專利名稱：用于在體內(nèi)快速鑒定藥物活性化合物的動(dòng)物模型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于腫瘤生長(zhǎng)，特別是癌性生長(zhǎng)的動(dòng)物模型。具體地，動(dòng)物模型使得能夠體內(nèi)鑒定藥物活性化合物，包括利用由包括可操作地連接啟動(dòng)子的報(bào)道基因的表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞，其中該啟動(dòng)子還控制與腫瘤退化、腫瘤生長(zhǎng)穩(wěn)定化或轉(zhuǎn)移抑制相關(guān)的蛋白的表達(dá)。
背景技術(shù)：
長(zhǎng)久以來(lái)一直都需要代表性的動(dòng)物模型來(lái)測(cè)試被推薦的新抗腫瘤試劑的效果而不必進(jìn)行長(zhǎng)期的異種移植研究。測(cè)試潛在的抗腫瘤試劑的現(xiàn)有體內(nèi)模型包括將腫瘤細(xì)胞植入非人動(dòng)物，用被推薦的新抗腫瘤試劑處理該動(dòng)物，然后監(jiān)控動(dòng)物以確定該處理對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。為了有助于腫瘤細(xì)胞相對(duì)于宿主細(xì)胞背景的顯示，許多體內(nèi)模型使用由報(bào)道基因，例如生物發(fā)光分子的螢光素酶家族和水母發(fā)光蛋白家族穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞。在開(kāi)發(fā)抗癌試劑的過(guò)程中，這些體內(nèi)模型的主要缺點(diǎn)是有限的通量，即需要大量的動(dòng)物和大量被推薦的抗癌化合物。此外，這些體內(nèi)模型是很耗時(shí)的，因?yàn)槠湫枰銐虻臅r(shí)間來(lái)使植入的腫瘤在動(dòng)物中生長(zhǎng)。因此，最近Lassota P.在2002年7月18日公開(kāi)的國(guó)際專利申請(qǐng)WO 02/055742 (PCT/EP02/00106)中提出了改進(jìn)的模型。在這個(gè)模型中，具有被抗腫瘤試劑激活的報(bào)道基因的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)在生物相容的半滲透性的密封裝置內(nèi)，將該裝置植入非人動(dòng)物并且在使該動(dòng)物暴露于待測(cè)試的化合物后將其取出。然而，考慮到腫瘤細(xì)胞的人工環(huán)境，腫瘤細(xì)胞的應(yīng)答是否真正地模仿體內(nèi)狀態(tài)是有疑問(wèn)的，在體內(nèi)狀態(tài)中化合物必須進(jìn)入循環(huán)、浸潤(rùn)腫瘤組織并且發(fā)揮其生物效應(yīng)。因此，為了滿足對(duì)沒(méi)有上述缺陷的用于人腫瘤疾病的動(dòng)物模型的需要，本發(fā)明公開(kāi)了已經(jīng)能夠真正模仿被推薦的抗腫瘤化合物的體內(nèi)藥理學(xué)活性的新動(dòng)物模型。該模型使得能夠以非侵入性的方式監(jiān)控化合物的抗腫瘤活性，并且包括利用已經(jīng)用包含可操作連接啟動(dòng)子的報(bào)道基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞，其中該啟動(dòng)子還控制與腫瘤退化相關(guān)的蛋白的表達(dá)。為了提供所需要的動(dòng)物模型，該細(xì)胞應(yīng)-當(dāng)被植入或注射入動(dòng)物時(shí)，保持形成腫瘤的能力；-產(chǎn)生與腫瘤退化相關(guān)的蛋白的內(nèi)源應(yīng)答平行的信號(hào)；-產(chǎn)生具有優(yōu)良信噪比的信號(hào)，以使得能夠在體內(nèi)實(shí)時(shí)分析藥物物質(zhì)的動(dòng)力學(xué)效應(yīng)；-產(chǎn)生具有優(yōu)良可重復(fù)性的信號(hào)以提供動(dòng)物之間的低變異性；以及-產(chǎn)生能夠使誘導(dǎo)的應(yīng)答非侵入性成像的信號(hào)。

發(fā)明內(nèi)容
在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供用包含可操作地連接啟動(dòng)子的報(bào)道基因，優(yōu)選熒光蛋白的表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞系，其中啟動(dòng)子還控制與腫瘤退化相關(guān)的蛋白的表達(dá)，其特征在于當(dāng)被植入或注射入非人動(dòng)物中時(shí)，所述的細(xì)胞系能夠形成腫瘤。與傳統(tǒng)的體內(nèi)模型相比，本發(fā)明的不同點(diǎn)在于報(bào)道基因不是組成型表達(dá)的，而只有在暴露于導(dǎo)致與腫瘤退化相關(guān)的蛋白或酶表達(dá)的測(cè)試化合物后才會(huì)表達(dá)。只有當(dāng)待測(cè)試的化合物進(jìn)入循環(huán)并浸潤(rùn)腫瘤時(shí)，如果其促進(jìn)與腫瘤退化相關(guān)的蛋白表達(dá)并且所述蛋白的啟動(dòng)子可操作地連接報(bào)道基因，就可能產(chǎn)生報(bào)道信號(hào)。該模型相對(duì)于現(xiàn)有的體內(nèi)模型是高度有利的，因?yàn)闇p少了測(cè)試被推薦的抗腫瘤化合物的體內(nèi)藥物活性的周轉(zhuǎn)時(shí)間。在傳統(tǒng)的體內(nèi)模型中，一般需要4至5周來(lái)獲得結(jié)果，而在本模型中，一旦在非人動(dòng)物中形成腫瘤，就有可能在幾天中看到測(cè)試化合物的效應(yīng)。進(jìn)一步的，考慮到熒光信號(hào)的亮度和可重復(fù)性，可透過(guò)皮膚看到腫瘤并且利用自動(dòng)的全體(whole-body)成像系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)量。因此只需要較低數(shù)目的動(dòng)物來(lái)獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的效果。 本動(dòng)物模型的進(jìn)一步優(yōu)點(diǎn)是在廣泛濃度范圍的測(cè)試化合物內(nèi)的熒光信號(hào)的靈敏性和反應(yīng)性。這個(gè)組合使得能夠?qū)y(cè)試化合物的體內(nèi)活性進(jìn)行動(dòng)力學(xué)的實(shí)時(shí)分析并且當(dāng)與觀察到的腫瘤重量變化組合時(shí)預(yù)測(cè)測(cè)試化合物的抗腫瘤效果。這些特征的組合使得能夠在使用有限量的測(cè)試化合物劑量(4天，而不是傳統(tǒng)的30天時(shí)間段)后進(jìn)行非侵入性的成像，其減少了實(shí)驗(yàn)時(shí)間并且因此減少了測(cè)試化合物，以及減少了動(dòng)物遭受的病痛和動(dòng)物設(shè)施的占用時(shí)間。在特定的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子由p21啟動(dòng)子組成。p21蛋白作為依賴細(xì)胞周期蛋白的激酶活性的抑制劑起作用并且有效地終止細(xì)胞周期進(jìn)展。已經(jīng)顯示多種抗腫瘤試劑激活P21啟動(dòng)子，包括DNA破壞試劑和組蛋白脫乙酰酶抑制劑，其分別通過(guò)p53應(yīng)答元件(位于相對(duì)于TATA框-4500bp至-1300bp的區(qū)域)或spl位點(diǎn)(位于相對(duì)于TATA框_60bp至+40bp的區(qū)域)而激活p21啟動(dòng)子，并且導(dǎo)致p21蛋白的表達(dá)增加。在本發(fā)明特定的實(shí)施方案中，p21啟動(dòng)子由p21的1300bp啟動(dòng)子片段組成，其特征在于所述的啟動(dòng)子片段不包括P53應(yīng)答元件，因此對(duì)DNA破壞試劑不起反應(yīng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，p21啟動(dòng)子由包括P53應(yīng)答元件的p21啟動(dòng)子組成，所述的p21啟動(dòng)子對(duì)DNA破壞試劑起反應(yīng)。備選地對(duì)DNA破壞試劑起反應(yīng)的啟動(dòng)子由例如包括至少一個(gè)P53應(yīng)答元件的單純皰疹病毒的胸苷激酶基本啟動(dòng)子(HSV-TK)的最小啟動(dòng)子組成。因此，以所使用的啟動(dòng)子為基礎(chǔ)，本發(fā)明提供對(duì)DNA破壞試劑和/或組蛋白脫乙酰酶抑制劑的體內(nèi)藥理學(xué)效果具有選擇性的模型?；蛞话阏f(shuō)來(lái)，根據(jù)目標(biāo)腫瘤試劑，可使用備選的應(yīng)答元件。此外本發(fā)明的目的也提供篩選化合物的抗腫瘤活性的體外方法，包括步驟-使根據(jù)本發(fā)明的腫瘤細(xì)胞接觸待測(cè)試的化合物；以及-測(cè)量報(bào)道基因的表達(dá)；其中與對(duì)照水平相比，報(bào)道基因表達(dá)的增加鑒定化合物為具有抗腫瘤活性。在特定的實(shí)施方案中，報(bào)道基因是熒光蛋白并且測(cè)量報(bào)道基因的表達(dá)為發(fā)射的熒光的量。如上文所說(shuō)明的，對(duì)于這個(gè)體外方法也有可能根據(jù)所使用的啟動(dòng)子改變篩選的選擇能力。在本發(fā)明具體的實(shí)施方案中，體外篩選法對(duì)于組蛋白脫乙酰酶抑制劑是選擇性的并且包括用包括p21的1300bp啟動(dòng)子片段的表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞，其特征在于所述的啟動(dòng)子片段不包括p53應(yīng)答兀件。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，體外篩選法對(duì)于DNA破壞試劑,例如放線菌素D是選擇性的，并且包括用包含至少一個(gè)p53應(yīng)答元件的表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)載體包括由SEQ ID No. 10組成的p53應(yīng)答元件，優(yōu)選作為例如HSV-TK啟動(dòng)子的最小啟動(dòng)子的部分。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于篩選化合物藥物活性的非人動(dòng)物模型，所述的動(dòng)物包括根據(jù)本發(fā)明的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞。可以腫瘤細(xì)胞懸浮液的形式，將所述的腫瘤細(xì)胞通過(guò)手術(shù)植入或注射入非人動(dòng)物的皮膚下以提供皮下模型，進(jìn)入腫瘤來(lái)源的器官(例如進(jìn)入肺的肺腫瘤細(xì)胞)以提供同位的模型，進(jìn)入非人動(dòng)物的腹膜腔以提供腹膜模型，或進(jìn)入非人動(dòng)物的血管以提供轉(zhuǎn)移模型。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，皮下注射腫瘤細(xì)胞以提供皮下的模型。因此本發(fā)明的目的是提供篩選化合物的藥物活性的方法，包括以下步驟-將根據(jù)本發(fā)明的腫瘤細(xì)胞以在所述的非人動(dòng)物中足夠影響腫瘤產(chǎn)生的量施用于非人動(dòng)物； -提供腫瘤細(xì)胞足夠的時(shí)間以在所述的非人動(dòng)物中形成腫瘤；-將潛在的活性化合物施用于所述的非人動(dòng)物；以及-通過(guò)測(cè)量報(bào)道基因的表達(dá)評(píng)估所述的化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響。與藥物活性化合物進(jìn)行溫育將導(dǎo)致與對(duì)照水平相比報(bào)道基因的表達(dá)增加。在下文中將更詳細(xì)地論述本發(fā)明的這個(gè)方面和進(jìn)一步的方面。


圖IA :克隆I的p21啟動(dòng)子構(gòu)建體對(duì)DNA破壞試劑和組蛋白脫乙酰酶抑制劑(HDACi)的劑量反應(yīng)。用指明的化合物處理細(xì)胞24小時(shí)，所述化合物即DNA破壞試劑喜樹(shù)堿(campthotecin) (camp.)、博來(lái)霉素(bleo)和阿霉素(dox)以及 HDACi 化合物 TSA、Mitsui、化合物X和SAHA。如M&M所描述的，利用Ascent Fluoroskan測(cè)量熒光。將誘導(dǎo)后的熒光除以DMSO處理細(xì)胞的熒光計(jì)算誘導(dǎo)倍數(shù)。用10_7M TSA處理后克隆I顯示5倍的誘導(dǎo)；10_6MMitsui顯示2倍的誘導(dǎo)，以及1(Γ6Μ化合物X顯示3倍的誘導(dǎo)。圖IB :克隆5的p21啟動(dòng)子構(gòu)建體對(duì)DNA破壞試劑和組蛋白脫乙酰酶抑制劑(HDACi)的劑量反應(yīng)。用指明的化合物處理細(xì)胞24小時(shí)，所述化合物即DNA破壞試劑喜樹(shù)堿(camp.)、博來(lái)霉素(bleo)和阿霉素(dox)以及HDACi化合物TSA、Mitsui、JNJ99 (化合物X)和SAHA。如M&M所描述的，利用Fluoroskan測(cè)量熒光。將誘導(dǎo)后的熒光除以DMSO處理細(xì)胞的熒光計(jì)算誘導(dǎo)倍數(shù)。用10_7M TSA處理后克隆5顯示5倍的誘導(dǎo)；10_6M Mitsui顯示2倍的誘導(dǎo)，以及10_6M化合物X顯示4倍的誘導(dǎo)。圖2.異種移植熒光的體內(nèi)顯示。將克隆I皮下注射(IO7個(gè)細(xì)胞/200 μ I)進(jìn)入裸鼠脅腹。從第12天開(kāi)始,在6天期間每日使動(dòng)物服用溶劑、Mitsui (20mpk)或化合物X(40mpk)。在內(nèi)部(in house)顯影的自動(dòng)全體成像系統(tǒng)中評(píng)估活小鼠中腫瘤的突光并且比較熒光強(qiáng)度。施用第一劑后3天ZsGreen的誘導(dǎo)是非常明顯的，并且開(kāi)始處理后5天達(dá)到平臺(tái)。圖3.在A2780和HCT116克隆中，p53RE啟動(dòng)子構(gòu)建體對(duì)DNA破壞試劑放線菌素D的應(yīng)答。用放線菌素D處理細(xì)胞24小時(shí)。如在實(shí)施例2中所描述的，利用Fluoroskan測(cè)量熒光。將誘導(dǎo)后的熒光除以DMSO處理細(xì)胞的熒光計(jì)算誘導(dǎo)倍數(shù)。A2780克隆36顯示用10ng/ml放線菌素D處理后有2倍的誘導(dǎo)；使用HCT116克隆觀察到2至幾乎4倍的誘導(dǎo)。圖4. p21waf’cipl啟動(dòng)子-ZsGreen模型預(yù)測(cè)HDAC抑制劑的體外生物效應(yīng)。用標(biāo)明濃度的 HDAC 抑制劑 SAHA ⑷、MS-275 ( Λ )、LAQ-824 ()和 TSA ( ·)或溶劑(O. I % DMSO)對(duì)用PG13-基本-ZsGreen-1300轉(zhuǎn)染的A2780卵巢腫瘤細(xì)胞的克隆5處理24小時(shí)。圖4A顯示利用P21ELISA測(cè)量的克隆5的p21蛋白誘導(dǎo)。圖4B表示利用Ascent Fluoroskan測(cè)量的克隆5中誘導(dǎo)的熒光。p21的誘導(dǎo)模式與p21應(yīng)答的ZsGreen表達(dá)載體pG13-基本-ZsGreen-1300的誘導(dǎo)模式相同。圖5. p21waf'cipl啟動(dòng)子-ZsGreen模型預(yù)測(cè)個(gè)體小鼠中MS-275的體內(nèi)抗腫瘤效果。用人A2780p2IwafWplZsGreen卵巢腫瘤細(xì)胞(107個(gè)細(xì)胞/小鼠)皮下注射裸鼠，并且從第4天接著用載體(對(duì)照組、20%羥丙基-β -環(huán)糊精)或MS-275(QD)以指明的劑量口服(p. ο.)處理。在第28天利用自動(dòng)全體成像系統(tǒng)評(píng)估腫瘤重量和個(gè)體腫瘤的熒光。圖6. 53RE_TK/pGL3-基本-ZsGreen 表達(dá)載體
具體實(shí)施例方式載體本發(fā)明涉及包括可操作地連接啟動(dòng)子的報(bào)道基因的載體，其中該啟動(dòng)子還控制表達(dá)水平與生理狀況相關(guān)的蛋白或酶的表達(dá)。在此所使用的可操作地連接，是指使啟動(dòng)子與基因在正確的讀框中功能性地融合以在該啟動(dòng)子的控制下表達(dá)該基因。如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)“報(bào)道基因”是指編碼可利用簡(jiǎn)單、廉價(jià)的方法或試劑鑒定的基因產(chǎn)物的基因，并且其可與啟動(dòng)子區(qū)域或其活性片段可操作地連接。例如螢火蟲(chóng)螢光素酶、半乳糖苷酶、堿性磷酸酶、細(xì)菌氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶或熒光蛋白報(bào)道基因的報(bào)道基因可用于在根據(jù)本發(fā)明的篩選測(cè)定中確定轉(zhuǎn)錄活性(參見(jiàn)，例如，Goeddel (編輯·), Methods Enzymol. ，Vol. 185, San Diego Academic Press, Inc.(1990);也參見(jiàn)Sambrook，上文)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，報(bào)道基因是熒光蛋白，特別地選自EGFP、EYFP> DsRecU ZsGreen、ZsYellow、HcRed的突光蛋白或去穩(wěn)定的突光蛋白，例如pDsRed、pHcRedU pd2EGFP或pd2EYFP。在本發(fā)明特定的實(shí)施方案中，報(bào)道基因是熒光蛋白ZsGreen。所述的報(bào)道分子及其基因序列是本領(lǐng)域已知的并且是可商業(yè)購(gòu)買的，例如由Clontech, San Diego, Califonia 銷售的突光蛋白。用于核酸操作，例如制備核酸構(gòu)建體、誘變、測(cè)序、將DNA導(dǎo)入細(xì)胞和基因表達(dá)，以及蛋白分析的技術(shù)和方法在Current Protocols in Molecular Biology, Ausbel等人編輯，John Wiley & Sons, 1997中有詳細(xì)描述。根據(jù)本發(fā)明的載體可從商業(yè)購(gòu)買的載體選擇或構(gòu)建，例如pCAT3、pGL2、pGL3或pSV-β -半乳糖苷酶，并且一般包括適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列以及一種或多種選擇標(biāo)記基因，例如在細(xì)菌質(zhì)粒情況下為氨芐青霉素抗性基因或?qū)τ诓溉閯?dòng)物載體來(lái)說(shuō)為新霉素抗性基因。如下文所例證的，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，從PGL3基本載體構(gòu)建載體。所述的載體序列是本領(lǐng)域已知的并且是可商業(yè)購(gòu)買的，例如pGL3基本載體由Promega, Madison, WI銷售。特別地，本發(fā)明的載體包含作為一個(gè)調(diào)控序列的啟動(dòng)子序列，其不僅與設(shè)計(jì)表達(dá)載體的宿主細(xì)胞相容，而且對(duì)已知在各自的宿主細(xì)胞中具有所需要的生理效應(yīng)的化合物，包括蛋白、肽、寡核苷酸和小分子起反應(yīng)。因此，本發(fā)明表達(dá)載體中的啟動(dòng)子序列包括至少一個(gè)調(diào)控序列元件，亦稱為應(yīng)答元件，其特征在于它調(diào)節(jié)連接的報(bào)道基因的表達(dá)，并且由于結(jié)合或釋放轉(zhuǎn)錄因子而被激活，其中所述轉(zhuǎn)錄因子的存在或不存在與宿主細(xì)胞的所需要的生理?xiàng)l件相關(guān)。例如，如果所需要的生理?xiàng)l件由在宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和分化組成，那么啟動(dòng)子序列可包括存在于p21WAF_1/eipl啟動(dòng)子鄰近部分的富含GC的基序，已知當(dāng)暴露于p21激活齊U，例如轉(zhuǎn)錄因子Spl和Sp3，以及細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞分化的其它誘導(dǎo)物，例如類固醇激素、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、腫瘤壞死因子-α、佛波酯、磷酸酶抑制劑、干擾素Y、和Smad腫瘤抑制蛋白時(shí)所述基序被激活。因此，在此所使用的啟動(dòng)子可以是天然存在的啟動(dòng)子，例如p21WAF_1/eipl啟動(dòng)子，其還控制表達(dá)水平依賴于所需要的生理?xiàng)l件的蛋白的表達(dá)，或者可以是其具有啟動(dòng)子活性的片段，例如如在下文的實(shí)施例中所描述的P21的1300bp啟動(dòng)子片段。在特定的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子序列由重組DNA構(gòu)建體組成,其包括一個(gè)上述的調(diào)控序列元件,例如可操作地連接最小啟動(dòng)子元件，例如最小的白細(xì)胞介素6(IL6)啟動(dòng)子(phu. IL6Pluc+Plaisance等人(1997)MCB 17，3733-3743)、最小的 ElB 啟動(dòng)子(可從 Stratagene 商業(yè)購(gòu)買的 pMCSluc)或 可商業(yè)購(gòu)買的用于螢光素酶的TK啟動(dòng)子(pTKluc Promega)的p53應(yīng)答元件，優(yōu)選地啟動(dòng)子由如下文所描述的p21的1300bp啟動(dòng)子片段、或包括如下文所描述的p53應(yīng)答元件的HSV-TK最小啟動(dòng)子組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子序列可以是還控制與腫瘤退化相關(guān)的蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子，或其具有啟動(dòng)子活性的片段。靶細(xì)胞在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用包括可操作地連接啟動(dòng)子的報(bào)道基因的表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的靶細(xì)胞，其中啟動(dòng)子還控制表達(dá)水平與生理?xiàng)l件相關(guān)的蛋白或酶的表達(dá)?？赏ㄟ^(guò)任何已知的方法，例如轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)，優(yōu)選利用標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)染方法，例如脂質(zhì)體、磷酸鈣沉淀、電穿孔和使用基因槍將如上所述的載體構(gòu)建體導(dǎo)入靶細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步的方面是提供用于腫瘤生長(zhǎng)，特別是癌性生長(zhǎng)的非人動(dòng)物模型。可將根據(jù)本發(fā)明的載體導(dǎo)入靶細(xì)胞，當(dāng)將所述靶細(xì)胞植入或注射入非人動(dòng)物時(shí)能夠形成腫瘤。合適的細(xì)胞系實(shí)例包括黑素瘤、肺腫瘤系、腎腫瘤系、結(jié)腸腫瘤系、前列腺腫瘤系、卵巢腫瘤系、乳腺腫瘤系、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤系、白血病細(xì)胞系等。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶細(xì)胞由卵巢腫瘤細(xì)胞系，特別是A2780(ECACC No. 93112520)組成，在另一個(gè)實(shí)施方案中，靶細(xì)胞由結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系，特別是HCT116(ATCC No. CCL-247)組成。進(jìn)一步的靶細(xì)胞可選自多種細(xì)胞系，其包括多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，特別是人細(xì)胞系。應(yīng)注意到在此所使用的靶細(xì)胞包括任何上述的細(xì)胞，其已經(jīng)用針對(duì)選擇標(biāo)記，例如新霉素，治療性的蛋白，例如甲硫氨酸酶或報(bào)道基因產(chǎn)物的表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化。例如，在本發(fā)明備選的實(shí)施方案中，當(dāng)被施用于非人動(dòng)物時(shí)能夠形成腫瘤的靶細(xì)胞已經(jīng)用編碼報(bào)道蛋白，例如螢火蟲(chóng)螢光素酶或熒光蛋白(參見(jiàn)上文)的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。可用根據(jù)本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化這些細(xì)胞，前提是提供基礎(chǔ)色的發(fā)光蛋白，即報(bào)道基因，和提供可誘導(dǎo)色的根據(jù)本發(fā)明的載體的發(fā)射波長(zhǎng)相互不重疊?？赡艿慕M合包括 DsRed 與增強(qiáng)的熒光蛋白 EBFP、ECFP, EGFP 和 EYFP ；ZsGreen 與 DsRed ；EGFP 與 EYFP ；EGFP與EBFP ；EBFP與EYFP ;或ECFP與EYFP。一旦用根據(jù)本發(fā)明的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，這些細(xì)胞就使得能夠有效檢測(cè)完整的腫瘤，例如，確定所施用的腫瘤細(xì)胞何時(shí)在所述的非人動(dòng)物中具有足夠的時(shí)間來(lái)形成腫瘤，結(jié)合在此所描述的誘導(dǎo)型系統(tǒng)研究測(cè)試化合物的抗腫瘤活性。特別地，用來(lái)研究待測(cè)試的化合物是否通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散和/或血管生成進(jìn)入腫瘤。無(wú)論如何靶細(xì)胞的選擇取決于所研究的生理?xiàng)l件。備選地，根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體具有低的但可檢測(cè)的報(bào)道基因的基本表達(dá)，其具有達(dá)到顯著性的優(yōu)良誘導(dǎo)系數(shù)。在這個(gè)實(shí)施方案中，低的基本表達(dá)可用于確定所施用的腫瘤細(xì)胞何時(shí)在所述的非人動(dòng)物中具有足夠的時(shí)間來(lái)形成腫瘤。因此不需要靶細(xì)胞的雙重轉(zhuǎn)染。當(dāng)本發(fā)明所述的載體包括ZsGreen作為報(bào)道基因時(shí)，這個(gè)實(shí)施方案是有利的。因此本發(fā)明的目的是提供已經(jīng)用包含可操作地連接啟動(dòng)子的報(bào)道基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞系，其中所述的啟動(dòng)子還控制與腫瘤退化相關(guān)的蛋白的表達(dá)。特別地，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的卵巢癌細(xì)胞系，優(yōu)選A2780細(xì)胞包括包含可操作地連接啟動(dòng)子的編碼突光蛋白的核酸序列的表達(dá)載體，所述的啟動(dòng)子對(duì)p21激活劑起反應(yīng),優(yōu)選所述的啟動(dòng)子包括1300bp的p21啟動(dòng)子序列(SEQ ID No. I)，更優(yōu)選地，所述的啟動(dòng)子序列由1300bp的P21啟動(dòng)子序列(SEQ ID No. I)組成。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，熒光蛋白選自EGFP、EYFP,DsRecU ZsGreen、ZsYellow、HcRed 或去穩(wěn)定的突光蛋白，例如 pDsRed、pHcRedl、pd2EGFP 或pd2EYFP，以及在具體的實(shí)施方案中，熒光蛋白由ZsGreen組成。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞選自于2003年I月20日，作為pGL3-基本-ZsGreen-1300-克隆I和pGL3_基 本-ZsGreen-1300-克隆2保藏在比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心(BCCM)的克隆，其各自的保藏號(hào)為L(zhǎng)MBP 5958CB和LMBP 5959CB。所述的克隆包括來(lái)源于可商業(yè)購(gòu)買的pGL3載體，并且包含可操作地連接啟動(dòng)子的編碼ZsGreen的核酸序列的表達(dá)載體，其中所述的啟動(dòng)子對(duì)p21激活劑起反應(yīng)，所述的啟動(dòng)子包括1300bp p21啟動(dòng)子序列(SEQ ID No. I)，其中所述克隆的特征在于具有低的基本熒光表達(dá)，當(dāng)用已知的細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞分化誘導(dǎo)物，例如Mitsui (也稱為MS-275-Shering-注冊(cè)號(hào)209783-80-2)誘導(dǎo)時(shí)，使得能夠通過(guò)自動(dòng)全體成像系統(tǒng)檢測(cè)熒光?？紤]到這些特征，SP:-當(dāng)被植入或注射入非人動(dòng)物時(shí)，能夠形成腫瘤，-低的基本熒光，-當(dāng)暴露于已知的細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞分化誘導(dǎo)物時(shí)，以特異的方式可誘導(dǎo)熒光，以及-達(dá)到利用非侵入性全體成像技術(shù)可檢測(cè)的水平，所述的克隆為研究被推薦的抗腫瘤化合物的體內(nèi)藥物活性提供了重要工具。與傳統(tǒng)的體內(nèi)模型相比，在非人動(dòng)物中，特別是在例如兔、豚鼠、小鼠、大鼠和狗，優(yōu)選嚙齒類動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中使用這些細(xì)胞，使得能夠在藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程的早期時(shí)間點(diǎn)評(píng)估化合物，而不必進(jìn)行耗時(shí)和耗費(fèi)化合物的藥物代謝動(dòng)力學(xué)(PK)和藥物動(dòng)力學(xué)(PD)研究。 在備選的實(shí)施方案中，用包括由重組DNA構(gòu)建體組成的啟動(dòng)子序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，該構(gòu)建體包括一個(gè)上述的調(diào)控序列元件，例如可操作地連接最小啟動(dòng)子元件，例如最小的白細(xì)胞介素6(IL6)啟動(dòng)子(phu. IL6Pluc+Plaisance等人(1997)MCB 17，3733-3743)、最小的ElB啟動(dòng)子(可從Stratagene商業(yè)購(gòu)買的pMCSluc)或可商業(yè)購(gòu)買的用于螢光素酶的TK啟動(dòng)子(pTKluc Promega)的p53應(yīng)答元件。特別地，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系或卵巢癌細(xì)胞系，優(yōu)選HCTl 16細(xì)胞或A2780細(xì)胞包括包含可操作地連接啟動(dòng)子的編碼熒光蛋白的核酸序列的表達(dá)載體，該啟動(dòng)子對(duì)P53激活劑起反應(yīng)，優(yōu)選地所述的啟動(dòng)子包括p53應(yīng)答元件(SEQ ID No. 10),更優(yōu)選地,所述的啟動(dòng)子由包括p53應(yīng)答元件(Seq ID No. 10)的最小HSV-TK啟動(dòng)子組成，更優(yōu)選地，由p53應(yīng)答的HSV-TK啟動(dòng)子序列(SEQ ID No. 13)組成。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，熒光蛋白選自EGFP、EYFP、DsRed、ZsGreen、ZsYellow、HcRed或去穩(wěn)定的熒光蛋白，例如pDsRed、pHcRedl、pd2EGFP或pd2EYFP，以及在具體的實(shí)施方案中，熒光蛋白由ZsGreen組成。在特定的實(shí)施方案中，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞由用p53RE_TK/pGL3-基本-ZsGreen載體(圖)轉(zhuǎn)染的A2780或HCT116細(xì)胞組成，所述載體衍生自可商業(yè)購(gòu)買的PGL3載體并且包含可操作地連接啟動(dòng)子的編碼ZsGreen的核酸序列，其中啟動(dòng)子對(duì)P53激活劑起反應(yīng)，所述的啟動(dòng)子包括p53應(yīng)答的HSV-TK啟動(dòng)子序列(SEQ IDNo. 14)，其中所述克隆的特征在于其具有低的基本熒光表達(dá)，當(dāng)用p53激活劑誘導(dǎo)時(shí)，例如暴露于DNA破壞試劑、低氧、核苷酸耗盡或致癌激活時(shí)，使得能夠通過(guò)自動(dòng)全體成像系統(tǒng)檢測(cè)熒光?？紤]到這些特征，SP:-當(dāng)被植入或注射入非人動(dòng)物時(shí)，能夠形成腫瘤，

-低的基本熒光，-當(dāng)暴露于已知的細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞分化誘導(dǎo)物時(shí)，以特異的方式可誘導(dǎo)熒光，以及-達(dá)到利用非侵入性全體成像技術(shù)可檢測(cè)的水平，所述的克隆為研究被推薦的抗腫瘤化合物的體內(nèi)藥物活性提供了重要工具。與傳統(tǒng)的體內(nèi)模型相比，在非人動(dòng)物中，特別是在例如兔、豚鼠、小鼠、大鼠和狗，優(yōu)選嚙齒類動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中使用這些細(xì)胞，使得能夠在藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程的早期時(shí)間點(diǎn)評(píng)估化合物，而不必進(jìn)行耗時(shí)和耗費(fèi)化合物的藥物代謝動(dòng)力學(xué)(PK)和藥物動(dòng)力學(xué)(PD)研究。因此，在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供已經(jīng)用包含報(bào)道基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞系，其中報(bào)道基因與由重組DNA構(gòu)建體組成的啟動(dòng)子序列可操作地連接，該構(gòu)建體包括可操作地連接到最小啟動(dòng)子元件的調(diào)控序列元件，其特征在于所述的啟動(dòng)子序列對(duì)與腫瘤退化相關(guān)的化合物起反應(yīng)。在此所使用的化合物包括蛋白、肽、寡核苷酸和小分子。測(cè)定本發(fā)明的目的也在于提供上述細(xì)胞系在體外篩選測(cè)定中的用途，來(lái)鑒定藥物學(xué)上的活性化合物，所述的方法包括使根據(jù)本發(fā)明的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞與待測(cè)試的化合物接觸；并且測(cè)量報(bào)道基因的表達(dá)。在此所使用的藥物學(xué)上的活性化合物是指能夠激活存在于表達(dá)載體中的啟動(dòng)子序列的化合物。在鑒定具有抗腫瘤活性的化合物的特定實(shí)施方案中，上述篩選法中的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞包括包含可操作地連接啟動(dòng)子序列的報(bào)道基因的表達(dá)載體，該啟動(dòng)子序列對(duì)與腫瘤退化相關(guān)的化合物起反應(yīng)。因此本發(fā)明的一個(gè)目的是提供鑒定具有抗腫瘤活性的化合物的體外方法，所述的方法包括使根據(jù)本發(fā)明的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞與待測(cè)試的化合物接觸，并且測(cè)量報(bào)道基因的表達(dá)。在上述體外篩選法的優(yōu)選實(shí)施方案中，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞由穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的卵巢癌細(xì)胞，優(yōu)選A2780細(xì)胞組成,該細(xì)胞包括包含可操作地連接啟動(dòng)子的編碼突光蛋白的核酸序列的表達(dá)載體，所述的啟動(dòng)子對(duì)p21激活劑起反應(yīng),優(yōu)選所述的啟動(dòng)子包括1300bp的P21啟動(dòng)子序列(SEQ ID No. I)，更優(yōu)選地，所述的啟動(dòng)子序列由1300bp的p21啟動(dòng)子序列(SEQ ID No. I)組成。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，熒光蛋白選自EGFP、EYFP、DsRecU ZsGreen、ZsYellow、HcRed或去穩(wěn)定的熒光蛋白，例如pDsRed、pHcRedl、pd2EGFP或pd2EYFP，以及在具體的實(shí)施方案中，突光蛋白由ZsGreen或ZsRed組成。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于體外篩選法的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞選自以保藏號(hào)LMBP 5958CB和LMBP 5959CB保藏在BCCM的克隆。在上述體外篩選法的另一個(gè)實(shí)施方案中，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞由穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的結(jié)腸直腸癌細(xì)胞或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的卵巢癌細(xì)胞組成，優(yōu)選A2780細(xì)胞或HCTl 16細(xì)胞，所述細(xì)胞包括包含可操作地連接啟動(dòng)子的編碼熒光蛋白的核酸序列的表達(dá)載體，該啟動(dòng)子對(duì)P53激活劑起反應(yīng)，優(yōu)選地所述的啟動(dòng)子包括p53應(yīng)答元件(SEQ ID No. 10),更優(yōu)選地,所述的啟動(dòng)子由包含P53應(yīng)答元件的最小HSV-TK啟動(dòng)子(SEQ ID No. 13)組成。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，突光蛋白選自EGFP、EYFP> DsRecU ZsGreen、ZsYellow、HcRed或去穩(wěn)定的突光蛋白，例如pDsRed、pHcRedl、pd2EGFP或pd2EYFP，且在具體的實(shí)施方案中，熒光蛋白由ZsGreen組成。在特定的實(shí)施方案中，用于體外方法的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞由用p53RE_TK/pGL3-基本-ZsGreen載體轉(zhuǎn)染的A2780或HCTl 16細(xì)胞組成(圖6)。技術(shù)人員將容易地認(rèn)識(shí)到，上述測(cè)定可適合于高通量的篩選目的。例如可根據(jù)稱 為突光成像平板讀數(shù)器((FLIPR ), Molecular Devices Corporation)的儀器來(lái)設(shè)計(jì)通過(guò)測(cè)量熒光變化評(píng)估抗腫瘤活性的測(cè)定。在其最常見(jiàn)的構(gòu)型中，它激發(fā)并測(cè)量由熒光化合物發(fā)射的熒光。它使用氬離子激光器產(chǎn)生熒光團(tuán)的高功率激發(fā)，使用光學(xué)器件系統(tǒng)迅速掃描越過(guò)96-/384-孔平板的底部，并且使用靈敏的、冷卻的CCD照相機(jī)捕獲發(fā)射的熒光。它也包含96-/384-孔移液管頭來(lái)使得該儀器能夠?qū)y(cè)試試劑的溶液遞送進(jìn)入96-/384-孔平板的孔中。FLIPR分析被設(shè)計(jì)用于在加入化合物前、加入期間和加入后實(shí)時(shí)地同時(shí)測(cè)量來(lái)自所有的96-/384-孔的細(xì)胞群體的熒光信號(hào)。FLIPR測(cè)定可用來(lái)篩選和表征在根據(jù)本發(fā)明的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞中有功能活性的化合物。高通量的篩選測(cè)定，特別是對(duì)鑒定p21或p53激活劑有用的測(cè)定可由單個(gè)的步驟排列組成，其中將卵巢癌細(xì)胞，特別是用根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的A2780細(xì)胞與測(cè)試化合物一起溫育，并且在使得能夠進(jìn)行相互作用的足夠時(shí)間后(8-24小時(shí)，一般為12-24小時(shí)，特別為24小時(shí))利用自動(dòng)的熒光平板讀數(shù)器，例如FLIPR或AscentFluoroskan(可從Thermo Labsystems,Brussel,比利時(shí)商業(yè)購(gòu)買)測(cè)量相對(duì)突光單位的變化。非人動(dòng)物模型本發(fā)明的實(shí)施方案也提供包括根據(jù)本發(fā)明的靶細(xì)胞的非人動(dòng)物。特別提供用于腫瘤生長(zhǎng)，特別是癌性生長(zhǎng)的非人動(dòng)物模型。因此，本發(fā)明提供制備用于腫瘤生長(zhǎng)的非人動(dòng)物模型的方法，所述的方法包括將根據(jù)本發(fā)明的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞以足夠在所述的非人動(dòng)物中影響腫瘤產(chǎn)生的量施用于所述的非人動(dòng)物。其中用作模型的所述非人動(dòng)物優(yōu)選是哺乳動(dòng)物受試者，最優(yōu)選是便利的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，例如豚鼠、兔、大鼠和小鼠等。為了更類似于人受試者，也可使用靈長(zhǎng)類。特別有用的是對(duì)腫瘤發(fā)展敏感的受試者，例如免疫系統(tǒng)減損的受試者，一般為裸鼠或SCID小鼠?？墒褂萌魏芜m當(dāng)?shù)募棺祫?dòng)物受試者，主要通過(guò)便利性和與最終目標(biāo)系統(tǒng)的相似性決定選擇。非人動(dòng)物模型優(yōu)選是嚙齒類動(dòng)物，例如裸鼠，并且影響腫瘤產(chǎn)生的細(xì)胞量一般是從IO6至IO8個(gè)細(xì)胞(參見(jiàn)例如US 6，251，384)。優(yōu)選的所述施用是皮下的并且形成實(shí)體的腫瘤。上述的動(dòng)物模型可用于篩選具有抗腫瘤活性的化合物的方法。優(yōu)選地，施用于所述非人動(dòng)物的腫瘤細(xì)胞由穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的卵巢癌細(xì)胞系，優(yōu)選A2780細(xì)胞組成，其包括包含可操作地連接啟動(dòng)子的編碼熒光蛋白的核酸序列的表達(dá)載體，所述的啟動(dòng)子對(duì)P21激活劑起反應(yīng)，優(yōu)選所述的啟動(dòng)子包括1300bp的p21啟動(dòng)子序列(SEQ ID No. I),更優(yōu)選地,所述的啟動(dòng)子序列由1300bp的p21啟動(dòng)子序列(SEQ ID No. I)組成。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，突光蛋白選自EGFP、EYFP> DsRecU ZsGreen、ZsYellow、HcRed或去穩(wěn)定的突光蛋白，例如pDsRed、pHcRedl、pd2EGFP或pd2EYFP，且在具體的實(shí)施方案中，熒光蛋白由ZsGreen或ZsRed組成。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于體內(nèi)篩選法的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞選自以保藏號(hào)LMBP 5958CB 和 LMBP 5959CB 保藏在 BCCM 的克隆。在備選的實(shí)施方案中，用于體內(nèi)篩選法的腫瘤細(xì)胞是用包括由重組DNA構(gòu)建體組成的啟動(dòng)子序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的，該構(gòu)建體包括一個(gè)上述的調(diào)控序列元件，例如p53應(yīng)答元件，其可操作地連接最小啟動(dòng)子元件，例如最小的白細(xì)胞介素6 (IL6)啟動(dòng)子(phu.IL6Pluc+Plaisance 等人(1997)MCB 17，3733-3743)、最小的 ElB 啟動(dòng)子(可從 Stratagene 商業(yè)購(gòu)買的pMCSluc)或可商業(yè)購(gòu)買的用于螢光素酶的TK啟動(dòng)子(pTKluc Promega)。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于體內(nèi)篩選的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞由穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的結(jié)腸直腸癌細(xì)胞或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的卵巢癌細(xì)胞組成，優(yōu)選A2780細(xì)胞或HCT116細(xì)胞，其包括包含可操作地連接啟動(dòng)子的編碼熒光蛋白的核酸序列的表達(dá)載體，該啟動(dòng)子對(duì)P53激活劑起反應(yīng)，優(yōu)選地所述的啟動(dòng)子包括P53應(yīng)答元件(SEQ ID No. 10)，更優(yōu)選地，所述的啟動(dòng)子由包括p53應(yīng)答元件的最小HSV-TK啟動(dòng)子(SEQ ID No. 13)組成。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，熒光蛋白選自EGFP、EYFP、DsRecU ZsGreen、ZsYellow、HcRed 或去穩(wěn)定的突光蛋白，例如 pDsRed、pHcRedl、pd2EGFP 或pd2EYFP，且在具體的實(shí)施方案中，熒光蛋白由ZsGreen組成。在特定的實(shí)施方案中，用于體內(nèi)方法的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞由用p53RE_TK/pGL3-基本-ZsGreen載體轉(zhuǎn)染的A2780或HCTl 16細(xì)胞組成(圖6)。因此，在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的體內(nèi)篩選法中，本發(fā)明提供已經(jīng)用包含報(bào)道基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞系的用途，其中報(bào)道基因與由重組DNA構(gòu)建體組成的啟動(dòng)子序列可操作地連接,該構(gòu)建體包括可操作地連接到最小啟動(dòng)子元件的調(diào)控序列元件，其特征在于所述的啟動(dòng)子序列對(duì)與腫瘤退化相關(guān)的化合物起反應(yīng)。當(dāng)用于體內(nèi)篩選法時(shí)，施用于所述的非人動(dòng)物的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞必須具有足夠的時(shí)間在所述的非人動(dòng)物中形成腫瘤。腫瘤，特別是用卡鉗可測(cè)量的實(shí)體瘤一般在將穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞施用于非人動(dòng)物后7-20天形成。在具體的實(shí)施方案中，利用根據(jù)本發(fā)明的A2780轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，特別是利用以保藏號(hào)LMBP 5958CB或LMBP 5959CB保藏在BCCM的卵巢癌細(xì)胞，在注射該細(xì)胞后12天獲得卡鉗可測(cè)量的腫瘤。因此，在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供產(chǎn)生非人體內(nèi)動(dòng)物模型的方法以鑒定具有抗腫瘤活性的化合物，所述的方法包括以下步驟將根據(jù)本發(fā)明的腫瘤細(xì)胞施用于非人動(dòng)物，其中一般以包括IO6至IO8個(gè)細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞懸浮液的形式在非人動(dòng)物的皮膚下進(jìn)行注射來(lái)施用根據(jù)本發(fā)明的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞；以及使得所述腫瘤細(xì)胞能夠有足夠的時(shí)間在所述的非人動(dòng)物中形成腫瘤，其中在特定的實(shí)施方案中，利用如上所列出的卵巢癌細(xì)胞，其一般由7-14天組成，更優(yōu)選為9-12天以及特別的為12天?？蓪凑丈鲜龇椒ǐ@得的非人動(dòng)物模型隨后用于鑒定具有抗腫瘤活性的化合物的體內(nèi)方法，所述的方法包括以下步驟將潛在的活性化合物施用于根據(jù)本發(fā)明的非人動(dòng)物，優(yōu)選為用如上所列出的卵巢癌細(xì)胞注射的裸鼠，其中可通過(guò)所有的臨床相關(guān)施用途徑，包括靜脈內(nèi)地、口服地和腹膜內(nèi)地施用潛在的活性化合物；以及通過(guò)測(cè)量報(bào)道基因的表達(dá)來(lái)評(píng)估所述的潛在活性化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響。本說(shuō)明書自始至終的術(shù)語(yǔ)“標(biāo)準(zhǔn)方法”、“標(biāo)準(zhǔn)方案”和“標(biāo)準(zhǔn)步驟”，當(dāng)被用于分子生物學(xué)技術(shù)的范圍內(nèi)時(shí)，被理解為可在普通的實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中找到的方法和操作步驟，所述手冊(cè)例如Current Protocols in Molecular Biology,編輯 F. Ausubel 等人，John Wiley& Sons, Inc. 1994,或 Sambrook, J. , Fritsch, E. F.和 Maniatis, T. , Molecular Clo ning A laboratory manual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, NY 1989。可通過(guò)參考下述的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)更好地理解本發(fā)明，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易地認(rèn)識(shí)到這些只是為了說(shuō)明本發(fā)明，正如在此后的權(quán)利要求中更充分描述的。另外，本申請(qǐng)自始至終引用了多種出版物。因此將這些出版物的公開(kāi)內(nèi)容引入本申請(qǐng)作為參考以更充分地描述本發(fā)明所涉及的現(xiàn)有技術(shù)水平。實(shí)施例I材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)和試劑在補(bǔ)充有10% FCS, 2mM L-谷氨酰胺和艮他霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37°C具有5% CO2的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)A2780細(xì)胞(ATCC)。在補(bǔ)充有10% FCS, 2mM L-谷氨酰胺和艮他霉素的Mc Coy’s 5a培養(yǎng)基中，在37°C具有5% CO2的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HCT116細(xì)胞(ATCC)。所有的細(xì)胞培養(yǎng)溶液由Gibc0-BRL(GaitherSburg，MD)提供。其它的材料由Nunc提供。產(chǎn)生4500kb的p21啟動(dòng)子片段和1300kb的p21啟動(dòng)子片段從增殖的A2780細(xì)胞提取基因組DNA，并且用作嵌套式PCR分離p21啟動(dòng)子的模板。在55 °C的退火溫度，利用寡核苷酸對(duì)GAGGGCGCGGTGCTTGG (SEQ IDNo. 2)和 TGCCGCCGCTCTCTCACC (SEQ ID No. 3)，以基因組 DNA 作為模板進(jìn)行 20 個(gè)循環(huán)的第一擴(kuò)增。用寡核苷酸 TCGGGTACCGAGGGCGCGGTGCTTGG(SEQ ID No. 4)和ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC (SEQ ID No. 5)在 88 °C 退火再擴(kuò)增所得到的包含相對(duì)于TATA框-4551至+88片段的4. 5kb片段20個(gè)循環(huán)，產(chǎn)生4. 5kb的片段，隨后用寡核苷酸對(duì) TCGGGTACCGGTAGATGGGAGCGGATAGACACATC(SEQ ID No. 6)和ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC (SEQ ID No. 7)在 88°C退火擴(kuò)增 20 個(gè)循環(huán)，產(chǎn)生 I. 3kb 的片段，其包含相對(duì)于TATA框的-1300至+88的片段。將存在于寡核苷酸中的限制酶切位點(diǎn)XhoI和KpnI (加下劃線的序列)用于進(jìn)行亞克隆。p21啟動(dòng)子構(gòu)建體從pGL3_基本中移去螢光素酶報(bào)道基因并在KpnI和XbaI限制酶切位點(diǎn)由ZsGreen報(bào)道基因替代(來(lái)自pZsGreenl_Nl質(zhì)粒)。通過(guò)將人p21啟動(dòng)子區(qū)域的上述I. 3kb片段在XhoI和KpnI位點(diǎn)插入pGL3-基本-ZsGreen來(lái)構(gòu)建pGL3_基本-ZsGreen-1300。所有的限制性內(nèi)切酶均由Boehringer Manheim(德國(guó))提供。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染將A2780細(xì)胞以2X IO5個(gè)細(xì)胞的密度鋪平板到6孔平板中，培養(yǎng)24小時(shí)，并如制造商所描述的利用Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Brussels,比利時(shí))用2yg的pGL3-基本-ZsGreen-1300 和 O. 2 μ g 的 pSV2neo 載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用 G418 (Gibco-BRL，Gaithersburg,MD)選擇轉(zhuǎn)染細(xì)胞10天并使單細(xì)胞懸浮液生長(zhǎng)。3周后,獲得80個(gè)單克隆。誘導(dǎo)P 21啟動(dòng)子活性擴(kuò)增A2780轉(zhuǎn)染的庫(kù)和所選擇的80個(gè)克隆并且以每孔10000個(gè)細(xì)胞接種到96孔平板中。接種后24小時(shí)，用靶定的化合物(影響最接近的p21啟動(dòng)子區(qū)域中的spl位點(diǎn))或DNA破壞試劑(影響p53應(yīng)答元件)處理細(xì)胞另外的24小時(shí)。隨后，用4% PFA固定細(xì) 胞30秒并用Hoechst染料復(fù)染。p21啟動(dòng)子的激活導(dǎo)致ZsGreen產(chǎn)生并且因此導(dǎo)致產(chǎn)生熒光，其通過(guò) Ascent Fluoroskan (Thermo Labsystems, Brussels,比利時(shí))和通過(guò)突光顯微鏡(Zeiss)監(jiān)控。體內(nèi)評(píng)估將所選擇的克隆(IO7個(gè)細(xì)胞/200 μ I)皮下注射入裸鼠的脅腹，12天后獲得可用卡尺測(cè)量的腫瘤。從第12天開(kāi)始,在6天期間使動(dòng)物每日一次口服溶劑、20mpk Mitsui (也稱為 MS-275-Shering-注冊(cè)號(hào) 209783-80-2)或 40mpk JNJX(各自為 10、10 和 4 只動(dòng)物)。通過(guò)內(nèi)部顯影的自動(dòng)全體成像系統(tǒng)(裝有GFP濾色片并偶聯(lián)有CXD照相機(jī)型JAI CV-M90的突光立體顯微鏡型Olympus SZX12,其中CCD照相機(jī)由以來(lái)自National Instruments 的IMAQ圖像軟件為基礎(chǔ)的軟件包控制)評(píng)估腫瘤的熒光。結(jié)果通過(guò)HDAC抑制劑體外誘導(dǎo)p21 1300bp的啟動(dòng)子片段如M&M 所描述的用 TSA(KT7M)、博來(lái)霉素(15mU)和 Mitsui (I(T6M)處理 A2780 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的庫(kù)和所選擇的80個(gè)克隆。80個(gè)克隆中有6個(gè)克隆對(duì)TSA和Mitsui處理起反應(yīng)。這些克隆中的4個(gè)顯示如此低的基礎(chǔ)熒光表達(dá)，以致于用FlUOToskan不可檢測(cè)，但可利用熒光顯微鏡通過(guò)人工評(píng)估ZsGreen的產(chǎn)生而進(jìn)行選擇。可測(cè)量其它2個(gè)克隆并且顯示經(jīng)TSA (1(Γ7)的5倍誘導(dǎo)和經(jīng)Mitsui (1(Γ6)的I. 2-1. 5倍誘導(dǎo)。在DNA破壞試劑(喜樹(shù)堿、博來(lái)霉素和阿霉素)和HDAC抑制劑(TSA、Mitsui、化合物X和Saha)的劑量應(yīng)答中評(píng)估這6個(gè)克隆?？寺顯示應(yīng)答10_7TSA的5倍誘導(dǎo)，應(yīng)答IO-6M Mitsui的I. 8倍和應(yīng)答IO-6M JNJX的3倍誘導(dǎo)(圖I)。DNA破壞試劑不能激活1300bp片段的p21啟動(dòng)子(圖I)?？寺?顯示完全相同的應(yīng)答(圖I)。由于系統(tǒng)的靈敏性問(wèn)題，不能通過(guò)FlUOToskan測(cè)量克隆2、3、4和6的誘導(dǎo)，但可利用熒光顯微鏡顯現(xiàn)熒光的增加(數(shù)據(jù)未示出)。通過(guò)HDAC抑制劑體內(nèi)誘導(dǎo)p21啟動(dòng)子如M&M所描述的用克隆1、2、3和5注射小鼠并服用化合物(溶劑、20mpk Mitsui或40mpk JNJ’99)。在克隆2和3中基礎(chǔ)的ZsGreen表達(dá)和誘導(dǎo)太低而不能通過(guò)自動(dòng)全體成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)?？蓽y(cè)量克隆I和5的基礎(chǔ)熒光，且第一劑施用后3天ZsGreen的誘導(dǎo)是非常明顯的，并且5天后達(dá)到平臺(tái)(圖2)。討論已經(jīng)顯示幾種已知的組蛋白脫乙酰酶抑制劑，例如TSA、Mitsui和SAHA，誘導(dǎo)相對(duì)于TATA框的-60bp至+40bp的鼠p21waf1’eipl啟動(dòng)子的反式激活。這個(gè)區(qū)域存在于我們的p2 lwafl'cipl 1300bp啟動(dòng)子構(gòu)建體中。我們的數(shù)據(jù)證實(shí)這些試劑在pGL3-基本-ZsGreen-1300轉(zhuǎn)染的A2780細(xì)胞中體外誘導(dǎo)ZsGreen產(chǎn)生。DNA破壞試劑(喜樹(shù)堿、博來(lái)霉素和阿霉素)通過(guò)P2rafUipl啟動(dòng)子的依賴p53的調(diào)節(jié)發(fā)揮其活性。P53應(yīng)答元件位于不存在于1300bp啟動(dòng)子片段中區(qū)域的ρ21 η’Μρ1啟動(dòng)子中的更下游。這解釋了該系統(tǒng)對(duì)DNA破壞試劑的非反應(yīng)性。通過(guò)這些數(shù)據(jù)我們推斷出我們的報(bào)道系統(tǒng)提供用于研究涉及組蛋白脫乙?；姆肿邮录哪Ｐ鸵约敖沂玖梭w外報(bào)道系統(tǒng)的特異性。這個(gè)概念也可用來(lái)通過(guò)改變應(yīng)答元件而特異地測(cè)試DNA破壞試劑或任何其它的藥物。化合物的體內(nèi)作用是更加復(fù)雜的，并且需要?jiǎng)趧?dòng)密集型的動(dòng)物研究來(lái)確定該化合物是否進(jìn)入循環(huán)，以活性形式到達(dá)腫瘤，以及腫瘤內(nèi)的濃度是否足夠高以發(fā)揮其生物活 性。已經(jīng)在更復(fù)雜的PK/ro研究中顯示Mitsui化合物可到達(dá)腫瘤而且在腫瘤中達(dá)到的濃度足夠高以致于阻止腫瘤的生長(zhǎng)。在這個(gè)報(bào)告中，我們表明處理4天后，Mitsui化合物在pGL3-基本-ZsGreen-1300轉(zhuǎn)染的A2780異種移植物中誘導(dǎo)熒光，意味著該化合物到達(dá)腫瘤并且體內(nèi)發(fā)揮其生物活性。這證實(shí)這個(gè)系統(tǒng)是十分有力的體內(nèi)工具，其使得能夠?qū)w內(nèi)活性做出快速和精確的結(jié)論，使得能夠在藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程中的早期時(shí)間點(diǎn)評(píng)估化合物而不用進(jìn)行耗時(shí)和消耗化合物的PK/ro研究。實(shí)施例2材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)和試劑在補(bǔ)充有10% FCS, 2mM L-谷氨酰胺和艮他霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37°C具有5% CO2的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)A2780細(xì)胞(ATCC)。在補(bǔ)充有10% FCS, 2mM L-谷氨酰胺和艮他霉素的Mc Coy’s 5a培養(yǎng)基中，在37°C具有5% CO2的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HCT116細(xì)胞(ATCC)。所有的細(xì)胞培養(yǎng)溶液均由Gibco-BRL (Gaithersburg，MD)提供。其它的材料由Nunc提供。產(chǎn)生p53應(yīng)答元件從Eurogentec 購(gòu)買下列寡核苷酸(oligo) :p53RE 正向 CCCTGCCTGGACTTGCCTGGSTCGACCCTGCCTGGACTTGCCTGGC (SEQ ID No. 8)和 p53RE 反向 TCGAGCCAGGCAAGTCCAGGCAGGGTCGACCCAGGCAAGTCCAGGCAGGGAGCT(SEQ ID No. 9)。通過(guò)每隔5分鐘逐步降低退火溫度，從65°C開(kāi)始經(jīng)過(guò)50°C、40°C、30°C至20°C的最終溫度，在退火緩沖液(150mM tris pH7. 6，15mMMgCl2, 23mM DTT)中使寡核苷酸對(duì)退火。為了克隆的目的，形成具有Sacl/Xhol突出端的片段(應(yīng)答元件是加下劃線的序列)(SEQ ID No. 10)TCCCTG CCTGGACTTG CCTGGGTCGA CCCTGCCTGG ACTTGCCTGG CCTCGAGGGACGGACCTGAAC GGACCCAGCT GGGACGGACC TGAACGGACC GAGCTC構(gòu)建體從PGL3-基本中移除螢光素酶報(bào)道基因并在KpnI和XbaI限制酶切位點(diǎn)由ZsGreen報(bào)道基因替代(來(lái)自pZsGreenl-Nl質(zhì)粒)。
通過(guò)PCR獲得HSV-TK的最小啟動(dòng)子(單純皰疹病毒的胸苷激酶基本啟動(dòng)子)，使用pTK Luc質(zhì)粒(Clontech#6252-l)作為模板。設(shè)計(jì)引物以擴(kuò)增HSV-TK最小啟動(dòng)子和pTKLuc質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)。在58°C的退火溫度，利用寡核苷酸對(duì)GTACCGAGCTCTTACGCGTG (SEQID No. 11)和 GTGGATCCCTGCTTCATCCCCGTGGC (SEQ ID No. 12)，以質(zhì)粒作為模板進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增。由Roche提供擴(kuò)展的高保真度PCR系統(tǒng)(Expand High Fidelity PCR System)。將存在于寡核苷酸中的限制酶切位點(diǎn)SacI和BamHI (加下劃線的序列)用于進(jìn)行亞克隆。通過(guò)將上述197bp的PCR片段在Sacl/Bglll位點(diǎn)插入pGL3_基本-ZsGreenl-Nl，構(gòu)建了構(gòu)建體TK/pGL3-基本-ZsGreen。所有的限制性內(nèi)切酶由Roche (德國(guó))提供。然后在TK/pGL3_基本-ZsGreen載體的Sacl/Xhol克隆位點(diǎn)，在TK啟動(dòng)子前克隆p53應(yīng)答元件以獲得構(gòu)建體p53RE_TK/pGL3-基本-ZsGreen (圖6)。穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染將A2780細(xì)胞和HCTl 16細(xì)胞以4X IO5個(gè)細(xì)胞的密度鋪平板到6孔平板中，培養(yǎng)24 小時(shí)，并如制造商所述，利用 Lipofectamine 和 Plus Reagent (Invitrogen, Brussels,比 利時(shí))用 2 μ g 的 p53RE_TK/pGL3-基本-ZsGreen 和 O. 2 μ g 的 pMCI-neo-Poly A 載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用G418 (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)選擇轉(zhuǎn)染的細(xì)胞16天并使單細(xì)胞懸浮液生長(zhǎng)。3周后，從轉(zhuǎn)染的HCT116細(xì)胞獲得60個(gè)單克隆，并從轉(zhuǎn)染的A2780細(xì)胞獲得40個(gè)單克隆。誘導(dǎo)p53RE_tk 活性擴(kuò)增A2780和HCT116轉(zhuǎn)染的庫(kù)以及所選擇的克隆并且以每孔20000個(gè)細(xì)胞接種到96孔平板中。接種后24小時(shí)，用DNA破壞試劑(影響p53應(yīng)答)另外處理細(xì)胞24小時(shí)。p53RE_tk的激活導(dǎo)致ZsGreen產(chǎn)生并且因此導(dǎo)致產(chǎn)生熒光，其通過(guò)AscentFluoroskan(Thermo Labsystems, Brussels,比利時(shí))和通過(guò)突光顯微鏡(Zeiss)進(jìn)行監(jiān)控。結(jié)果通過(guò)DNA破壞試劑體外誘導(dǎo)p53RE_tk用放線菌素D(10ng/ml)處理HCT116和A2780的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的庫(kù)以及所選擇的克隆。所選擇的克隆中有6個(gè)HCT116克隆和2個(gè)A2780克隆對(duì)放線菌素D處理起反應(yīng)。對(duì)于這8個(gè)克隆，可用Fluoroskan檢測(cè)到對(duì)該處理反應(yīng)的至少兩倍熒光誘導(dǎo)。特別地A2780克隆36和HCTl 16克隆5和36顯示可檢測(cè)的低的基礎(chǔ)熒光表達(dá)，其對(duì)放線菌素處理反應(yīng)有強(qiáng)的誘導(dǎo)倍數(shù)(圖3)。
權(quán)利要求
1.一種已經(jīng)用包含可操作地連接啟動(dòng)子的報(bào)道基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞，其中所述的啟動(dòng)子還控制與腫瘤退化、腫瘤生長(zhǎng)穩(wěn)定化或轉(zhuǎn)移性生長(zhǎng)的抑制相關(guān)的蛋白的表達(dá)，其中所述的啟動(dòng)子由P21的1300bp啟動(dòng)子片段組成，其特征在于所述的啟動(dòng)子片段不包括P53應(yīng)答元件，其中所述報(bào)道基因由熒光蛋白組成，且其中所述細(xì)胞 -當(dāng)被植入或注射入動(dòng)物時(shí)，保持形成腫瘤的能力； -產(chǎn)生與腫瘤退化相關(guān)的蛋白的內(nèi)源應(yīng)答平行的信號(hào)； -產(chǎn)生具有優(yōu)良信噪比的信號(hào)，以使得能夠在體內(nèi)實(shí)時(shí)分析藥物物質(zhì)的動(dòng)力學(xué)效應(yīng)； -產(chǎn)生具有優(yōu)良可重復(fù)性的信號(hào)以提供動(dòng)物之間的低變異性；以及 -產(chǎn)生能夠使誘導(dǎo)的應(yīng)答非侵入性成像的信號(hào)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的腫瘤細(xì)胞，其中穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞由穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的卵巢癌細(xì)胞或結(jié)腸直腸癌細(xì)胞組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2的腫瘤細(xì)胞，其中所述熒光蛋白選自EGFP、EYFP、DsRed,ZsGreen、ZsYellow、HcRed 或去穩(wěn)定的突光蛋白，例如 pDsRed、pHcRedl、pd2EGFP 或pd2EYFP。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任何一項(xiàng)的腫瘤細(xì)胞，其于2003年I月20日以pGL3_基本-ZsGreen-1300-克隆I保藏在比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心，保藏號(hào)為L(zhǎng)MBP 5958CB。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任何一項(xiàng)的腫瘤細(xì)胞，其于2003年I月20日以pGL3_基本-ZsGreen-1300-克隆2保藏在比利時(shí)微生物協(xié)調(diào)保藏中心，保藏號(hào)為L(zhǎng)MBP 5959CB。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至5中任何一項(xiàng)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞在制備用于篩選化合物藥物活性的非人動(dòng)物模型中的用途。
7.篩選化合物的抗腫瘤活性的體外方法，包括步驟 將根據(jù)權(quán)利要求I至5中任何一項(xiàng)的腫瘤細(xì)胞與待測(cè)試的化合物接觸；以及 測(cè)量報(bào)道基因的表達(dá)。
8.篩選化合物的藥物活性的方法，包括步驟 將潛在的活性化合物施用于根據(jù)權(quán)利要求I至5中任何一項(xiàng)的腫瘤細(xì)胞；以及 通過(guò)測(cè)量報(bào)道基因的表達(dá)來(lái)評(píng)估所述化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于在體內(nèi)快速鑒定藥物活性化合物的動(dòng)物模型。在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供用包含可操作地連接啟動(dòng)子的報(bào)道基因，優(yōu)選熒光蛋白的表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞系，其中啟動(dòng)子還控制與腫瘤退化、腫瘤生長(zhǎng)穩(wěn)定化或轉(zhuǎn)移性生長(zhǎng)的抑制相關(guān)的蛋白的表達(dá)，其特征在于當(dāng)被植入或注射入非人動(dòng)物中時(shí)，所述的細(xì)胞系能夠形成腫瘤。與傳統(tǒng)的體內(nèi)模型相比，本發(fā)明的不同點(diǎn)在于報(bào)道基因不是組成型表達(dá)的，而只有在暴露于導(dǎo)致與腫瘤退化、腫瘤生長(zhǎng)穩(wěn)定化或轉(zhuǎn)移性生長(zhǎng)的抑制相關(guān)的蛋白或酶表達(dá)的測(cè)試化合物后才會(huì)表達(dá)。只有當(dāng)待測(cè)試的化合物進(jìn)入循環(huán)并浸潤(rùn)腫瘤時(shí)，如果其促進(jìn)與腫瘤退化相關(guān)的蛋白表達(dá)并且所述蛋白的啟動(dòng)子可操作地連接報(bào)道基因，就可能產(chǎn)生報(bào)道信號(hào)。
文檔編號(hào)A01K67/027GK102766602SQ201210223769
公開(kāi)日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2004年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月5日
發(fā)明者A·F·瓦爾克斯, A·O·A·馬里恩, A·T·J·貝利恩, J·阿茨 申請(qǐng)人:詹森藥業(yè)有限公司