示的標(biāo)簽。
[0015]表標(biāo)簽的序列
[0016]
標(biāo)簽殘基序列
Poly-Arg5-6 (通常為 5 個(gè))RRRRR
Poly-His2-10 (通常為 6 個(gè)) HHHHHH
FLAG8DYKDDDDK
Strep-tag II8WSHPQFEK
c-myc10EQKLISEEDL
[0017]上述(b)中的GmNF_YB6可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的GmNF-YB6的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上上表所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。
[0018]編碼所述蛋白的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0019]所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA ;所述核酸分子也可以是 RNA，如 mRNA、hnRNA 或 tRNA 等。
[0020]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述核酸分子具體為編碼所述GmNF_YB6蛋白的基因(命名為GmNF-YB6);所述GmNF_YB6基因?yàn)槿缦翴) _4)中任一所述的DNA分子:
[0021]I)編碼序列是序列表中序列2所示的DNA分子；
[0022]2)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0023]3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA分子雜交，且編碼耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子;
[0024]4)與I)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子。
[0025]所述嚴(yán)格條件為在0.1 X SSPE (或0.1XSSC)、0.1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。
[0026]序列2中由369個(gè)核苷酸組成，開放閱讀框架為整個(gè)序列2，編碼序列表中序列I所示的蛋白質(zhì)(GmNF-YB6 )。
[0027]含有所述核酸分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0028]所述重組載體可為重組表達(dá)載體，也可為重組克隆載體。
[0029]可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述核酸分子的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷`酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如小麥貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用所述基因構(gòu)建所述重組表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動子或組成型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動子、玉米的泛素啟動子(Ubiquitin)，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用所述核酸分子構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所述重組表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
[0030]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述重組表達(dá)載體中啟動所述基因轉(zhuǎn)錄的啟動子具體為如下al)或a2):
[0031]al) 35S啟動子，如CaMV 35S啟動子；
[0032]a2) Pmin 啟動子。
[0033]更為具體的,所述重組表達(dá)載體為如下bl)或b2)所述重組質(zhì)粒:
[0034]bl)在pBI121載體的多克隆位點(diǎn)(Sma I和Sac I)之間插入所述GmNF_YB6基因得到的重組質(zhì)粒。[0035]b2)在 YEP-GAP 載體(參考文獻(xiàn) Liu Q, Kasuga M, SakumaY, Abe H, Miura S，Yamaguch1-Shinozaki K，Shinozaki K.Two transcription factors, DREB landDREB2,with an EREBP/AP2DNA binding domain separate two cellular signaltransduction pathways in drought-and low-temperature-responsive geneexpression,respectively, in Arabidopsisj Plant Cell 1998Aug;10 (8):1391-1406)的多克隆位點(diǎn)(BamH I和Xho I)之間插入所述GmNF_YB6基因得到的重組質(zhì)粒。
[0036]所述GmNF_YB6蛋白或所述核酸分子在調(diào)控植物耐逆性中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0037]在本發(fā)明中，所述調(diào)控植物耐逆性具體體現(xiàn)為提高植物的耐逆性。
[0038]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育耐逆性轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0039]該方法包括如下步驟:將所述GmNF-YB6蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏?，得到與所述目的植物相比耐逆性更高的轉(zhuǎn)基因植物。
[0040]在本發(fā)明中，所有所述耐逆性具體可為耐旱性，和/或抗凍性，和/或耐高溫。所述耐旱性，和/或抗凍性，和/或耐高溫的提高具體可體現(xiàn)在植株在相應(yīng)逆境脅迫下存活率的提聞上。
[0041]所述GmNF-YB6蛋白的編碼基因?yàn)槿缦翴) _4)中任一所述的DNA分子:
[0042]I)編碼序列是序列表中序列2所示的DNA分子；
[0043]2)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0044]3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA分子雜交且編碼耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子;
[0045]4)與I)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子。
[0046]所述嚴(yán)格條件為在0.1 X SSPE (或0.1XSSC)、0.1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。
[0047]所述GmNF-YB6基因具體可通過所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物中。攜帶有所述GmNF-YB6基因的所述重組表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化目的植物，如植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。
[0048]所述目的植物既可以是雙子葉植物也可以是單子葉植物。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述植物具體為雙子葉植物擬南芥，如擬南芥品種哥倫比亞生態(tài)型Col-0。
[0049]所述GmNF_YB6蛋白質(zhì)在作為轉(zhuǎn)錄因子中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述轉(zhuǎn)錄因子能與CCAAT順式作用元件結(jié)合，且具有激活功能。
[0050]本發(fā)明所提供的GmNF-YB6可以在低溫、干旱和高溫的誘導(dǎo)性下表達(dá)，可以特異的調(diào)控含有CCAAT-box順式元件(核心元件CCAAT)的基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，可以提高植物的耐旱性、抗凍性和耐高溫能力。本發(fā)明的GmNF-YB6為人為控制抗逆和耐逆相關(guān)基因的表達(dá)提供了基礎(chǔ)，將在抗逆性和耐逆性增強(qiáng)的植物育種中發(fā)揮重要的作用。
【專利附圖】

【附圖說明】[0051]圖1為GmNF_YB6受脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的熒光實(shí)時(shí)定量(Real-time) PCR圖譜。
[0052]圖2為重組表達(dá)載體pBI121-GmNF-YB6的質(zhì)粒圖譜。。
[0053]圖3為T3代轉(zhuǎn)GmNF-YB6基因擬南芥中的GmNF_YB6基因的cDNA水平檢測結(jié)果。其中，泳道 M 為 Marker (條帶自上而下依次為 2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，IOObp);泳道col為哥倫比亞生態(tài)型擬南芥植物；泳道1-4分別為4個(gè)待鑒定轉(zhuǎn)GmNF-YB6基因擬南芥植株。
[0054]圖4為T3代轉(zhuǎn)GmNF_YB6基因擬南芥和野生型擬南芥耐旱性比較。其中，A為干旱處理前；B為干旱處理14天后；C為復(fù)水3天后。TL表示T3代轉(zhuǎn)GmNF-YB6基因擬南芥。
[0055]圖5為T3代轉(zhuǎn)GmNF_YB6基因擬南芥和野生型擬南芥抗凍性比較。其中，A為低溫處理前；B為低溫處理恢復(fù)3天后。TL表示T3代轉(zhuǎn)GmNF-YB6基因擬南芥。
[0056]圖6為T3代轉(zhuǎn)GmNF_YB6基因擬南芥和野生型擬南芥耐高溫比較。其中，A為高溫處理前；B為高溫處理恢復(fù)3天后。TL表示T3代轉(zhuǎn)GmNF-YB6基因擬南芥。
【具體實(shí)施方式】
[0057]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0058]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0059]實(shí)施例1、GmNF_YB6的克隆
[0060]一、mRNA 的分離
[0061]將水培的生長10天左右的大豆`(Glycine max L.)品種鐵豐8號(參考文獻(xiàn):孫嘯，董建輝，陳明，徐兆師，葉興國，李連城，曲延英，馬有志.2008.大豆抗逆基因GmDREB3啟動子的克隆及調(diào)控區(qū)段分析.作物學(xué)報(bào)，34(8): 14751479)四葉期幼苗干旱處理2小時(shí)，用液氮速凍，_80°C保存?zhèn)溆?。米?Quikprep Micro mRNA Purification Kit(Pharmacia)進(jìn)行mRNA的分離。第一鏈cDNA合成用反轉(zhuǎn)錄酶XL (AMV)0采用SMART法合成ds cDNA，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0062]二、GmNF-YB6基因全長序列的獲得
[0063]通過5’ RACE和3’ RACE的方法獲得大豆CCAAT-box的核轉(zhuǎn)錄因子B族基因全長序列。
[0064]該基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示，將該基因命名為GmNF_YB6基因，其開放閱讀框?yàn)樾蛄?整個(gè)序列。GmNF-YB6基因編碼序列表中序列I所示的蛋白質(zhì)(命名為GmNF-YB6蛋白)，GmNF-YB6蛋白由122個(gè)氨基酸殘基組成，具有保守的組蛋白折疊基序。
[0065]實(shí)施例2、實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析GmNF_YB6的表達(dá)特性
[0066]一、脅迫處理
[0067]苗齡為10天的大豆品種鐵豐8號幼苗，進(jìn)行以下處理:
[0068](I)干旱處理:將盆栽的大豆幼苗取出吸干根上的水分，置于干燥的濾紙上，干旱培養(yǎng)30分鐘、I小時(shí)、2小時(shí)、5小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)后取出材料，用液氮速凍，_80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0069](2)低溫處理:將大丑幼苗置于4°C培養(yǎng)箱,光照培養(yǎng)30分鐘、I小時(shí)、2小時(shí)、5小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)后取出并用液氮速凍，_80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0070](3)高溫處理:將大豆幼苗置于42°C下，光照培養(yǎng)30分鐘、I小時(shí)、2小時(shí)、5小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)后分別取出并用液氮速凍，-80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0071](4)對照的處理:直接取未經(jīng)任何處理的大豆幼苗_80°C凍存作為對照(O小時(shí))。
[0072]二、mRNA 的分離
[0073]米用Quikprep Micro mRNA Purification Kit (Pharmacia)對步驟一得到的各樣品進(jìn)行mRNA的分離。
[0074]三、反轉(zhuǎn)錄為cDNA
[0075]將步驟二得到的純化后mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0076]四、實(shí)時(shí)熒光定量PCR
[0077]將cDNA稀釋50倍后用作Q-RT-PCR的模板。用基因3'端非編碼區(qū)的特異引物對對樣品進(jìn)行Q-RT-PCR擴(kuò)增，分析基因?qū)Σ襟E一中各種處理的應(yīng)答情況，以Actin做內(nèi)參。Q-RT-PCR在ABi PRISM7000實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，一次平行試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。利用Livak KJ和Schmittgen TD (2001)報(bào)道的方法，即2_Δ Δετ計(jì)算相對表達(dá)量。
[0078]Δ Δ Ct- (CT.GmNF_YB6 — Ct Actin) Timex — (CT.GmNF_YB6 — CT.Actin) Time 0
[0079]Time x表示任意時(shí)間點(diǎn)，Time ^表示經(jīng)Actin校正后I倍量的目標(biāo)基因(GmNF-YB6 )表達(dá)所對應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)。
[0080]結(jié)果見圖1。
[0081 ] 實(shí)施例3、GmNF-YB6的激活特性
[0082]YEP-GAP載體:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究保證向公眾提供；參考文獻(xiàn)Liu Q， Kasuga M， Sakuma Y， Abe H， Miura S， Yamaguch1-Shinozaki K， ShinozakiK.Two transcription factors, DREB land DREB2,with an EREBP/AP2DNA bindingdomain separate two cellular signal transduction pathways in drought—andlow-temperature-responsive gene expression,respectively, in Arabidopsisj PlantCell 1998Aug;10(8):1391-1406。
[0083]YPD液體培養(yǎng)基:細(xì)菌培養(yǎng)用酵母抽提物(Bacto-Yeast Extract) 10g/L，細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨(Bacto-Peptone) 20g/L，調(diào)節(jié)pH至5.8，121°C /15min滅菌，降至60°C以后加入40%的Glucose，使其終濃度為20g/L。
[0084]SD/His—/Ura—/Trp—選擇性培養(yǎng)基:不含氨基酸的酵母氮源(Yeast nitrogenbase) 6.7g/L，營養(yǎng)缺陷型混合物(drop-out media without His/Ura/Trp) 100ml，瓊脂粉(Bacteriological agar)20g/L，調(diào)節(jié) pH 至 5.8，121°C /15min 滅菌，降至 60°C后加入 40%Glucose，使其終濃度為20g/L。
[0085]營養(yǎng)缺陷型混合物(drop-outmix): (10X ):L-1soleucine (異亮氨酸)300mg/L，L-Valine (纟頓氨酸)1500mg/L，L-Adenine (腺票呤)200mg/L，L-Arginine (精氨酸)200mg/L, L-Leucine (亮氨酸)1000mg/L，L-Lysine HCl (賴氨酸)300mg/L，L-Methionine (甲硫氛酸)200mg/L，L-Phenylalanine (苯丙氛酸)500mg/L，L-Threonine (蘇氛酸)2000mg/L,L-Tyrosine (酪氨酸)300mg/Lo
[0086]lXPEG/LiAc:50% (w/v) PEG33508ml, IOXTE buffer lml, IOXLiAc 1ml。
[0087]IOXTE Buffer:IOOmM Tris-HCl，IOmM EDTA，pH=7.5，121t:高壓滅菌，室溫保存。
[0088]ΙΧΤΕ/LiAc: 10 X TE buffer 1ml，IOXLiAc 1ml，ddH20 8ml。
[0089]Z 溶液:Na2HPO4.7H20 16.lg/L，NaH2PO4.H2O 5.5g/L，KCl 0.75g/L，MgSO4.7Η200.246g/L，調(diào)節(jié) pH 至 7.0,121°C /15min 滅菌，4°C保存。
[0090]X-gal 儲存液(X-gal Stock Solution):用 N, N-dimethyl-formamide (DMF)溶解X-gal，使其終濃度為20mg/ml，-20°C貯存。
[0091]含有X-gal 的 Z 緩沖液 100ml (Z buffer with X-gal),現(xiàn)用現(xiàn)配:Z 溶液 98ml,β _ 疏基乙醇(β -mercaptoethanol) 0.27ml, X-gal 儲存液(X-gal stock solution)
1.67ml。
[0092]IOXLiAc:IOOMm Tris-HCl, IOOmM EDTA, pH=7.5。121°C高壓滅菌、室溫保存。
[0093]用酵母單雜交系統(tǒng)證明轉(zhuǎn)錄因子的激活特性的主要原理:將CCAAT順式作用元件和突變體CCAAT順式作用元件分別構(gòu)建到pHIS1-Ι載體和pLacZi載體的基本啟動子Pmin(minimal promoter)上游，Pmin啟動子下游連接報(bào)道基因(His3、LacZ和URA3)。當(dāng)連接有編碼轉(zhuǎn)錄因子的目的基因的表達(dá)載體YEP-GAP (不含激活功能)分別轉(zhuǎn)化到連有CCAAT順式作用元件和突變體CCAAT順式作用元件的酵母細(xì)胞后，如果連有突變體CCAAT順式作用元件的酵母細(xì)胞中的報(bào)道基因不能表達(dá)，而連有特定的CCAAT順式作用元件的酵母細(xì)胞中的報(bào)道基因能夠表達(dá)，說明該轉(zhuǎn)錄因子能與CCAAT順式作用元件結(jié)合，且具有激活功能，激活了 Pmin啟動子，促使報(bào)道基因表達(dá)。從而證明了目的轉(zhuǎn)錄因子的體內(nèi)結(jié)合特異性和激活功能。
[0094]以下將詳述檢測GmNF-YB6蛋白是否具有激活特性。具體操作如下:
[0095]一、重組表達(dá)載體YEP-GAP-GmNF_YB6的構(gòu)建
[0096]1、GmNF-YB6 基因的獲得
`[0097]根據(jù)GmNF-YB6基因的序列設(shè)計(jì)弓丨物GmNF_YB6和GmNF-YB6_XI，弓丨物末端分別弓丨入BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)，以大豆品種鐵豐8號(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所)的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得GmNF-YB6基因。
[0098]GmNF~YB6:5’ -TTTGGATCCATGGATAACGTTGGAG-3’ (下劃線部分的序列為 BamH I 酶切位點(diǎn)的識別序列，其后的序列對應(yīng)序列2的第1-16位)；
[0099]GmNF-YB6-X1:5’ -GGTCTCGAGTTATCCTCTTTTGGGGGGG-3’ (下劃線部分的序列為 XhoI酶切位點(diǎn)的識別序列，其后的序列對應(yīng)序列2的后19位的反向互補(bǔ)序列)。
[0100]PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0101]米用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 (TaKaRa 公司，CodeN0.:DV807A)回收純化387bp左右的PCR產(chǎn)物。
[0102]2、重組表達(dá)載體YEP-GAP-GmNF-YB6的構(gòu)建
[0103]①用限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I酶切步驟I回收純化的PCR產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物；
[0104]②用限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I酶切表達(dá)載體YEP-GAP，回收載體骨架；
[0105]③將步驟①的酶切產(chǎn)物和步驟②的載體骨架連接；
[0106]④將步驟③的連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化JM109菌株(Clontech公司)，37°C過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆進(jìn)行測序；測序結(jié)果表明，得到的陽性重組質(zhì)粒在YEP-GAP的BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列2所示的DNA片段，將該重組質(zhì)粒命名為YEP-GAP-GmNF-YB60重組表達(dá)載體YEP-GAP-GmNF_YB6中啟動GmNF_YB6基因轉(zhuǎn)錄的啟動子為Pmin啟動子。[0107]二、GmNF-YB6的體內(nèi)結(jié)合特異性和激活特性的驗(yàn)證
[0108]1、酵母報(bào)道子的構(gòu)建
[0109](I)正常雙重酵母報(bào)道子的構(gòu)建
[0110]DNA 片段 A (含 4 個(gè) CCAAT 元件:TTTAACCAATCAGAAA):
[0111]5’ -GAATTC-CCAAT-CCAAT-CCAAT-CCAAT-GTCGAC-3’(CCAAT 的核心序列:CCAAT)。DNA片段A的核苷酸序列見序列表的序列3。[0112]以上述DNA片段A為模板，以Al和Al-XI組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將得到的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Xho I和Nco I雙酶切，與經(jīng)同樣雙酶切的pHis-Ι載體(MATCHMAKER One-Hybrid System,Clontech公司)大片段相連,將得到的重組質(zhì)粒測序,將測序表明含有序列表中序列3所示的DNA序列的重組載體命名為pHis-1-CCAAT。在重組載體pHis-1-CCAAT中，所述DNA片段A位于Pmin啟動子上游。用Xho I和Nco I內(nèi)切酶將重組載體pHi s-1-CCAAT切成線狀。
[0113]A 1:5，-CCGCTCGAGGA ATTCTTTA ACCA ATCAGA-3’(下劃線處為 Xho I 的識別位點(diǎn)，其后的序列為序列3的前20位)；
[0114]Al-X1:5’ -CATGCCATGGGTCGACTTTCTGATTGGTT-3’(下劃線處為 Nco I 的識別位點(diǎn)，其后的序列為序列3的后19位的反向互補(bǔ)序列)
[0115]先將線狀pHi s-1-CCAAT載體轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞(YM4271株系，MATCHMAKEROne-Hybrid System, Clontech公司)內(nèi)，獲得能在SD/His_培養(yǎng)基上正常生長的酵母轉(zhuǎn)化子(Yeast transformant)。接著以這種酵母轉(zhuǎn)化子為寄主細(xì)胞，繼續(xù)轉(zhuǎn)化含線狀pLacZ1-CCAAT載體。這樣在同時(shí)缺乏組氨酸和尿嘧啶的SD/His_/Ura_培養(yǎng)基上，選擇獲得含有pHis-1-CCAAT和pLacZ1-CCAAT的正常雙重酵母報(bào)道子。
[0116](2)突變體雙重酵母報(bào)道子的構(gòu)建
[0117]DNA 片段 B (含 4 個(gè) mCCAAT 元件):
[0118]5，-GAATTC-mCCAAT-mCCAAT-mCCAAT-mCCAAT-GTCGAC-3，(MDRE:將 4 個(gè) CCAAT 元件的核心序列CCAAT突變成TTTTA)。DNA片段B的核苷酸序列見序列表的序列4
[0119]用DNA片段B代替DNA片段A，方法同步驟(I )，得到突變體雙重酵母報(bào)道子。
[0120]2、PEG/LiAc法轉(zhuǎn)化酵母及結(jié)果分析
[0121](I)接種酵母菌YM4271株系到Iml YH)液體培養(yǎng)基中，劇烈震蕩2分鐘，分散團(tuán)塊后將懸浮液轉(zhuǎn)至含有50ml YI3D液體培養(yǎng)基的三角瓶中，30°C /250rpm搖過夜，測0D600=1.7-1.8 (約 4X107 個(gè)/mL)。
[0122](2)取30ml步驟(1)過夜培養(yǎng)物接到300ml新鮮的YPD培養(yǎng)基中，30°C /250rpm培養(yǎng)，約3小時(shí)(至0D600=0.5±0.1)，室溫1000g離心5min，收集菌體，棄上清，用1/2體積I X TE 懸浮，1000g/5min 離心。
[0123](3)吸棄上清，用1.5ml新鮮配制的ΙΧΤΕ/LiAc溶液懸浮，振蕩混勻備用。
[0124](4)取出0.1ml酵母感受態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，依次加下列溶液:0.1 μ g步驟一制備的YEP-GAP-GmNF-YB6、0.1mg ssDNA (鮭魚精 DNA，SiTaa),0.6ml PEG/LiAc 高速振蕩 I 分鐘，30 0C /200rpm振蕩培養(yǎng)30分鐘。
[0125](5)加入70 μ I DMS0，輕輕倒置混勻，42°C熱激30分鐘，其間輕輕振蕩，冰浴2分鐘，室溫1000g離心5min。[0126](6)吸棄上清，加入0.5ml I XTE buffer懸浮細(xì)胞。
[0127](7)用接種環(huán)蘸取懸浮液，分別在含有0、15mmol/L 3-AT的SD/His7Ura_/Trp_選擇性培養(yǎng)基上畫線培養(yǎng)。
[0128](8)平板的一半培養(yǎng)正常雙重酵母報(bào)道子，另一半培養(yǎng)突變體雙重酵母報(bào)道子，以便做對照分析。
[0129](9)顛倒放置于培養(yǎng)箱中，30°C培養(yǎng)3-4天。
[0130](10)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Ommol/L 3-AT的SD/His7Ura7Trp_的培養(yǎng)基平板上正常的酵母報(bào)道子和突變的酵母報(bào)道子都有生長，但突變的酵母報(bào)道子的直徑明顯??；而在15mmol/L3-AT的SD/HiS_/Ura7Trp_的培養(yǎng)基平板上正常的酵母報(bào)道子能正常生長，但突變的酵母報(bào)道子被抑止沒有生長。
[0131]3、半乳糖苷酶活性檢測
[0132](I)從Ommol/L 3-AT的SD/HiS_/Ura7Trp_的培養(yǎng)基平板上分別挑取正常的酵母報(bào)道子和突變的酵母報(bào)道子菌落。轉(zhuǎn)至YPD液體培養(yǎng)基中，于30°C振蕩培養(yǎng)，待長至對數(shù)生長后期，取1.5ml菌液,3000rpm離心30s。
[0133](2)棄上清，控干管中液體，將離心管置于液氮中速凍lOmin，取出使其自然融解，加50μ1 z/x-gal溶液(Z buffer with X_gal )，30°C溫育，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常的酵母報(bào)道子在6-8h內(nèi)變藍(lán)，而突變的酵母報(bào)道子在12h內(nèi)沒有變化，仍為白色。這說明轉(zhuǎn)錄因子GmNF-YB6能與CCAAT順式作用元件結(jié)合，且具有激活功能，激活了 Pmin啟動子，促使報(bào)道基因表達(dá)。從而證明了 GmNF-YB6的體內(nèi)結(jié)合特異性和激活功能。
[0134]實(shí)施例4、GmNF-YB6提高植物的抗旱性與抗凍性的檢測
[0135]一、重組表達(dá)載體pBI121-GmNF_YB6的構(gòu)建
[0136].1、GmNF-YB6 基因的克隆
[0137]根據(jù)GmNF-YB6基因的序列設(shè)計(jì)引物對(GmNF-YB6_121F和GmNF-YB6_121R)，引物末端分別引入Sma I和Sac I酶切識別位點(diǎn)，以大豆屬大豆(Glycine max L.)品種鐵豐8號的cDNA為模板PCR擴(kuò)增GmNF-YB6基因。
[0138]GmNF-YB6~121F:5’ -TCCCCCGGGATGGATAACGTTGGAG-3"(劃線部分為 Sma I 的識別位點(diǎn)序列，其后的序列為序列2的前16位)；
[0139]GmNF-YB6~121R:5’ -CGAGCTCTTATCCTCTTTTGGGGGGG-3’ (劃線部分為 SacI 的識別位點(diǎn)序列，其后的序列為序列2的后19位的反向互補(bǔ)序列)。
[0140]PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳,采用Agarose Gel DNA PurificationKit Ver.2.0 (TaKaRa 公司,Code N0.:DV807A)回收純化 385bp 左右的條帶。
[0141].2、重組表達(dá)載體pBI121-GmNF-YB6的構(gòu)建
[0142]①用限制性內(nèi)切酶Sma I和Sac I酶切步驟I回收純化的PCR產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物；
[0143]②用限制性內(nèi)切酶Sma I和Sac I酶切pBI121(Clontech公司)，回收載體骨架；
[0144]③將步驟①的酶切產(chǎn)物和步驟②的載體骨架連接；
[0145]④將步驟③的連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化T0P10菌株(購自北京天根公司)，37°C過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆進(jìn)行測序；測序結(jié)果表明，得到的陽性重組質(zhì)粒在PBI121的Sma I和SacI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列2所示的DNA片段。將該重組質(zhì)粒命名為pBI121-GmNF-YB6(質(zhì)粒圖譜如圖2所示)。重組表達(dá)載體pBI121-GmNF_YB6中啟動GmNF_YB6基因轉(zhuǎn)錄的啟動子為CaMV 35S啟動子。
[0146]二、轉(zhuǎn)GmNF_YB6基因植物的獲得
[0147]1、用步驟一構(gòu)建的重組表達(dá)載體pBI121-GmNF-YB6轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌C58C1 (北京拜爾迪生物技術(shù)公司)，得到重組農(nóng)桿菌。具體操作如下:
[0148]取20 μ I農(nóng)桿菌C58C1的感受態(tài)細(xì)胞，加入1μ I步驟一構(gòu)建的重組表達(dá)載體pBI121-GmNF-YB6混勻，電擊轉(zhuǎn)化，加入Iml YEB液體培養(yǎng)基28°C /180rpm恢復(fù)培養(yǎng)3h，取200 μ I 涂 YEB 抗性平板(Kan 50mg/L, Rif50mg/L, Gen 50mg/L) 28°C培養(yǎng) 2 ~3d。之后以GmNF-YB6-121F和GmNF-YB6_121R所組成的引物對，進(jìn)行菌液PCR鑒定。將經(jīng)菌液PCR鑒定表明含有GmNF-YB6基因(大小約為385bp的目的條帶)的農(nóng)桿菌陽性克隆進(jìn)行測序分析。將經(jīng)測序表明轉(zhuǎn)入pBI121-GmNF-YB6的農(nóng)桿菌命名為pBI121-GmNF_YB6/C58Cl。同時(shí)設(shè)置轉(zhuǎn)入PBI121空載體的農(nóng)桿菌，將其命名為PBI121/C58C1。
[0149]2、將步驟I得到的兩種重組農(nóng)桿菌接種于LB (含50mg/ml利福平，100mg/ml卡那霉素，50mg/ml慶大霉素)液體培養(yǎng)基中，28°C、3000rpm培養(yǎng)約30小時(shí)。
[0150]3、將步驟2的菌液轉(zhuǎn)移至LB (含50mg/ml利福平，100mg/ml卡那霉素，50mg/ml慶大霉素)中，28°C、300rpm培養(yǎng)約14小時(shí)(菌液0D600達(dá)到1.5-3.0)。
[0151]4、收集菌體，4°C、4000g離心lOmin，用含10%蔗糖MS液體培養(yǎng)基(含0.02%( v/v)的 silwet77)稀釋至 0D600 約為 0.8-1.0。
[0152]5、將擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型Col-0，SALK公司)整株與花盆一起倒扣在盛有步驟4的菌液的容器中，使花浸泡50s左右，浸泡完畢后，取出花盆，側(cè)放于托盤中，蓋上黑色塑料布，24h后揭開塑料布，直立放置花盆，`進(jìn)行正常的光照培養(yǎng)，收獲T1代種子，卡那霉素篩選(濃度為50 μ g/L卡那霉素)陽性植株。T2代表示T1代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株，T3代表示T2代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株。將T3代植株進(jìn)行DNA和cDNA水平鑒定(DNA水平和cDNA水平鑒定的引物對均如下F和R，預(yù)期條帶為369bp)，cDNA水平鑒定部分樣本的結(jié)果見圖3。將經(jīng)鑒定表明含有GmNF-YB6基因的陽性植株(DNA和cDNA水平檢測均為陽性的植株)命名為pBI121-GmNF-YB6/Col-0。
[0153]F:5’ -ATGGATAACGTTGGAG-3’(序列 2 的前 16 位)；
[0154]R:5’ -TTATCCTCTTTTGGGGGGG-3’(序列 2 的后 19 位的反向互補(bǔ)序列)；
[0155]三、轉(zhuǎn)空載體對照植物的獲得
[0156]用重組農(nóng)桿菌PBI121/C58C1轉(zhuǎn)化擬南芥Col-Ο，得到轉(zhuǎn)入pBI121空載體的對照植株，命名為pBI121/Col-0。具體轉(zhuǎn)化方法同步驟二。
[0157]四、轉(zhuǎn)GmNF_YB6基因植物的耐旱性鑒定、抗凍性和耐高溫性鑒定
[0158]1.轉(zhuǎn)GmNF_YB6基因植物的耐旱性鑒定
[0159]分別將經(jīng)步驟二鑒定為陽性(DNA水平和cDNA水平鑒定均為陽性)的T3代轉(zhuǎn)基因植株pBI121-GmNF-YB6/Col-0 (TL)、T3代轉(zhuǎn)空載體對照植株pBI121/Col_0 (CK)和擬南芥Col-O (WT)(各60株)進(jìn)行耐旱性檢測。設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0160]將正常生長的萌發(fā)15天的幼苗不澆水，直至野生型植株Col-O枯萎(2周左右)，然后復(fù)水一周，觀察表型、拍照并統(tǒng)計(jì)存活率。
[0161]結(jié)果如圖4 和表 I 所示，轉(zhuǎn) GmNF-YB6 基因植株 pBI121-GmNF_YB6/Col-0 有 90.6%存活且能正常生長；而野生型擬南芥Col-O的存活率僅為23.2%，且生長狀態(tài)欠佳，轉(zhuǎn)空載體對照植株pBI121/Col-0的表型與擬南芥Col-O —致，存活率與擬南芥Col-O沒有顯著差
巳升。
[0162]表1T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株耐旱性鑒定的存活率統(tǒng)計(jì)結(jié)果
[0163]
【權(quán)利要求】
1.蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且與植物耐逆性相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的核酸分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸分子，其特征在于:所述核酸分子為編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的基因，所述基因?yàn)槿缦翴)或2)或3)或4)的DNA分子: 1)編碼序列是序列表中序列2所不的DNA分子； 2)序列表中序列2所示的DNA分子； 3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA分子雜交且編碼耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子； 4)與I)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述核酸分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于:所述重組載體為重組表達(dá)載體或重組克隆載體；所述重組表達(dá)載體中啟動所述基因轉(zhuǎn)錄的啟動子為如下al)或a2): al) 35S啟動子； a2) Pmin啟動子。`
6.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)，或權(quán)利要求2或3所述核酸分子在調(diào)控植物耐逆性中的應(yīng)用。
7.培育耐逆性轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟:將編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的基因?qū)肽康闹参镏?，得到與所述目的植物相比耐逆性更高的轉(zhuǎn)基因植物。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用或權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于:所述耐逆性為耐旱性，和/或抗凍性，和/或耐高溫。
9.根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一所述的應(yīng)用或方法，其特征在于:所述植物為雙子葉植物或單子葉植物。
10.權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)在作為轉(zhuǎn)錄因子中的應(yīng)用。
【文檔編號】A01H5/00GK103509096SQ201210217950
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年6月27日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月27日
【發(fā)明者】徐兆師, 馬有志, 鄭煒君, 李連城, 陳明 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所