專(zhuān)利名稱(chēng)：一種黃連木開(kāi)花基因的克隆及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)與現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種黃連木開(kāi)花控制基因(PcBLFY)的克隆及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
化石能源日趨枯竭，加之化石類(lèi)能源使用過(guò)程中產(chǎn)生的有毒氣體和溫室氣體帶來(lái)的環(huán)境影響，開(kāi)發(fā)綠色可再生的清潔能源成為世界各國(guó)爭(zhēng)相研究的領(lǐng)域。其中生物能源是最有前景的發(fā)展方向之一。我國(guó)是能源消費(fèi)大國(guó)，60%的石油依賴(lài)進(jìn)口，發(fā)展生物柴油替代有限的石油資源意義重大。目前，生物柴油產(chǎn)業(yè)的瓶頸問(wèn)題是原料的供應(yīng)問(wèn)題，相關(guān)生物柴油生產(chǎn)企業(yè)普遍開(kāi)工率低，只有10%左右；其主要原因是原料油脂供應(yīng)不足，且油脂成本占企業(yè)生產(chǎn)成本比
例高，達(dá)60-70%。我國(guó)人多地少，不能象發(fā)達(dá)國(guó)家一樣走利用耕地實(shí)現(xiàn)生物柴油原料油供應(yīng)的路子，利用荒山、荒地等邊際性土地種植油料植物實(shí)現(xiàn)原料油脂的供應(yīng)是我國(guó)生物柴油產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必由之路。黃連木(Pistacia chinensis Bunge)是一種重要的多年生木本油料植物,分布范圍廣，可在荒山荒地等邊際性土地上種植，適宜大面積造林，而且種子含油率高達(dá)40%以上。黃連木種子油脂是生物柴油的優(yōu)質(zhì)原料，黃連木被認(rèn)為是未來(lái)生態(tài)能源林建設(shè)和生物質(zhì)柴油產(chǎn)業(yè)優(yōu)先發(fā)展樹(shù)種。由于黃連木發(fā)展前景看好，目前針對(duì)黃連木的研究越來(lái)越多，但基本集中在資源調(diào)查、育苗、防治、栽培技術(shù)等宏觀方面的研究，有關(guān)遺傳基礎(chǔ)、豐產(chǎn)技術(shù)等方面的研究較少。黃連木為雌雄異株植物，天然次生林中的雌雄株的比例大約為1:1，而10%左右的雄株即可以保證充足的花粉供應(yīng)，因而天然次生林中雄株過(guò)剩，能結(jié)果的雌株比例偏低(在天然次生林中偶見(jiàn)有雌雄同株的個(gè)體，目前還無(wú)法在生產(chǎn)上應(yīng)用)。而黃連木童期長(zhǎng)，8-12年才能開(kāi)花結(jié)果，在開(kāi)花結(jié)果前沒(méi)有有效的雌雄株的鑒定方法。因而對(duì)黃連木開(kāi)花主控基因的克隆和功能研究，以及穩(wěn)定實(shí)用的黃連木苗期雌雄鑒定技術(shù)的研究，對(duì)于研發(fā)童期短的早結(jié)果株系、培育雌株比例高的高產(chǎn)黃連木能源林，從而大幅提高黃連木的單位面積產(chǎn)量具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是用于黃連木不同性別植株的苗期性別鑒定，用于調(diào)節(jié)黃連木能源林的植株性別比例，從而大幅提高產(chǎn)量。為了實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用如下技術(shù)方案根據(jù)其它植物已知LEAFY基因序列，設(shè)計(jì)兼并引物，以黃連木雄株、雌株和雌雄同株總RNA為模板，采用RT-PCR方法合成cDNA第一條鏈，5’RACE和3’RACE方法克隆PcBLFY的cDNA全長(zhǎng)序列。根據(jù)獲得的cDNA序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)RT-PCR的方法從黃連木雄株、雌株、雌雄同株植株中分別獲得2個(gè)、I個(gè)、2個(gè)序列存在單堿基位點(diǎn)多態(tài)性差異的LEAFY基因。一種黃連木開(kāi)花基因(PcBLFY)具有如下cDNA核苷酸序列0001 CAAGTGTCAAGTTTCAAACAAACAAAACATCATCAACTCCCCTTTCACTT0051 CTTTAGTTACCCAATCATAAAACAATTAAAACCAGTGACTTAAAGGGCAG0101 TTTTGTGAACCCAAAAACAGTTTGCCTTTATAACAAAGCAACACCAACAC0151 ACAGCTCAAAATYTCAGTTGCTCAGAGAGATGGATCCTGAAGCATTCACG0201 GCGAGCTTGTTTAAGTGGGACCCGCGTGGGSTGGTGCCGCCACAGACCAG0251 GGTGCTGGAACCGGTGGTGCCACTACCGGCAGCGATTTCCGCGGCCACCG0301 CCTTCTCGGTGGTGCGTCCAAGGGAGCTAGGTGGGCTGGAGGAGTTGTTC0351 CAGGCTTATGGGATAAGGTACTACACGGCAGCGAAGATAGCGGAGCTTGG0401 GTTCACGGTGAATACACTTGTGAATATGAAAGATGAGGAGCTTGATGAGA0451 TGATGAACAGCCTGTCTCAGATATTTAGGTGGGAACTCCTTGTTGGAGAG0501 AGGTATGGTATTAAAGCTGCTGTTAGAGCTGAGAGGAGAAGGCTTGATGA0551 GGAGGATTCACGAAGGCGTCACWTACTGTCTGGTGATACTACCAACTCTG0601 TTGATGCTTTGTCCCAAGAAGGGTTATCTGAGGAACCAGTGCAGCAAGAG0651 AAGGAGGCAGCAGGGAGCGGAGGAGGAGGAACGTGGGACTTAGCGGTGGC0701 AGTGACGGAGAGGAAGAAACAGCGGCGGAGGAAGGGGCAAAGGAAGATAG0751 TGGATGTTAATCACTATGATGAAAATGAAGAYGATGAGAATGCTGAAGGC0801 AGTGAGAGACAACGAGAGCACCCCTTCATAGTGACGGAGCCTGGTGAAGT0851 GGCACGTGGCAAAAAAAACGGCCTTGATTACCTGTTCCATCTCTATGAGC0901 AATGCCGTGATTTCTTGATCCAGGTCCAGAACATCGCCAAGGAGCGTGGC0951 GAAAAATGCCCAACCAAGGTGACAAATCAGGTGTTTAGGTATGCAAAGAA1001 GGCTGGTGCAAGCTACATTAACAAGCCAAAGATGAGACACTATGTGCACT1051 GCTATGCGTTGCACTGCCTGGACGAGGAGGCATCAGATGCACTGAGGAGG1101 GTTTTCAAGGAAAGAGGAGAGAACGTGGGGGCTTGGAGACAGGCTTGTTA1151 TAAGCCACTTGTGGGCATTGCAGCACGGCAAGGCTGGGATATTGATGCCA1201 TTTTCAATGCGCATCCTCGTCTGGCCATTTGGTATGTGCCCACGAAGCTG1251 CGTCAACTTTGTCATGCTGAGCGCAATAGTGTCRCTGCTTCTAGCTCTGT1301 GTCTGGCGGGGCTGATCAGCTGCCTTTCTAAATTAAAGCCTCACTGAATG1351 ACCGATTTGCCTAGTGATTAATCCTATTTATGGTGTCTGTTAGCAGTGTT1401 TATTCGTGAATGTTTGTAATCTCACTTCATTTAGACTTATAGCAACTAAT1451 TAATCACARTATTATCACATCAATCGTACGTGTTCTTTAATATTTCTTTT1501 ATCTTATTTGATTTATTATCCATAAAACATTTCCGTAGAAAAAAAAAAAA1551 AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA其中，R:A或G; Y:C或T; S:G或C; W:A或T(以黑體顯示)黃連木開(kāi)花基因的制備方法包括如下步驟(a)提取黃連木雌雄株和兩性株總RNA，并以其為模板，通過(guò)RT-PCR方法合成CDNA第一鏈；(b)采用5’ RACE和3’ RACE的方法克隆獲得全長(zhǎng)cDNA。分別提取黃連木雄株、雌株、雌雄同株植物總RNA，擴(kuò)增三種類(lèi)型植株編碼區(qū)序列；(a)黃連木雄株中獲得兩種LEAFY基因(PcBLFYMl、PcBLFYM2) ； (b)雌株中獲得一種LEAFY基因(PcBLFYF) ；(c)雌雄同株植物中獲得兩種LEAFY基因(PcBLFYF, PcBLFYM3)。上述LEAFY基 因的核苷酸序列為PcBLFYMl 0001 ATGGATCCTGAAGCATTCACGGCGAGCTTGTTTAAGTGGGACCCGCGTGG0051 GGTGGTGCCGCCACAGACCAGGGTGCTGGAACCGGTGGTGCCACTACCGG0101 CAGCGATTTCCGCGGCCACCGCCTTCTCGGTGGTGCGTCCAAGGGAGCTA0151 GGTGGGCTGGAGGAGTTGTTCCAGGCTTATGGGATAAGGTACTACACGGC0201 AGCGAAGATAGCGGAGCTTGGGTTCACGGTGAATACACTTGTGAATATGA0251 AAGATGAGGAGCTTGATGAGATGATGAACAGCCTGTCTCAGATATTTAGG0301 TGGGAACTCCTTGTTGGAGAGAGGTATGGTATTAAAGCTGCTGTTAGAGC0351 TGAGAGGAGAAGGCTTGATGAGGAGGATTCACGAAGGCGTCACATACTGT0401 CTGGTGATACTACCAACTCTGTTGATGCTTTGTCCCAAGAAGGGTTATCT0451 GAGGAACCAGTGCAGCAAGAGAAGGAGGCAGCAGGGAGCGGAGGAGGAGG0501 AACGTGGGACTTAGCGGTGGCAGTGACGGAGAGGAAGAAACAGCGGCGGA0551 GGAAGGGGCAAAGGAAGATAGTGGATGTTAATCACTATGATGAAAATGAA0601 GACGATGAGAATGCTGAAGGCAGTGAGAGACAACGAGAGCACCCCTTCAT0651 AGTGACGGAGCCTGGTGAAGTGGCACGTGGCAAAAAAAACGGCCTTGATT0701 ACCTGTTCCATCTCTATGAGCAATGCCGTGATTTCTTGATCCAGGTCCAG0751 AACATCGCCAAGGAGCGTGGCGAAAAATGCCCAACCAAGGTGACAAATCA0801 GGTGTTTAGGTATGCAAAGAAGGCTGGTGCAAGCTACATTAACAAGCCAA0851 AGATGAGACACTATGTGCACTGCTATGCGTTGCACTGCCTGGACGAGGAG0901 GCATCAGATGCACTGAGGAGGGTTTTCAAGGAAAGAGGAGAGAACGTGGG0951 GGCTTGGAGACAGGCTTGTTATAAGCCACTTGTGGGCATTGCAGCACGGC1001 AAGGCTGGGATATTGATGCCATTTTCAATGCGCATCCTCGTCTGGCCATT1051 TGGTATGTGCCCACGAAGCTGCGTCAACTTTGTCATGCTGAGCGCAATAG1101 TGTCACTGCTTCTAGCTCTGTGTCTGGCGGGGCTGATCAGCTGCCTTTCT1151 AAPcBLFYM2 0001 ATGGATCCTGAAGCATTCACGGCGAGCTTGTTTAAGTGGGACCCGCGTGG0051 GCTGGTGCCGCCACAGACCAGGGTGCTGGAACCGGTGGTGCCACTACCGG0101 CAGCGATTTCCGCGGCCACCGCCTTCTCGGTGGTGCGTCCAAGGGAGCTA0151 GGTGGGCTGGAGGAGTTGTTCCAGGCTTATGGGATAAGGTACTACACGGC0201 AGCGAAGATAGCGGAGCTTGGGTTCACGGTGAATACACTTGTGAATATGA0251 AAGATGAGGAGCTTGATGAGATGATGAACAGCCTGTCTCAGATATTTAGG0301 TGGGAACTCCTTGTTGGAGAGAGGTATGGTATTAAAGCTGCTGTTAGAGC0351 TGAGAGGAGAAGGCTTGATGAGGAGGATTCACGAAGGCGTCACTTACTGT0401 CTGGTGATACTACCAACTCTGTTGATGCTTTGTCCCAAGAAGGGTTATCT0451 GAGGAACCAGTGCAGCAAGAGAAGGAGGCAGCAGGGAGCGGAGGAGGAGG
權(quán)利要求
1.一種黃連木開(kāi)花基因/ 現(xiàn)/7，其特征在于，其具有如下CDNA核苷酸序列OOOI CAAGTGTCAAGTTTCAAACAAACAAAACATCATCAACTCCCCTTTCACTT0051 CTTTAGTTACCCAATCATAAAACAATTAAAACCAGTGACTTAAAGGGCAG0101 TTTTGTGAACCCAAAAACAGTTTGCCTTTATAACAAAGCAACACCAACAC0151 ACAGCTCAAAATYTCAGTTGCTCAGAGAGATGGATCCTGAAGCATTCACG020I GCGAGCTTGTTTAAGTGGGACCCGCGTGGGSTGGTGCCGCCACAGACCAG0251 GGTGCTGGAACCGGTGGTGCCACTACCGGCAGCGATTTCCGCGGCCACCG030I CCTTCTCGGTGGTGCGTCCAAGGGAGCTAGGTGGGCTGGAGGAGTTGTTC0351 CAGGCTTATGGGATAAGGTACTACACGGCAGCGAAGATAGCGGAGCTTGG040I GTTCACGGTGAATACACTTGTGAATATGAAAGATGAGGAGCTTGATGAGA045I TGATGAACAGCCTGTCTCAGATATTTAGGTGGGAACTCCTTGTTGGAGAG050I AGGTATGGTATTAAAGCTGCTGTTAGAGCTGAGAGGAGAAGGCTTGATGA0551 GGAGGATTCACGAAGGCGTCACWTACTGTCTGGTGATACTACCAACTCTG060I TTGATGCTTTGTCCCAAGAAGGGTTATCTGAGGAACCAGTGCAGCAAGAG0651 AAGGAGGCAGCAGGGAGCGGAGGAGGAGGAACGTGGGACTTAGCGGTGGC070I AGTGACGGAGAGGAAGAAACAGCGGCGGAGGAAGGGGCAAAGGAAGATAG0751 TGGATGTTAATCACTATGATGAAAATGAAGAYGATGAGAATGCTGAAGGC080I AGTGAGAGACAACGAGAGCACCCCTTCATAGTGACGGAGCCTGGTGAAGT0851 GGCACGTGGCAAAAAAAACGGCCTTGATTACCTGTTCCATCTCTATGAGC090I AATGCCGTGATTTCTTGATCCAGGTCCAGAACATCGCCAAGGAGCGTGGC0951 GAAAAATGCCCAACCAAGGTGACAAATCAGGTGTTTAGGTATGCAAAGAA1001 GGCTGGTGCAAGCTACATTAACAAGCCAAAGATGAGACACTATGTGCACT1051 GCTATGCGTTGCACTGCCTGGACGAGGAGGCATCAGATGCACTGAGGAGG1101 GTTTTCAAGGAAAGAGGAGAGAACGTGGGGGCTTGGAGACAGGCTTGTTA1151 TAAGCCACTTGTGGGCATTGCAGCACGGCAAGGCTGGGATATTGATGCCA1201 TTTTCAATGCGCATCCTCGTCTGGCCATTTGGTATGTGCCCACGAAGCTG1251 CGTCAACTTTGTCATGCTGAGCGCAATAGTGTCRCTGCTTCTAGCTCTGT1301 GTCTGGCGGGGCTGATCAGCTGCCTTTCTAAATTAAAGCCTCACTGAATG1351 ACCGATTTGCCTAGTGATTAATCCTATTTATGGTGTCTGTTAGCAGTGTT1401 TATTCGTGAATGTTTGTAATCTCACTTCATTTAGACTTATAGCAACTAAT145I TAATCACARTATTATCACATCAATCGTACGTGTTCTTTAATATTTCTTTT1501 ATCTTATTTGATTTATTATCCATAAAACATTTCCGTAGAAAAAAAAAAAA1551 AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 其中，R:A或G; Y:C或T; S:G或C; W:A或T以黑體顯示。
2.一種如權(quán)利要求I所述的黃連木開(kāi)花基因的制備方法，其特征在于包括如下步驟 Ca)提取黃連木雌雄株和兩性株總RNA，并以其為模板，通過(guò)RT-PCR方法合成⑶NA第一鏈，獲得了一段36 Ibp的cDNA序列； (b)采用5’ RACE和3’ RACE的方法克隆獲得全長(zhǎng)cDNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的黃連木開(kāi)花基因，其特征在于，所述的黃連木雄株、雌株、雌雄同株植物上提取的總RNA，擴(kuò)增了三種類(lèi)型植株編碼區(qū)序列 (a )黃連木雄株中獲得兩種LEAFY基因PcBLFYMI、PcBLFYM2 ； (b )雌株中獲得一種LEAFY基因PcBLFYF ； (c )雌雄同株植物中獲得兩種LEAFY基因PcBLFYF, PcBLFYM3。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的黃連木開(kāi)花基因，其特征在于，所述的/ 現(xiàn)現(xiàn)/T#么PcBLFYF和PcBLFYM3游核苷酸序列分別為
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的黃連木開(kāi)花基因，其特征在于，所述的/ 現(xiàn)/Ti//、PcBLFYM2、PcBLFYF和PcBLFYM3推測(cè)的氨基酸序列如下
6.根據(jù)權(quán)利要求I或4所述的黃連木開(kāi)花基因，其特征在于，所述的黃連木開(kāi)花基因利用雌株、雄株和雌雄同株植物在RNA或DNA序列上的單堿基序列差異，進(jìn)行黃連木植株性別鑒定。
7.根據(jù)權(quán)利要求I或4所述的黃連木開(kāi)花基因，其特征在于，所述的黃連木開(kāi)花基因用于創(chuàng)建早開(kāi)花植物基因工程株系。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的黃連木開(kāi)花基因，其特征在于，一種植物表達(dá)載體含有權(quán)利要求4和5所述的編碼多肽的核苷酸和氨基酸序列或部分片段。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種黃連木開(kāi)花基因PcBLFY，本發(fā)明還公開(kāi)了一種黃連木開(kāi)花基因的克隆，根據(jù)其它植物已知LEAFY基因序列，設(shè)計(jì)兼并引物，以黃連木雄株、雌株和雌雄同株總RNA為模板，采用RT-PCR方法合成cDNA第一條鏈，5’RACE和3’RACE方法克隆PcBLFY的cDNA全長(zhǎng)序列。根據(jù)獲得的cDNA序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)RT-PCR的方法從黃連木雄株、雌株、雌雄同株植株中分別獲得2個(gè)、1個(gè)、2個(gè)序列存在單堿基位點(diǎn)多態(tài)性差異的LEAFY基因。本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容可供創(chuàng)造早開(kāi)花結(jié)果的轉(zhuǎn)基因育種使用。本發(fā)明的重要應(yīng)用前景是用于黃連木不同性別植株的苗期性別鑒定，用于調(diào)節(jié)黃連木能源林的植株性別比例，從而大幅提高產(chǎn)量。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102876685SQ20121025382
公開(kāi)日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月20日
發(fā)明者吳麗芳, 張萍萍, 劉靜靜, 鄭博, 李明浩 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院