專利名稱：一種砂梨多倍體的誘導方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種砂梨多倍體的誘導方法。
背景技術(shù)：
梨是我國傳統(tǒng)的大眾喜愛的水果，營養(yǎng)豐富，并且口感甚佳，性寒清熱潤肺，具有較高的食用價值和醫(yī)療價值。梨作為重要的木本經(jīng)濟果樹，對氣候和土壤的適應(yīng)性廣，抗逆性很強，在我國各個省區(qū)(海南省除外)都有種植。在植物分類學上，梨是薔薇科(Rosaeeae)梨亞科(Maloldeae)梨屬(Pyrus)植物,為喬本落葉果樹。按照目前的分類，現(xiàn)在世界梨屬植物有60個種，原產(chǎn)中國的有16種。在生產(chǎn)栽培上，梨可分為東方梨和西洋梨兩大類。我國、日本及韓國等國家栽培的梨多屬于東方梨，本發(fā)明中所選用的砂梨品種‘翠 冠’為東方梨的I個品種。由于梨童期長，自交不親和，雜合程度高，進行常規(guī)雜交育種改良比較困難。但隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，通過組織培養(yǎng)可以篩選抗逆(抗寒、抗病、抗鹽堿)的細胞突變體或者結(jié)合其他手段誘導多倍體，獲得具有優(yōu)良性狀的品種或種質(zhì)；對于梨育種工作來說，這項技術(shù)的發(fā)展和成熟能起到巨大的推動作用。多倍體培養(yǎng)成功的決定性因素之一是選擇適宜的誘導方法。不同的物種、不同的材料誘導方法不一樣，效果差異較大，因為不同的材料對處理方式的敏感性不一樣，每一物種都有其最適染色體數(shù)目范圍。目前梨得到多倍體植株的方法是在組織培養(yǎng)過程中，通過對梨葉片、莖段、種胚等組織培養(yǎng)材料通過化學誘變劑處理來獲得多倍體，其中多用秋水仙素處理。但是外植體不同，適用的秋水仙素濃度也不同。多倍體培養(yǎng)成功的另一個重要因素是選擇適宜的外植體。由于秋水仙素對正在分裂的細胞才發(fā)生作用，因此處理材料應(yīng)為分裂旺盛的幼嫩組織，果樹上多選用葉片，莖段等外植體，但因葉片對秋水仙素的毒害作用比較敏感，很難成活。理論上講，植物細胞都具有全能性，能夠再生新植株，因此植物體的各個器官、組織、細胞及原生質(zhì)體都可以作為外植體。但在實際組織培養(yǎng)過程中，需要對外植體進行選擇，因為不同來源的外植體，在離體條件下對滅菌劑的敏感性不同；生長潛力不一樣；細胞恢復分裂(即脫分化)的能力或愈傷組織再次分化(即再分化)的能力也有差異。如果選擇不好，就很難獲得培養(yǎng)的成功。因此，在進行植物組織培養(yǎng)時，必須選擇合適的外植體，以確保組織培養(yǎng)工作的順利進行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種砂梨多倍體誘導的方法，直接用組培苗單芽莖段作為外植體，取材簡單方便。砂梨多倍體誘導的方法，通過如下步驟實現(xiàn)( I)在超凈工作臺上，將砂梨無菌試管苗剪去頂端，促進腋芽萌發(fā)，4-6d后將試管苗剪成帶葉的單芽莖段；
(2)在遮光的情況下，將單芽莖段浸潰在經(jīng)高壓滅菌的0. 05% 0. 2%秋水仙素溶液中，然后在搖床上以120 140r/min震蕩，處理40 50h，處理完畢后無菌水沖洗3次；(3)將浸潰處理后的單芽莖段轉(zhuǎn)接到含有0. 002% 0. 003%秋水仙素的增殖培養(yǎng)基中，單芽莖段的腋芽要埋入含有0. 002% 0. 003%秋水仙素的增殖培養(yǎng)基中，使生長點與藥液充分接觸，葉片露出培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)6-10d后轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)，待處理的腋芽萌動抽莖長至I 2cm后繼代到新鮮的培養(yǎng)基中；所述的增殖培養(yǎng)基l/2MS+6-BA2. 00 I. 50mg/L+IBA 0. 2 0. 4mg/L+GA3
I.0 3. Omg/L+蔗糖25 35g/L+瓊脂5 7g/L，PH5. 8 ;增殖培養(yǎng)基中加入0. 002wt%
0.003wt%秋水仙素用于單芽莖段外植體的增殖培養(yǎng)；培養(yǎng)條件培養(yǎng)室溫度25±1°C，光周期15 20h光照/6 IOh黑暗，相對濕度 40% 80% ；(4)在新鮮培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)3 4次后，從中選擇形態(tài)變異明顯的植株進行鑒定，然后對鑒定為多倍體的植株進行擴繁；繼代培養(yǎng)基l/2MS+6-BA2. 00 I. 50mg/L+IBA 0. 2 0. 4mg/L+GA3 I. 0
3.Omg/L+ 蔗糖 25 35g/L+ 瓊脂 5 7g/L，PH5. 8 ；培養(yǎng)條件培養(yǎng)室溫度25±1°C,光周期為15 20h h光照/6 IOh黑暗,相對濕度40% 80%。所述的砂梨多倍體誘導的方法，優(yōu)選通過如下步驟實現(xiàn)(I)在超凈工作臺上，將生長健壯的砂梨無菌試管苗剪去頂端，促進腋芽萌發(fā)，4-6d后將試管苗剪成帶葉的單芽莖段；(2)在遮光的情況下，將單芽莖段浸潰在經(jīng)高壓滅菌的0. 1% 0. 2%秋水仙素溶液中，然后在搖床上以130 140r/min震蕩，處理45 50h，處理完畢后無菌水沖洗3次；(3)將浸潰處理后的單芽莖段轉(zhuǎn)接到含有0. 002% 0. 003%秋水仙素的增殖培養(yǎng)基中，單芽莖段的腋芽要埋入培養(yǎng)基中，使生長點與藥液充分接觸，葉片露出培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)8d后轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)，待處理的腋芽萌動抽莖長至I 2cm后繼代到新鮮的繼代培養(yǎng)基中；增殖培養(yǎng)基l/2MS+6-BAI. 50mg/L+IBA 0. 3mg/L+GA3 2. Omg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂6g/L，PH5. 8 ;增殖培養(yǎng)基中加入0. 002wt% 0. 003wt%秋水仙素用于單芽莖段外植體的
增殖培養(yǎng)；培養(yǎng)條件培養(yǎng)室溫度25± 1°C，光周期(光照/黑暗)為16h/8h，相對濕度40% 80%。(4)在新鮮繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)3 4次后，從中選擇形態(tài)變異明顯的植株進行鑒定，然后對鑒定為多倍體的植株進行擴繁。繼代培養(yǎng)基l/2MS+6-BAI. 50mg/L+IBA 0. 3mg/L+GA3 2. Omg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6g/L，PH5. 8 ；增殖培養(yǎng)條件培養(yǎng)室溫度25± I °C,光周期(光照/黑暗)為16h/8h,相對濕度40% 80%。所述的砂梨優(yōu)選‘翠冠’，‘翠冠’是我國南方重要早熟優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)梨品種。該品種果形圓正，果皮細薄，色澤漂亮，果肉白色，細嫩松脆，無渣，汁多味甜；果心較小，其風味獨特；且耐貯運，是符合出口標準深受海內(nèi)外消費者喜愛的優(yōu)良品種。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明針對砂梨的具體遺傳學特征，采用特定濃度的化學誘變劑秋水仙素對其莖段進行處理，將保持遺傳穩(wěn)定性的組培苗單芽莖段誘導變異獲得穩(wěn)定的多倍體植株；本發(fā)明方法操作簡單、成本低、誘導定向性好，誘導成功率高，為砂梨多倍體育種提供一種可行的新方法。


圖I為二倍體與四倍體形態(tài)特征比較A為二倍體植株；B為四倍體植株；C為二倍體葉片山為四倍體葉片。圖2為Flow cytometry分析不同倍性DNA的相對含量A. 二倍體；B.四倍體；C.混倍體圖中，橫坐標均表示相對熒光強度，縱坐標均表示細胞核數(shù)量。
具體實施例方式實施例I(I)取南京農(nóng)業(yè)大學梨工程技術(shù)研究中心組培實驗室培育出的砂梨品種‘翠冠’組培苗在超凈工作臺上，剪去其頂端莖尖，促進腋芽萌發(fā)，5d后剪成帶葉的單芽莖段；(2)在遮光的情況下，將‘翠冠’單芽莖段浸潰在經(jīng)高壓滅菌的0. 1%秋水仙素溶液中，然后在搖床上以130r/min震蕩，處理48h，處理完畢后無菌水沖洗3次；(3)將浸潰處理后的單芽莖段轉(zhuǎn)接到含有0. 003wt%秋水仙素的增殖培養(yǎng)基中，單芽莖段的腋芽要埋入增殖培養(yǎng)基中，使生長點與藥液充分接觸，葉片露出培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)6d后轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)，待處理的腋芽萌動抽莖長至I 2cm后繼代到新鮮的培養(yǎng)基中；增殖培養(yǎng)基l/2MS+6-BAI. 50mg/L+IBA 0. 3mg/L+GA3 2. Omg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6g/L，PH5. 8 ；培養(yǎng)條件培養(yǎng)室溫度25 ± I °C，光周期(光照/黑暗)為16h/8h，相對濕度60 %。(4)在繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)4次后，所得‘翠冠’變異組培苗與未處理的‘翠冠’組培苗發(fā)現(xiàn)其的外觀形態(tài)有明顯差異(圖I )，變異植株相對粗壯，葉片較大，葉片顏色較深；然后對這些變異組培苗進行Flow cytometry倍性鑒定，結(jié)果顯示，以二倍體為對照(圖2，A)，變異苗中一些為四倍體(圖2，B)，另一些為混倍體(圖2，C)。繼代培養(yǎng)基l/2MS+6-BAI. 50mg/L+IBA 0. 3mg/L+GA3 2. 0mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6g/L，PH5. 8 ；培養(yǎng)條件培養(yǎng)室溫度25 ± I °C，光周期(光照/黑暗)為16h/8h，相對濕度80 %。
權(quán)利要求
1.一種砂梨多倍體的誘導方法，其特征在于通過如下步驟實現(xiàn) (1)在超凈工作臺上，將砂梨無菌試管苗剪去頂端，促進腋芽萌發(fā)，4-6d后將試管苗剪成帶葉的單芽莖段； (2)在遮光的情況下，將單芽莖段浸潰在經(jīng)高壓滅菌的0.05% 0. 2%秋水仙素溶液中，然后在搖床上以120 140r/min震蕩，處理40 50h，處理完畢后無菌水沖洗3次； (3)將浸潰處理后的單芽莖段轉(zhuǎn)接到含有0.002% 0. 003%秋水仙素的增殖培養(yǎng)基中，單芽莖段的腋芽要埋入增殖培養(yǎng)基中，使生長點與藥液充分接觸，葉片露出培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)6-10d后轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)，待處理的腋芽萌動抽莖長至I 2cm后繼代到新鮮的培養(yǎng)基中； 所述的增殖培養(yǎng)基l/2MS+6-BA 2. 00 I. 50mg/L+IBA 0. 2 0. 4mg/L+GA3 I. 0 3. Omg/L+ 蔗糖 25 35g/L+ 瓊脂 5 7g/L，PH5. 8 ； 培養(yǎng)條件培養(yǎng)室溫度25±1°C，光周期15 20h光照/6 IOh黑暗，相対濕度40% 80% ； (4)在新鮮培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)3 4次后，從中選擇形態(tài)變異明顯的植株進行鑒定，然后對鑒定為多倍體的植株進行擴繁； 繼代培養(yǎng)基l/2MS+6-BA 2. 00 I. 50mg/L+IBA 0. 2 0. 4mg/L+GA3 I. 0 3. Omg/L+蔗糖 25 35g/L+ 瓊脂 5 7g/L，PH5. 8 ； 培養(yǎng)條件培養(yǎng)室溫度25±1°C，光周期為15 20h h光照/6 IOh黑暗，相対濕度40% 80%。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的砂梨多倍體的誘導方法，其特征在于通過如下步驟實現(xiàn) (1)在超凈工作臺上，將砂梨無菌試管苗剪去頂端，促進腋芽萌發(fā)，4-6d后將試管苗剪成帶葉的單芽莖段； (2)在遮光的情況下，將單芽莖段浸潰在經(jīng)高壓滅菌的0.1% 0. 2%秋水仙素溶液中，然后在搖床上以130 140r/min震蕩，處理45 50h，處理完畢后無菌水沖洗3次； (3)將浸潰處理后的單芽莖段轉(zhuǎn)接到含有0.002% 0. 003%秋水仙素的增殖培養(yǎng)基中，單芽莖段的腋芽要埋入增殖培養(yǎng)基中，使生長點與藥液充分接觸，葉片露出培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)8d后轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)，待處理的腋芽萌動抽莖長至I 2cm后繼代到新鮮的培養(yǎng)基中； 所述的增殖培養(yǎng)基l/2MS+6-BA I. 50mg/L+IBA 0. 3mg/L+GA3 2. Omg/L+ 蔗糖 30g/L+瓊脂 6g/L，PH5. 8 ； 培養(yǎng)條件培養(yǎng)室溫度25±1°C，光周期16h光照/8h黑暗，相対濕度40% 80% ; (4)在新鮮培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)3 4次后，從中選擇形態(tài)變異明顯的植株進行鑒定，然后對鑒定為多倍體的植株進行擴繁； 繼代培養(yǎng)基l/2MS+6-BA I. 50mg/L+IBA 0. 3mg/L+GA3 2. Omg/L+蔗糖 30g/L+瓊脂 6g/L, PH5. 8 ； 培養(yǎng)條件培養(yǎng)室溫度25±1°C，光周期為16h光照/8h黑暗，相対濕度40% 80%。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的砂梨多倍體的誘導方法，其特征在于所述的砂梨為‘翠冠’。
全文摘要
本發(fā)明是一種砂梨多倍體的誘導方法。將砂梨(Pyrus pyrifolia)組培苗的單芽莖段用秋水仙素進行多倍體的誘變，誘變后進行分化培養(yǎng)及生根培養(yǎng)，并進行多倍體鑒定。本發(fā)明的方法具有誘導定向性好、成本低、操作簡單的特點，為砂梨多倍體育種提供一種可行高效的新方法，對推進我國砂梨人工誘導多倍體技術(shù)具有重要的應(yīng)用價值。
文檔編號A01H4/00GK102763595SQ20121027796
公開日2012年11月7日 申請日期2012年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月7日
發(fā)明者吳俊 , 張紹鈴, 薛亞男, 陶書田, 齊開杰 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學