專利名稱：一株對(duì)石斛屬植物軟腐病有防治作用的內(nèi)生真菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及2株對(duì)石斛屬植物軟腐病具有生物防治效果的內(nèi)生真菌菌株。將這兩株真菌用于石斛屬植物的育苗或栽培中，能夠有效地防治石斛屬植物軟腐病的發(fā)生。
背景技術(shù)：
蘭科植物中有很多傳統(tǒng)名貴的中藥材，比如鐵皮石斛和金釵石斛等。根據(jù)2005版《中國(guó)藥典》的記載，金釵石斛(Dendrobium nobile LindL.)、鐵皮石斛(D. candidum Wall,ex Lindl.)或馬鞭石斛(D. fimbriatum Hook,var. oculatum Hook.)及其近似種的新鮮或干燥莖可以做中藥石斛使用，具有益胃生津、滋陰清熱的功效，還能利咽明目，調(diào)節(jié)人體免疫功能。進(jìn)入21世紀(jì)以來，特別是隨著石斛夜光丸、脈絡(luò)寧注射液等以石斛為主要原料的中成藥的相繼問世，中藥石斛的用量大增，野生石斛資源面臨巨大的再生壓力。由于生態(tài)環(huán)境日益惡化，以及對(duì)自然資源的過度開采，鐵皮石斛、霍山石斛等石斛屬植物中的名貴品種已瀕臨滅絕。人工繁育結(jié)合大面積人工栽培是一條保護(hù)石斛屬植物資源，保證石斛藥材市場(chǎng)供應(yīng)的重要途徑。但是，隨著各種石斛屬植物人工栽培面積的擴(kuò)大，植物病害的發(fā)生也日趨嚴(yán)重，這ー現(xiàn)象已經(jīng)引起了普遍的關(guān)注。軟腐病是ー種在石斛屬植物栽培中經(jīng)常發(fā)生的病害，從假鱗莖處感病時(shí)，發(fā)病部位出現(xiàn)水潰狀病斑，褐色至黒色，最終使假鱗莖變得柔軟皺縮和暗色，迅速腐爛。病害嚴(yán)重時(shí)，軟腐病可以造成栽培作物的大面積絕收，嚴(yán)重制約了石斛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前對(duì)石斛屬植物軟腐病的防治主要有兩種方式一是通過栽培管理，如控制苗床的濕度，通風(fēng)換氣，水源的消毒，栽培基質(zhì)的陽(yáng)光暴曬處理等，能對(duì)病害的防治起到一定的作用，但這類方式費(fèi)エ費(fèi)時(shí)，操作技術(shù)缺乏規(guī)范，可操控性差，對(duì)病害的防治效率不高；另ー種是通過大量、頻繁地使用農(nóng)藥，雖然短期內(nèi)能產(chǎn)生較好的防治效果，但容易造成病原菌產(chǎn)生耐藥性，且農(nóng)藥的大量使用對(duì)環(huán)境的污染和生態(tài)平衡的破壞作用很大。近年來，用生物防治的方法來預(yù)防和處理植物病害的發(fā)生、發(fā)展越來越引起人們的關(guān)注。這類方法最顯著的優(yōu)點(diǎn)是安全、環(huán)保、成本低廉，可以大量減少農(nóng)藥的使用。因此，研究高效安全且經(jīng)濟(jì)實(shí)用的石斛屬植物軟腐病的防治方法就顯得很有必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供兩株對(duì)石斛屬植物軟腐病具有生物防治效果的內(nèi)生真菌。將它們應(yīng)用于石斛屬植物的人工栽培，能夠降低軟腐病的發(fā)病率，提高石斛的產(chǎn)量，緩解中藥石斛市場(chǎng)供應(yīng)的緊張狀況。本發(fā)明提供的2株內(nèi)生真菌經(jīng)鑒定分別為菌株Dhs96為根霉(Rhizopus sp.),保藏編號(hào)為CGMCC No. 3786，菌株Dfl88為木霉(Trichoderma sp.)，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 3787。這2株真菌于2010年4月28日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏單位地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。2株真菌的保藏和存活證明見附件。兩株真菌的培養(yǎng)特性分別為Dhs96 :在PDA培養(yǎng)基上菌落為黃棕色，圓形，絨氈狀，菌絲致密，背面黃褐色，有假根形成；氣生菌絲較發(fā)達(dá)，25°C生長(zhǎng)10天的菌落直徑為6. 5cm ;常規(guī)培養(yǎng)基上不產(chǎn)生孢子。Dfl88 :在PDA培養(yǎng)基上菌落圓形，初期菌落白色，后期正面和背面均為淺黃色，菌絲較稀疏，絨氈狀；氣生菌絲發(fā)達(dá)，25°C生長(zhǎng)36小時(shí)菌落直徑9cm ;分生孢子梗從菌絲的側(cè)枝上生出，直立，分枝，頂端不膨大，上著生分生孢子團(tuán)，含有孢子4 12個(gè)；分生孢子球形至卵形，淺色，2. 8 4. 5X2. 2 3. 9 iim。
上述兩株內(nèi)生真菌菌株能在石斛屬植物的根部定植，對(duì)植物沒有致病性，對(duì)育苗階段及田間栽培的多種石斛屬植物的軟腐病有防治作用，具有良好的應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例IDhs96對(duì)金釵石斛軟腐病的生物防治內(nèi)生真菌Dhs96經(jīng)PDA液體發(fā)酵培養(yǎng)后與麥麩固體基質(zhì)混合均勻制成固體接種劑。石斛軟腐病病原菌終極腐霉(Pythium ultimum)經(jīng)活化培養(yǎng)后收集孢子,配制成5XlOVml的孢子懸浮液，與麥麩固體基質(zhì)混合均勻制成固體接種劑。以樹皮作為栽培基質(zhì)，在栽種金釵石斛苗時(shí)，把Dhs96固體接種劑接種到金釵石斛苗的根部。盆栽苗放入日光溫室中，溫度維持在20±2°C。栽種后噴水，以利于內(nèi)生真菌的生長(zhǎng)。以后每三天噴水一次。分別于接種真菌Dhs96后的3天和30天時(shí)在金釵石斛苗的周圍撒病原菌固體接種劑。陰性對(duì)照為只在栽種時(shí)接入麥麩固體基質(zhì)的金釵石斛苗；陽(yáng)性對(duì)照為在栽種時(shí)接入麥麩固體基質(zhì)，并分別于栽種后的3天和30天時(shí)在金釵石斛苗周圍撒病原菌固體接種劑。分別于接入病原菌兩個(gè)月后統(tǒng)計(jì)苗的存活率。兩種接種處理，苗的平均存活率達(dá)到78. 6%，陰性對(duì)照中苗的存活率為56. 7%，陽(yáng)性對(duì)照中沒有苗存活。這ー結(jié)果表明感染軟腐病病原菌后，內(nèi)生真菌Dhs96能提高金釵石斛苗的存活率。實(shí)施例2Dhs96對(duì)鐵皮石斛苗軟腐病的生物防治內(nèi)生真菌Dhs96經(jīng)PDA液體發(fā)酵培養(yǎng)后與麥麩固體基質(zhì)混合均勻制成固體接種劑。石斛軟腐病病原菌終極腐霉(Pythium ultimum)經(jīng)活化培養(yǎng)后收集孢子,配制成IXlOVml的孢子懸浮液，與麥麩固體基質(zhì)混合均勻制成固體接種劑。以樹皮作為栽培基質(zhì)，在栽種鐵皮石斛苗時(shí)，把Dhs96固體接種劑接種到鐵皮石斛苗的根部。盆栽苗放入日光溫室中，溫度維持在20±2°C。栽種后噴水，以利于內(nèi)生真菌的生長(zhǎng)。以后每三天噴水一次。分別于接種真菌Dhs96后的3天和30天時(shí)在鐵皮石斛苗的周圍撒病原菌固體接種劑。陰性對(duì)照為只在栽種時(shí)接入麥麩固體基質(zhì)的鐵皮石斛苗；陽(yáng)性對(duì)照為在栽種時(shí)接入麥麩固體基質(zhì)，并分別于栽種后的3天和30天時(shí)在鐵皮石斛苗周圍撒病原菌固體接種劑。分別于接入病原菌兩個(gè)月后統(tǒng)計(jì)苗的存活率。兩種接種處理，苗的平均存活率達(dá)到66. 7%，陰性對(duì)照中苗的存活率為43. 3%，陽(yáng)性對(duì)照中沒有苗存活。這ー結(jié)果表明感染軟腐病病原菌后，內(nèi)生真菌Dhs96能提高鐵皮石斛苗的存活率。
實(shí)施例3Dhs96對(duì)鼓槌石斛苗軟腐病的生物防治內(nèi)生真菌Dhs96經(jīng)PDA液體發(fā)酵培養(yǎng)后與麥麩固體基質(zhì)混合均勻制成固體接種劑。石斛軟腐病病原菌終極腐霉(Pythium ultimum)經(jīng)活化培養(yǎng)后收集孢子,配制成5XlOVml的孢子懸浮液，與麥麩固體基質(zhì)混合均勻制成固體接種劑。以樹皮作為栽培基質(zhì)，在栽種鼓槌石斛苗時(shí)，把Dhs96固體接種劑接種到鼓槌石斛苗的根部。盆栽苗放入日光溫室中，溫度維持在20±2°C。栽種后噴水，以利于內(nèi)生真菌的生長(zhǎng)。以后每三天噴水一次。分別于接種真菌Dhs96后的3天和30天時(shí)在鼓槌石斛苗的周圍撒病原菌固體接種劑。陰性對(duì)照為只在栽種時(shí)接入麥麩固體基質(zhì)的鼓槌石斛苗；陽(yáng)性對(duì)照為在栽種時(shí)接入麥麩固體基質(zhì)，井分別于移栽后的3天和30天時(shí)在鼓槌石斛苗周圍撒病原菌固體接種劑。分別于接入病原菌兩個(gè)月后統(tǒng)計(jì)苗的存活率。兩種接種處理，苗的平均 存活率達(dá)到59. 5%，陰性對(duì)照中苗的存活率為47. 3%，陽(yáng)性對(duì)照中沒有苗存活。這ー結(jié)果表明感染軟腐病病原菌后，內(nèi)生真菌Dhs96能提高鼓槌石斛苗的存活率。實(shí)施例4Dhs96對(duì)齒瓣石斛苗軟腐病的生物防治內(nèi)生真菌Dhs96經(jīng)PDA液體發(fā)酵培養(yǎng)后與麥麩固體基質(zhì)混合均勻制成固體接種劑。石斛軟腐病病原菌終極腐霉(Pythium ultimum)經(jīng)活化培養(yǎng)后收集孢子,配制成5X 105/ml的孢子懸浮液，與麥麩固體基質(zhì)混合均勻制成固體接種劑。以樹皮作為栽培基質(zhì)，在栽種齒瓣石斛苗時(shí)，把Dhs96固體接種劑接種到齒瓣石斛苗的根部。盆栽苗放入日光溫室中，溫度維持在20±2°C。栽種后噴水，以利于內(nèi)生真菌的生長(zhǎng)。以后每三天噴水一次。分別于接種真菌Dhs96后的3天和30天時(shí)在齒瓣石斛苗的周圍撒病原菌固體接種劑。陰性對(duì)照為只在栽種時(shí)接入麥麩固體基質(zhì)的齒瓣石斛苗；陽(yáng)性對(duì)照為在栽種時(shí)接入麥麩固體基質(zhì)，井分別于移栽后的3天和30天時(shí)在齒瓣石斛苗周圍撒病原菌固體接種劑。分別于接入病原菌兩個(gè)月后統(tǒng)計(jì)苗的存活率。兩種接種處理，苗的平均存活率達(dá)到69. 3%，陰性對(duì)照中苗的存活率為46. 7%，陽(yáng)性對(duì)照中沒有苗存活。這ー結(jié)果表明感染軟腐病病原菌后，內(nèi)生真菌Dhs96能提高齒瓣石斛苗的存活率。實(shí)施例5Dhs96對(duì)束花石斛苗軟腐病的生物防治內(nèi)生真菌Dhs96經(jīng)PDA液體發(fā)酵培養(yǎng)后與麥麩固體基質(zhì)混合均勻制成固體接種劑。石斛軟腐病病原菌終極腐霉(Pythium ultimum)經(jīng)活化培養(yǎng)后收集孢子,配制成IXlOVml的孢子懸浮液，與麥麩固體基質(zhì)混合均勻制成固體接種劑。以樹皮作為栽培基質(zhì)，在栽種束花石斛苗時(shí)，把Dhs96固體接種劑接種到束花石斛苗的根部。盆栽苗放入日光溫室中，溫度維持在20±2°C。栽種后噴水，以利于內(nèi)生真菌的生長(zhǎng)。以后每三天噴水一次。分別于接種真菌Dhs96后的3天和30天時(shí)在束花石斛苗的周圍撒病原菌固體接種劑。陰性對(duì)照為只在栽種時(shí)接入麥麩固體基質(zhì)的束花石斛苗；陽(yáng)性對(duì)照為在栽種時(shí)接入麥麩固體基質(zhì)，井分別于移栽后的3天和30天時(shí)在束花石斛苗周圍撒病原菌固體接種劑。分別于接入病原菌兩個(gè)月后統(tǒng)計(jì)苗的存活率。兩種接種處理，苗的平均存活率達(dá)到58. 7%，陰性對(duì)照中苗的存活率為40. 7%，陽(yáng)性對(duì)照中沒有苗存活。這ー結(jié)果表明感染軟腐病病原菌后，內(nèi)生真菌Dhs96能提高束花石斛苗的存活率。
實(shí)施例6Dfl88對(duì)金釵石斛苗軟腐病的生物防治內(nèi)生真菌Df 188經(jīng)PDA液體發(fā)酵培養(yǎng)后制成I X 107/ml的孢子懸浮液，與麥麩固體基質(zhì)混合制成固體接種劑。石斛軟腐病病原菌終極腐霉(Pythium ultimum)經(jīng)活化培養(yǎng)后收集孢子，配制成5 X 105/ml的孢子懸浮液，與麥麩固體基質(zhì)混合均勻，制成固體接種劑。以樹皮作為栽培基質(zhì)，在栽種金釵石斛苗時(shí)，把Dfl88固體接種劑接種到金釵石斛苗的根部。盆栽苗放入日光溫室中，溫度維持在20±2°C。栽種后噴水，以利于內(nèi)生真菌的生長(zhǎng)。以后每三天噴水一次。分別于接種真菌Dfl88后的3天和30天時(shí)在金釵石斛苗的周圍撒病原菌固體接種劑。陰性對(duì)照為只在栽種時(shí)接入麥麩固體基質(zhì)的金釵石斛苗；陽(yáng)性對(duì)照為在栽種時(shí)接入麥麩固體基質(zhì)，井分別于移栽后的3天和30天時(shí)在金釵石斛苗周圍撒病原菌固體接種劑。分別于接入病原菌兩個(gè)月后統(tǒng)計(jì)苗的存活率。兩種接種處理，苗的平均存活率達(dá) 到73. 3%，陰性對(duì)照中苗的存活率為56. 7%，陽(yáng)性對(duì)照中沒有苗存活。這ー結(jié)果表明感染軟腐病病原菌后，內(nèi)生真菌Dfl88能提高金釵石斛苗的存活率。實(shí)施例7Dfl88對(duì)鐵皮石斛苗軟腐病的生物防治內(nèi)生真菌Df 188經(jīng)PDA液體發(fā)酵培養(yǎng)后制成5 X 106/ml的孢子懸浮液，與麥麩固體基質(zhì)混合制成固體接種劑。石斛軟腐病病原菌終極腐霉(Pythium ultimum)經(jīng)活化培養(yǎng)后收集孢子，配制成I X 105/ml的孢子懸浮液，與麥麩固體基質(zhì)均勻混合，制成固體接種劑。以樹皮作為栽培基質(zhì)，在栽種鐵皮石斛苗時(shí)，把Dfl88固體接種劑接種到鐵皮石斛苗的根部。盆栽苗放入日光溫室中，溫度維持在20±2°C。栽種后噴水，以利于內(nèi)生真菌的生長(zhǎng)。以后每三天噴水一次。分別于接種真菌Dfl88后的3天和30天時(shí)在鐵皮石斛苗的周圍撒病原菌固體接種劑。陰性對(duì)照為只在栽種時(shí)接入麥麩固體基質(zhì)的鐵皮石斛苗；陽(yáng)性對(duì)照為在栽種時(shí)接入麥麩固體基質(zhì)，井分別于移栽后的3天和30天時(shí)在鐵皮石斛苗周圍撒病原菌固體接種劑。分別于接入病原菌兩個(gè)月后統(tǒng)計(jì)苗的存活率。兩種接種處理，苗的平均存活率達(dá)到56. 7% (46. 7%),陰性對(duì)照中苗的存活率為43. 3%，陽(yáng)性對(duì)照中沒有苗存活。這ー結(jié)果表明感染軟腐病病原菌后，內(nèi)生真菌Df 188能提高鐵皮石斛苗的存活率。實(shí)施例8Dfl88對(duì)鼓槌石斛苗軟腐病的生物防治內(nèi)生真菌Df 188經(jīng)PDA液體發(fā)酵培養(yǎng)后制成5 X 105/ml的孢子懸浮液，與麥麩固體基質(zhì)混合制成固體接種劑。石斛軟腐病病原菌終極腐霉(Pythium ultimum)經(jīng)活化培養(yǎng)后收集孢子，配制成5 X 104/ml的孢子懸浮液，與麥麩固體基質(zhì)均勻混合，制成固體接種劑。以樹皮作為栽培基質(zhì)，在栽種鼓槌石斛苗時(shí)，把Dfl88固體接種劑接種到鼓槌石斛苗的根部。盆栽苗放入日光溫室中，溫度維持在20±2°C。栽種后噴水，以利于內(nèi)生真菌的生長(zhǎng)。以后每三天噴水一次。分別于接種真菌Dfl88后的3天和30天時(shí)在鼓槌石斛苗的周圍撒病原菌固體接種劑。陰性對(duì)照為只在栽種時(shí)接入麥麩固體基質(zhì)的鼓槌石斛苗；陽(yáng)性對(duì)照為在栽種時(shí)接入麥麩固體基質(zhì)，井分別于移栽后的3天和30天時(shí)在鼓槌石斛苗周圍撒病原菌固體接種劑。分別于接入病原菌兩個(gè)月后統(tǒng)計(jì)苗的存活率。兩種接種處理，苗的平均存活率達(dá)到62. 3%，陰性對(duì)照中苗的存活率為47. 3%，陽(yáng)性對(duì)照中沒有苗存活。這ー結(jié)果表明感染軟腐病病原菌后，內(nèi)生真菌Dfl88能提高鼓槌石斛苗的存活率。
實(shí)施例9Dfl88對(duì)齒瓣石斛苗軟腐病的生物防治內(nèi)生真菌Df 188經(jīng)PDA液體發(fā)酵培養(yǎng)后制成I X 107/ml的孢子懸浮液，與麥麩固體基質(zhì)混合制成固體接種劑。石斛軟腐病病原菌終極腐霉(Pythium ultimum)經(jīng)活化培養(yǎng)后收集孢子，配制成5 X 105/ml的孢子懸浮液，與麥麩固體基質(zhì)均勻混合，制成固體接種劑。以樹皮作為栽培基質(zhì)，在栽種齒瓣石斛苗時(shí)，把Dfl88固體接種劑接種到齒瓣石斛苗的根部。盆栽苗放入日光溫室中，溫度維持在20±2°C。栽種后噴水，以利于內(nèi)生真菌的生長(zhǎng)。以后每三天噴水一次。分別于接種真菌Dfl88后的3天和30天時(shí)在齒瓣石斛苗的周圍撒病原菌固體接種劑。陰性對(duì)照為只在栽種時(shí)接入麥麩固體基質(zhì)的齒瓣石斛苗；陽(yáng)性對(duì)照為在栽種時(shí)接入麥麩固體基質(zhì)，井分別于移栽后的3天和30天時(shí)在齒瓣石斛苗周圍撒病原菌固體接種劑。分別于接入病原菌兩個(gè)月后統(tǒng)計(jì)苗的存活率。兩種接種處理，苗的平均存活率達(dá)到60. 3%，陰性對(duì)照中苗的存活率為46. 7%，陽(yáng)性對(duì)照中沒有苗存活。這ー結(jié)果表明感染軟腐病病原菌后，內(nèi)生真菌Dfl88能提高齒瓣石斛苗的存活率。 實(shí)施例10Dfl88對(duì)束花石斛苗軟腐病的生物防治內(nèi)生真菌Df 188經(jīng)PDA液體發(fā)酵培養(yǎng)后制成5 XlOVml的孢子懸浮液，與麥麩固體基質(zhì)混合制成固體接種劑。石斛軟腐病病原菌終極腐霉(Pythium ultimum)經(jīng)活化培養(yǎng)后收集孢子，配制成I X 107ml的孢子懸浮液，與麥麩固體基質(zhì)均勻混合，制成固體接種劑。以樹皮作為栽培基質(zhì)，在栽種束花石斛苗時(shí)，把Dfl88固體接種劑接種到束花石斛苗的根部。盆栽苗放入日光溫室中，溫度維持在20±2°C。栽種后噴水，以利于內(nèi)生真菌的生長(zhǎng)。以后每三天噴水一次。分別于接種真菌Dfl88后的3天和30天時(shí)在束花石斛苗的周圍撒病原菌固體接種劑。陰性對(duì)照為只在栽種時(shí)接入麥麩固體基質(zhì)的束花石斛苗；陽(yáng)性對(duì)照為在栽種時(shí)接入麥麩固體基質(zhì)，井分別于移栽后的3天和30天時(shí)在束花石斛苗周圍撒病原菌固體接種劑。分別于接入病原菌兩個(gè)月后統(tǒng)計(jì)苗的存活率。兩種接種處理，苗的平均存活率達(dá)到53. 3%，陰性對(duì)照中苗的存活率為40. 7%，陽(yáng)性對(duì)照中沒有苗存活。這ー結(jié)果表明感染軟腐病病原菌后，內(nèi)生真菌Dfl88能提高束花石斛苗的存活率。
權(quán)利要求
1.對(duì)蘭科石斛屬植物軟腐病具有防治作用的I株內(nèi)生真菌菌株，它的分類命名為保藏編號(hào)為 CGMCC No. 3786 的根霉屬真菌 Dhs96 (Rhizopus sp.)。
2.如權(quán)利要求I所述的I株內(nèi)生真菌在防治軟腐病方面的用途，其特征在于能用于石斛屬植物的苗盤、花盆或苗床育苗，也能用于石斛屬植物的大田栽培。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株對(duì)蘭科石斛屬植物軟腐病具有生物防治效果的內(nèi)生真菌菌株。它能在石斛屬植物根部定植，用于石斛屬植物的育苗或栽培中，能夠有效地防治石斛屬植物軟腐病的發(fā)生。
文檔編號(hào)A01N63/04GK102776127SQ20121022245
公開日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2010年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月5日
發(fā)明者李向東, 王卉, 郭順星, 陳曉梅 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所