一種大量繁育同源純合四倍體鐵皮石斛的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種大量繁育同源純合四倍體鐵皮石斛的方法，選用常規(guī)鐵皮石斛組培過程中產(chǎn)生的特定原球莖，將其在無菌條件下轉(zhuǎn)入含秋水仙素的培養(yǎng)基中進(jìn)行四倍體誘變處理，然后轉(zhuǎn)入原球莖誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)出再生植株，按常規(guī)方式進(jìn)行栽培管理，對再生植株的根尖染色體進(jìn)行檢測，篩選出純合四倍體植株，并對純合四倍體植株進(jìn)行性狀篩選，切取性狀優(yōu)良的四倍體植株的莖段轉(zhuǎn)接入原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，續(xù)代后將原球莖進(jìn)行誘導(dǎo)分化出再生純合四倍體無毒植株。本發(fā)明培育方法簡便易行，不受季節(jié)氣候影響，縮短了常規(guī)育種的時(shí)間，一次性即可獲得數(shù)萬株優(yōu)質(zhì)同源純合四倍體石斛種苗，可大大提高鐵皮石斛的產(chǎn)量和品質(zhì)。
【專利說明】—種大量繁育同源純合四倍體鐵皮石斛的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種鐵皮石斛新品種培育方法，尤其是一種大量繁育同源四倍體鐵皮石斛的方法，屬于生物技術(shù)育種領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是傳統(tǒng)名貴珍稀中藥材,具有益胃生津、滋陰清熱、增強(qiáng)免疫力、消除腫瘤、抑制癌癥等獨(dú)特的功效。1000多年前的《道藏》將鐵皮石斛列為“中華九大仙草之首”，其在民間也素有“救命仙草”之稱，國際藥用植物界將之譽(yù)為“藥界大熊貓”。雖其功效獨(dú)特但目前野生資源已瀕臨枯竭，加之人工種植投入高，且現(xiàn)有二倍體石斛種質(zhì)難以保證、生長緩慢，成活率低下，造成人工種植鐵皮石斛的產(chǎn)量低，品質(zhì)參次不齊，農(nóng)戶種植積極性低下，國內(nèi)市場供需矛盾日益突出，而現(xiàn)代多倍體育種技術(shù)為繁育出高產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)，藥用成份高的優(yōu)質(zhì)鐵皮石斛提供了可能，通過多倍體育種技術(shù)可大大提升鐵皮石斛的種植積極性，促進(jìn)我國石斛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
[0003]經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛四倍體研究鮮有報(bào)道，僅發(fā)現(xiàn)專利200710061225.8報(bào)道了鐵皮石斛四倍體的培育方法，雖此法誘變率較高但存在一定的缺陷:a、以石斛種子為出發(fā)點(diǎn)，受季節(jié)氣候影響有一定的局限性。b、育種周期長，從授粉、播種、誘變、種植、培育、育種到產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用需五年以上的時(shí)間。C、四倍體植株中嵌合四倍體的頻率較高，種質(zhì)難以保證d、一次僅可獲得百株四倍體植株，僅適用于實(shí)驗(yàn)室研究階段，難以滿足實(shí)際產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)需求，需進(jìn)一步改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對傳統(tǒng)方法的不 足，本發(fā)明提供了一種大量繁育同源純合四倍體鐵皮石斛的方法，本方法簡單有效易行，縮短了傳統(tǒng)四倍體育種時(shí)間，大大提高傳統(tǒng)四倍體育種的純合性
和培育產(chǎn)量。
[0005]為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案:一種大量繁育同源純合四倍體鐵皮石斛的方法，其特征在于包括以下步驟:選用石斛組培續(xù)代1~4代過程中產(chǎn)生的黃綠色且沒有莖尖分化的原球莖，用秋水仙素進(jìn)行四倍體誘變，處理后轉(zhuǎn)入原球莖分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)出再生植株，按常規(guī)方式進(jìn)行栽培管理，對再生植株的根尖染色體進(jìn)行檢測，篩選出純合四倍體植株，切取具有優(yōu)良性狀的純合四倍體植株的莖段，轉(zhuǎn)接入原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，續(xù)代三次后將原球莖進(jìn)行誘導(dǎo)分化出再生四倍體植株。
[0006]優(yōu)選，所述的四倍體誘變處理為，在含0.0r0.06wt%秋水仙堿的1/3~1/2MS (MS基本培養(yǎng)基的中大量元素濃度減為1/3~1/2)液體培養(yǎng)基中誘變處理6(T72h，優(yōu)選是含
0.05wt%秋水仙堿的1/3~1/2MS液體培養(yǎng)基。
[0007]優(yōu)選，所述的原球莖分化培養(yǎng)基為:萘乙酸(NAA) 0.5^1.5mg/L+花寶I號
0.4~1.0g/L+蔗糖2-4wt%+香蕉10~15wt%的1/3~1/2MS固體培養(yǎng)基。
[0008]作為改進(jìn)，所述的切取具有優(yōu)良性狀的純合四倍體植株莖段，其切方法為從相連的兩個(gè)莖節(jié)節(jié)點(diǎn)處斜切莖段，將帶有兩個(gè)斜切口的莖段水平接種于原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每個(gè)母瓶中接種一個(gè)莖段。
[0009]優(yōu)選，所述的原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成為1/31/2MS+6-芐氨基腺嘌呤(6-BA) 0.2~0.5mg/L+NAA0.3~0.6mg/L+ 活性炭 0.5~1.5g/L
[0010]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:采用石斛組培過程中產(chǎn)生的原球莖為材料進(jìn)行四倍體誘變，不受季節(jié)氣候的影響，對根尖染色體鏡檢后用流式細(xì)胞儀篩選出純合四倍體植株，將性狀優(yōu)良的四倍體植株的莖段轉(zhuǎn)接愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，經(jīng)續(xù)代、分化一次性即可獲得數(shù)萬株優(yōu)質(zhì)純合同源四倍體鐵皮石斛種苗，本方法簡單有效易行，縮短了傳統(tǒng)四倍體育種時(shí)間，大大提高傳統(tǒng)四倍體育種的純合性,可以大量繁育同源純合四倍體鐵皮石斛，提高了鐵皮石斛的品質(zhì)和產(chǎn)量。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1是黃綠色原球莖照片；
[0012]圖2是四倍體植株照片；
[0013]圖3是二倍體2n=38染色體的照片；
[0014]圖4是四倍體染色體2n=76的照片；
【具體實(shí)施方式】
[0015]以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0016]一種大量繁育同源純合四倍體鐵皮石斛的方法，包括以下步驟:
[0017]I)選取原球莖:選取在石斛組培續(xù)代1~4代過程中產(chǎn)生的原球莖，要求選取黃綠色且沒有原球莖尖分化的原球莖。
[0018]2)四倍體誘變處理:無菌條件下將選取的原球莖轉(zhuǎn)入含有0.05%秋水仙堿的1/3~1/2MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行誘變處理60~72h。
[0019]3)原球莖的分化誘導(dǎo):將誘變處理過的原球莖用無菌水沖洗3飛次，轉(zhuǎn)接于含ΝΑΑ0.5~L 5mg/L+花寶I號0.5~0.8g/L+蔗糖2~4wt%+香蕉10~15wt%的1/3~1/2MS固體培養(yǎng)基中，在光照強(qiáng)度1500LUX，光照時(shí)間12h/d，溫度23~27°C的條件下培養(yǎng)，中間續(xù)代一次，待植株長至3飛cm移栽進(jìn)行正常管理栽培。
[0020]4)四倍體的鑒定與篩選:對再生植株進(jìn)行編號標(biāo)記后，對標(biāo)記植株根尖的染色體進(jìn)行鏡檢，染色體鏡檢結(jié)果為2n=76的植株是誘變成功的四倍體植株，進(jìn)而用流式細(xì)胞儀從中篩選出純合四倍體株系。
[0021]5)四倍體植株原球莖的誘導(dǎo):在無菌條件下切取性狀優(yōu)良的純合四倍體植株的莖段，切取莖段要求從相連的兩個(gè)莖節(jié)節(jié)點(diǎn)處斜切莖段，將帶有兩個(gè)斜切口的莖段水平接種于原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(1/3~1/2MS+6-BA0.2~0.5mg/L+NAA0.3~0.5mg/L+活性炭
0.5~1.5g/L。)，每個(gè)母瓶中接種一個(gè)莖段。
[0022]6)原球莖的分化誘導(dǎo):誘導(dǎo)出的原球莖基于步驟3所述的分化培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)分化，半年后可一次性獲得數(shù)萬株優(yōu)質(zhì)四倍體鐵皮石斛無毒種苗。
[0023]實(shí)施例:
[0024]選取選取在石斛組培續(xù)代第I代過程中產(chǎn)生的黃綠色且沒有莖尖分化的原球莖，無菌條件下將選取的原球莖轉(zhuǎn)入含有0.05%秋水仙堿的1/3~1/2MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行誘變處理60h。在超凈工作臺上將誘變處理過的原球莖用無菌水沖洗3次，轉(zhuǎn)接于含NAA1.0mg/L+花寶I號0.6g/L+蔗糖3wt%+香蕉12wt%的1/3~1/2MS固體培養(yǎng)基中，在光照強(qiáng)度1500Lux，光照時(shí)間12h/d，溫度24±1°C的條件下培養(yǎng)，30d后續(xù)代一次，待植株長至3cm后煉苗7天，編號后移栽入種植基地進(jìn)行正常管理栽培。
[0025]半年后選取長勢好、莖粗大的植株的根尖進(jìn)行鏡檢，染色體鏡檢結(jié)果為2n=76的植株是誘變成功的四倍體植株，用流式細(xì)胞儀從四倍體植株中篩選出純合四倍體株系。
[0026]a、在無菌條件下切取編號為L-99的純合四倍體植株的莖段(切取莖段時(shí)從相連的兩個(gè)莖節(jié)節(jié)點(diǎn)處斜切，下同)，將切取的4段莖段接種于含6-BA0.2mg/L+NAA0.3mg/L+活性炭0.5g/L的1/3~1/2MS固體培養(yǎng)基中，在光照強(qiáng)度1500Lux，光照時(shí)間12h/d，溫度24± 1°C的條件下培養(yǎng)35d后誘導(dǎo)出原球莖，將原球莖續(xù)代2次后轉(zhuǎn)入原球莖分化培養(yǎng)基，7個(gè)月后一次性獲得2.8萬株優(yōu)質(zhì)四倍體鐵皮石斛無毒種苗。
[0027]b、在無菌條件下切取編號為L-121的純合四倍體植株的莖段，將切取的5段莖段接種于含6-BA0.4mg/L+NAA0.4m g/L+活性炭1.0g/L的1/3~1/2MS固體培養(yǎng)基中，在光照強(qiáng)度1500LUX，光照時(shí)間12h/d，溫度25±1°C的條件下培養(yǎng)35d后誘導(dǎo)出原球莖，將原球莖續(xù)代3次后轉(zhuǎn)入原球莖分化培養(yǎng)基，7個(gè)月后一次性獲得9.5萬株優(yōu)質(zhì)四倍體鐵皮石斛無毒種苗。
[0028]C、在無菌條件下切取編號為L-326的純合四倍體植株的莖段，將切取的5段莖段接種于含6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L+活性炭1.5g/L的1/3~1/2MS固體培養(yǎng)基中，在光照強(qiáng)度1500LUX，光照時(shí)間12h/d，溫度25±2°C的條件下培養(yǎng)30d后誘導(dǎo)出原球莖，將原球莖續(xù)代4次后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基7個(gè)月后一次性獲得30萬株優(yōu)質(zhì)四倍體鐵皮石斛無毒種苗。
[0029]花寶I號是美國花寶公司，作用是促進(jìn)蘭科植物生根壯苗，在市場可以購買獲得，http://baike.baidu.com/view/1194364.htm。
【權(quán)利要求】
1.一種大量繁育同源純合四倍體鐵皮石斛的方法，其特征在于包括以下步驟:選用石斛組培續(xù)代1~4代過程中產(chǎn)生的黃綠色且沒有莖尖分化的原球莖，用秋水仙素進(jìn)行四倍體誘變，處理后轉(zhuǎn)入原球莖分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)出再生植株，按常規(guī)方式進(jìn)行栽培管理，對再生植株的根尖染色體進(jìn)行檢測，篩選出純合四倍體植株，切取具有優(yōu)良性狀的純合四倍體植株的莖段，轉(zhuǎn)接入原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，續(xù)代三次后將原球莖進(jìn)行誘導(dǎo)分化出再生四倍體植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大量繁育同源四倍體鐵皮石斛的方法，其特征在于所述的四倍體誘變處理為，在含0.04、.06 (wt) %秋水仙堿的1/3~1/2MS液體培養(yǎng)基中誘變處理.60~72h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大量繁育同源四倍體鐵皮石斛的方法，其特征在于所述的原球莖分化培養(yǎng)基為:NAA0.5^1.5mg/L+花寶I號0.5^0.8g/L+蔗糖2-4 (wt) %+香蕉.10~15(wt)%的1/3~1/2MS固體培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大量繁育同源純合四倍體鐵皮石斛的方法，其特征在于所述的切取具有優(yōu)良性狀的純合四倍體植株莖段，其切方法為從相連的兩個(gè)莖節(jié)節(jié)點(diǎn)處斜切莖段，將帶有兩個(gè)斜切口的莖段水平接種于原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每個(gè)母瓶中接種一個(gè)莖段。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大量繁育同源純合四倍體鐵皮石斛的方法，其特征在于原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成為1/3~1/2MS+6-BA0.2~0.5mg/L+NAA0.3~0.6mg/L+活性炭.0.5~1.5g/L。
【文檔編號】A01H4/00GK103535274SQ201210244240
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2012年7月13日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月13日
【發(fā)明者】李振達(dá), 何心展, 馬春光, 付文飛 申請人:寧波洛祥藥業(yè)有限公司