專利名稱：用低濃度的卡那霉素溶液浸種篩選和鑒定轉(zhuǎn)基因棉花的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用低濃度的卡那霉素溶液浸種篩選和鑒定轉(zhuǎn)基因棉花的方法，屬于棉花轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前棉花轉(zhuǎn)基因植株的鑒定方法有多種，其中對(duì)帶有II標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因后代材料進(jìn)行的篩選，主要是在苗期利用卡那霉素溶液(Kanamycin)點(diǎn)涂植株幼葉，以幼葉是否變黃來判斷，為防止漏涂或涂抹不均勻而出現(xiàn)假陽(yáng)性植株，需要在花鈴期以前對(duì)材料涂抹2 3次，因此從大量的轉(zhuǎn)基因材料中篩選出轉(zhuǎn)基因植株，工作量很大、準(zhǔn)確性較差。李俊蘭(華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2003，18(2) : 118)曾報(bào)道用卡那霉素溶液通過浸種鑒定轉(zhuǎn)基因種子，但她篩選時(shí)的浸種時(shí)間較短(8h)，需要用很高濃度的卡那霉素(5000-7500mg/ L) 溶液，其成本很高，并且附加O. 2%吐溫的去離子水配制，也沒有說明種子量與卡那霉素溶液的比例關(guān)系，其判斷的指標(biāo)為子葉加厚、葉色變深或子葉出現(xiàn)黃色斑塊，表現(xiàn)為判斷指標(biāo)多、不單一，既有數(shù)量性狀又有質(zhì)量性狀，掌握起來難度大、不易判斷出陽(yáng)性植株，對(duì)推廣應(yīng)用存在許多不利因素，并且通過浸種篩選以后，還要進(jìn)行I 2次的用卡那霉素溶液點(diǎn)涂幼葉篩選，比較繁瑣并沒有完全擺脫用卡那霉素溶液點(diǎn)涂幼葉的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，而提供一種成本低廉、操作簡(jiǎn)單、過程標(biāo)準(zhǔn)化、準(zhǔn)確可靠、容易掌握、出結(jié)果早的用低濃度的卡那霉素溶液浸種篩選和鑒定轉(zhuǎn)基因棉花的方法。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案
一種用低濃度的卡那霉素溶液浸種篩選和鑒定轉(zhuǎn)基因棉花的方法，其特征在于步驟如
下
(1)浸種處理
取轉(zhuǎn)化含有耶 - II標(biāo)記基因的棉花種子，用濃度為1000-1500 mg/ 的卡那霉素溶液在24-26°C溫度下浸種3d，所述卡那霉素溶液與棉花種子的比例為每50ml卡那霉素溶液浸10-12粒棉花種子；
(2)播種
將浸泡后的轉(zhuǎn)基因棉花種子用自來水沖洗后播種到裝有蛭石的紙桶中或直接播種到蛭石中；
(3)篩選轉(zhuǎn)基因植株
當(dāng)出苗3-5d后，根據(jù)棉花子葉上有無白化斑判斷是否為轉(zhuǎn)基因植株，將有白化斑的棉花苗即陰性植株拔除，棉花子葉上沒有白化斑的綠苗即為陽(yáng)性植株；
(4)分子鑒定對(duì)上述第(3)步中篩選的陽(yáng)性植株再通過PCR檢測(cè)進(jìn)一步確認(rèn)；
(5)移栽
將進(jìn)一步確認(rèn)后的陽(yáng)性植株煉苗后移栽到田間。本發(fā)明的有益效果是成本較低、操作簡(jiǎn)單、過程標(biāo)準(zhǔn)化、準(zhǔn)確可靠、容易掌握、出結(jié)果早。


圖I為用卡那霉素溶液浸種處理的照片。圖2為篩選陽(yáng)性植株(箭頭所示)和陰性植株的照片。圖3為陽(yáng)性植株煉苗移栽后照片。
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圖4為篩選出的陽(yáng)性植株的PCR檢測(cè)圖。圖5為對(duì)部分篩選出的陽(yáng)性植株southern blot檢測(cè)圖。在圖5中，M為marker，CK+為質(zhì)粒DNA，CK_為陰性對(duì)照，I 9為轉(zhuǎn)基因材料。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :
一種用低濃度的卡那霉素溶液浸種篩選和鑒定轉(zhuǎn)基因棉花的方法，步驟如下
(1)浸種處理
取轉(zhuǎn)化含有II標(biāo)記基因的棉花種子，用濃度為1000 mg/ 的卡那霉素溶液在
24-26°C溫度下浸種3d，所述卡那霉素溶液與棉花種子的比例為每50ml卡那霉素溶液浸10-12粒棉花種子；
(2)播種
將浸泡后的轉(zhuǎn)基因棉花種子用自來水沖洗后播種到裝有蛭石的紙桶中或直接播種到蛭石中；
(3)篩選轉(zhuǎn)基因植株
當(dāng)出苗3-5d后，根據(jù)棉花子葉上有無白化斑判斷是否為轉(zhuǎn)基因植株，將有白化斑的棉花苗即陰性植株拔除，棉花子葉上沒有白化斑的綠苗即為陽(yáng)性植株；
(4)分子鑒定
對(duì)上述第(3)步中篩選的陽(yáng)性植株再通過PCR檢測(cè)進(jìn)一步確認(rèn)；
(5)移栽
將進(jìn)一步確認(rèn)后的陽(yáng)性植株煉苗后移栽到田間。實(shí)施例2:
實(shí)施例2與實(shí)施例I不同的是采用濃度為1500 mg/ 的卡那霉素溶液。實(shí)施例2的檢測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)100%。
權(quán)利要求
1.一種用低濃度的卡那霉素溶液浸種篩選和鑒定轉(zhuǎn)基因棉花的方法，其特征在于步驟如下 (1)浸種處理 取轉(zhuǎn)化含有耶II標(biāo)記基因的棉花種子，用濃度為1000-1500 mg/1的卡那霉素溶液在24-26°C溫度下浸種3d，所述卡那霉素溶液與棉花種子的比例為每50ml卡那霉素溶液浸10-12粒棉花種子； (2)播種 將浸泡后的轉(zhuǎn)基因棉花種子用自來水沖洗后播種到裝有蛭石的紙桶中或直接播種到蛭石中； (3)篩選轉(zhuǎn)基因植株 當(dāng)出苗3-5d后，根據(jù)棉花子葉上有無白化斑判斷是否為轉(zhuǎn)基因植株，將有白化斑的棉花苗即陰性植株拔除，棉花子葉上沒有白化斑的綠苗即為陽(yáng)性植株； (4)分子鑒定 對(duì)上述第(3)步中篩選的陽(yáng)性植株再通過PCR檢測(cè)進(jìn)一步確認(rèn)； (5)移栽 將進(jìn)一步確認(rèn)后的陽(yáng)性植株煉苗后移栽到田間。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用低濃度的卡那霉素溶液浸種篩選和鑒定轉(zhuǎn)基因棉花的方法，技術(shù)要點(diǎn)如下取轉(zhuǎn)化含有nptⅡ標(biāo)記基因的棉花種子，用濃度為1000-1500mg/l的卡那霉素溶液在24-26℃溫度下浸種3d，所述卡那霉素溶液與轉(zhuǎn)基因棉花種子的比例為每50ml卡那霉素溶液浸8-12粒轉(zhuǎn)基因棉花種子；將浸泡后的轉(zhuǎn)基因棉花種子用自來水沖洗后播種到裝有蛭石的紙桶中；當(dāng)出苗3d后，根據(jù)棉花子葉上有無白化斑判斷是否為轉(zhuǎn)基因植株，將有白化斑的轉(zhuǎn)基因棉花苗即陰性植株拔除，轉(zhuǎn)基因棉花子葉上沒有白化斑的綠苗即為陽(yáng)性植株，然后進(jìn)行分子鑒定和移栽。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是成本較低、操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確可靠、容易掌握、出結(jié)果早。
文檔編號(hào)A01H1/04GK102696477SQ201210233348
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月6日
發(fā)明者劉永偉, 呂孟雨, 孫果忠, 張俊敏, 張歡歡, 徐顯, 朱金勇, 楊帆, 柴建芳, 王海波, 石學(xué)萍, 董福雙, 趙和, 韓秋芬 申請(qǐng)人:河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所