專利名稱：一種海帶配子體克隆培育方法
技術領域：
本發(fā)明涉及海帶配子體克隆的培育方法，尤其涉及海帶配子體克隆的無菌培育方法。
背景技術：
海帶，學名Laminaria japonica Aresch,褐藻的一種，生長在海底的巖石上，形狀像帶子，含有大量的碘質，屬于褐藻門，褐子綱，海帶目，海帶科，海帶屬。藻體褐色，長帶狀，革質，一般長2 6米，寬20 30厘米。藻體明顯區(qū)分為固著器、柄部和葉片。固著器假根狀，柄部粗短圓柱形，柄上部為寬大長帶狀的葉片。海帶具有極高的養(yǎng)殖價值，然而優(yōu)良養(yǎng)殖品種的選育過程復雜、漫長。海帶配子體在單獨分離培養(yǎng)時可進行營養(yǎng)生長形成無性繁殖系(克隆)，其遺傳性純一，可長期保存，具有發(fā)育全能性并可雜交。海帶配子體克隆作為海帶種質資源保存和利用的主要材料，在育種、育苗研究中發(fā)揮著重要作用。利用海帶雌雄 配子體克隆配對雜交技術可以有效縮短選育周期，獲得性狀優(yōu)良的雜交海帶。這一技術在近些年的海帶育種工作中得到有效運用。目前常規(guī)采用的海帶配子體克隆培育方法，是通過簡單擦洗(用120°C烘干消毒的脫脂棉沾取制冷至10°C的煮沸消毒海水擦洗種海帶，去除表面的雜藻等附著物)種海帶后進行游孢子放散、附著，待游孢子發(fā)育成配子體后用微吸管分離獲得單個雌、雄配子體，在一定條件下將雌雄單獨個體分離成功的海帶配子體克隆培養(yǎng)在含營養(yǎng)鹽的培養(yǎng)液中，放置于溫度8 10°C、持續(xù)光照、光照強度800 12001ux的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在此條件下，海帶配子體可進行營養(yǎng)生長，形成無性繁殖系，培養(yǎng)使配子體進行無性繁殖形成單克隆系，所有操作在常規(guī)室內進行。但該方法由于種海帶和環(huán)境空氣消毒不徹底，極易發(fā)生細菌、真菌及雜藻污染，從而影響了配子體生長和成活率，不利于長期保存，又極大地增加了污染處理的工作量，最終導致種質資源損失。而且該方法體系穩(wěn)定性較差，難以進行長期保存。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種可以長期保存，且可以保持穩(wěn)定生長狀態(tài)的海帶配子體克隆培育方法。本發(fā)明的技術解決方案是一種海帶配子體克隆培育方法，其步驟是(I)剪取種海帶塊剪取帶有成熟孢子囊的種海帶塊；(2)種海帶塊的預處理用滅菌脫脂棉蘸取經制冷至10°C的煮沸消毒海水，對帶有成熟孢子囊的種海帶塊進行充分擦洗；(3)種海帶塊的消毒在無菌室超凈工作臺內，預處理過的種海帶塊首先用無菌雙抗海水浸泡30分鐘，然后用I. 5%濃度的碘化鉀無菌海水溶液浸泡10分鐘，最后用無菌海水浸泡20分鐘；(4)游孢子的放散、過濾在無菌室超凈工作臺內，用無菌鑷子夾取消毒后的種海帶塊，快速移入裝有無菌海水的血清瓶中進行游孢子放散，放散后的無菌海水成為含有游孢子的孢子水，孢子水經篩絹過濾，濾出粘液及雜質；(5)游孢子的附著和培養(yǎng)在無菌室超凈工作臺內，過濾后的孢子水倒入裝有載玻片的立式染色缸中，當游孢子附著于載玻片上形成胚孢子后，倒掉孢子水，加入無菌雙抗海水，使載玻片完全浸泡在無菌雙抗海水中，然后用酒精燈烤干立式染色缸的缸口后，蓋上染色缸蓋，在立式染色缸口外側用封口膜拉伸封口進行培養(yǎng)即可得到發(fā)育成雌、雄可辨的配子體，再用微吸管將單個雌雄配子體分別分離至兩個不同的血清瓶中，每個血清瓶分別用無菌雙抗海水進行培養(yǎng)，即可得到單細胞的海帶配子體克隆團。上述步驟(4)中，所述篩絹為400目的經過高溫高壓滅菌的篩絹。上述步驟(5)中，所述無菌雙抗海水中含有有效氮、有效磷、青霉素和鏈霉素，有效氮濃度為IOppm,有效磷濃度為Ippm,青霉素濃度為120ppm,鏈霉素濃度為lOOppm。所述 培養(yǎng)條件是溫度8 10°C、持續(xù)光照、光照強度800 12001UX。上述無菌海水、I. 5%濃度的碘化鉀無菌海水和無菌雙抗海水均在無菌室超凈工作臺內，經O. 22um濾膜抽濾。本發(fā)明的技術效果是本發(fā)明對種海帶和培養(yǎng)環(huán)境進行全面消毒，除預處理外所有操作均在無菌條件下進行，以無菌雙抗海水作為培養(yǎng)液，在培養(yǎng)箱中持續(xù)光照培養(yǎng)，可有效避免污染，而且海帶配子體生長和發(fā)育狀態(tài)正常，使用本發(fā)明方法培育獲得的海帶配子體克隆性狀穩(wěn)定，生長正常，成活率高，能有效避免污染，適于長期保存，可大大減少工作量，降低培育成本，根本上解決現有方法中的污染問題。應用本發(fā)明方法，不僅可以使海帶配子體克隆在無菌的條件下長期保存，且可以保持穩(wěn)定的生長狀態(tài)。


I、圖I為本發(fā)明微吸管分離后培育10天放大100倍的海帶配子體克隆照片。2、圖2為本發(fā)明微吸管分離后培養(yǎng)45天的海帶配子體克隆(直徑O. 5 Imm)照片。3、圖3為本發(fā)明微吸管分離后培養(yǎng)4個月的海帶配子體克隆(直徑約4 5_)照片。4、圖4為本發(fā)明微吸管分離后培養(yǎng)8個月的海帶配子體克隆(克隆團松散后)照片。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例詳細說明本發(fā)明一種海帶配子體克隆培育方法通過以下方法實現的I、剪取種海帶塊剪取具有優(yōu)良性狀、無病爛、未放散的成熟海帶孢子囊部分，SP剪取帶有成熟孢子囊的種海帶塊。養(yǎng)殖海帶為一年生，養(yǎng)殖海帶的孢子囊一般在每年的5 8月出現；野生海帶為兩年生，野生海帶孢子囊一般在每年的10 11月出現。2、種海帶塊的預處理對帶有成熟孢子囊的種海帶塊進行預處理，即用滅菌脫脂棉蘸取經制冷至10°c的煮沸消毒海水，對帶有成熟孢子囊的種海帶塊進行充分擦洗，擦洗到在不損傷孢子囊的情況下，以去除種海帶塊表面的粘液、雜藻及其它附著物。
3、種海帶塊的消毒在無菌室超凈工作臺內，種海帶塊首先用無菌雙抗海水浸泡30分鐘，然后用I. 5%濃度的碘化鉀無菌海水溶液浸泡10分鐘，最后用無菌海水浸泡20分鐘。上述操作步驟均在直徑為9厘米的培養(yǎng)皿中進行。4、游孢子的放散、過濾在無菌室超凈工作臺內，用無菌鑷子夾取消毒后的種海帶塊，快速移入裝有150ml無菌海水的200ml血清瓶中進行游孢子放散。上述滅菌處理種海帶的過程相當于進行了陰干處理，放入血清瓶后，海帶孢子囊壁破裂，游孢子放出。當游孢子密度達到每視野(目鏡16X物鏡10倍)15 25個時，孢子水(含有游孢子的無菌海水)經400目的高溫高壓滅菌過的篩絹過濾，濾出粘液及雜質。5、游孢子的附著和培養(yǎng)在無菌室超凈工作臺內，過濾后的孢子水倒入裝有載玻片的立式染色缸中，在8 10°C條件下，經O. 5 3小時，游孢子附著于載玻片上形成胚孢子，當載玻片附著密度達到每視野(16X10倍)5 10個時結束，倒掉孢子水，加入無菌雙抗水作為培養(yǎng)液，使載玻片完全浸泡在無菌雙抗水中即可，然后用酒精燈烤干立式染色缸的缸口后，蓋上染色缸蓋，在立式染色缸口外側用封口膜拉伸封口，即在立式染色缸缸口與 缸蓋結合縫處用封口膜封口，放置于溫度8 10°C、持續(xù)光照、光照強度800 12001ux的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15天左右，即可發(fā)育成雌、雄可辨的配子體，再用微吸管將單個雌(雄)配子體分別分離至兩個不同的IOml血清瓶中，每個血清瓶分別用5 IOml無菌雙抗水作為培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，培養(yǎng)也在溫度8 10°C、持續(xù)光照、光照強度800 12001ux的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)10天左右形成肉眼可見的海帶配子體克隆團。本發(fā)明煮沸消毒海水、無菌海水、I. 5%濃度的碘化鉀無菌海水和無菌雙抗海水制作方法I、制備煮沸消毒海水即生海水經煮沸消毒的海水，生海水裝入玻璃三角燒瓶內，在煤氣灶上煮沸，沸騰2 3分鐘即可，然后在玻璃三角燒瓶口用紙蓋封口，用冰箱在5 IO0C的溫度下冷藏保存?zhèn)溆谩?、制備無菌海水在無菌室超凈工作臺內，弱風條件下，酒精燈火焰前，煮沸消毒海水經高溫高壓濕熱滅菌后的O. 22um濾膜抽濾，首先將O. 22um(0. 22微米)濾膜裝入IL的筒式正壓過濾器后通過高溫高壓濕熱滅菌和烘干，在超凈工作臺內，將煮沸消毒海水添加至筒式正壓過濾器中，用抽濾泵抽濾，使液體通過濾膜流到已滅菌的血清瓶中，蓋上瓶蓋，制成無菌海水。由于煮沸消毒的海水不能達到無菌要求，經O. 22um濾膜可以有效濾出海水中的微小雜質及細菌，可以達到除菌99. 99%的要求，在血清瓶的瓶口與瓶蓋結合縫處用封口膜封口，封口膜為半透明、有韌性的熱塑性塑料，能緊緊而且自動密閉形成在瓶口，起到密封作用，用冰箱在5 10°C的溫度下冷藏保存?zhèn)溆谩?、制備I. 5%濃度的碘化鉀無菌海水15克碘化鉀(化學式KI，分析純)溶于IOOOml的煮沸消毒海水后，在無菌室超凈工作臺內，弱風條件下，酒精燈火焰前，經高溫高壓濕熱滅菌后的O. 22um濾膜抽濾至血清瓶，制成I. 5%濃度的碘化鉀無菌海水，用封口膜封口，溫度5 10°C下保存?zhèn)溆?。I. 5%濃度的碘化鉀無菌海水的O. 22um濾膜抽濾同制備無菌海水的O. 22um濾膜抽濾相同。4、制備無菌雙抗海水稱取O. 243克硝酸鈉(分子式NaNO3,分析純)、0· 018克磷酸二氫鉀(分子式KH2PO4，分析純)、0. 48克青霉素(醫(yī)用，80萬單位)、0. 4克鏈霉素(醫(yī)用，每克100萬單位)溶于4000ml煮沸消毒海水后，在無菌室超凈工作臺內，弱風條件下，酒精燈火焰前，經高溫高壓濕熱滅菌后的O. 22um濾膜抽濾至血清瓶，制成含有效氮(NO3-N) IOppm(即濃度為百萬分之十的有效氮)、有效磷(PO4-P) lppm(即濃度為百萬分一的有效磷)，青霉素120ppm(即濃度為百萬分之一百二十的青霉素)和鏈霉素100ppm(即濃度為百萬分之一百的鏈霉素)的無菌雙抗海水，封口膜封口，5 10°C保存?zhèn)溆?。制備無菌雙抗海水的O. 22um濾膜抽濾同制備無菌海水的O. 22um濾膜抽濾相同。本發(fā)明實施例采用如下試劑和器材碘化鉀(KI):上海銀典化工有限公司，分析純硝酸鈉國藥集團化學試劑有限公司，分析純磷酸二氫鉀國藥集團化學試劑有限公司，分析純青霉素山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，注射用青霉素鈉，80萬單位
鏈霉素山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，注射用硫酸鏈霉素，100萬單位立式染色缸玻璃材質，可放5片載玻片，50 60ml的容量壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠，型號為LDZX-75KB超凈工作臺蘇州凈化設備有限公司，型號為SW-CJ-IDO. 22um濾膜上海市新亞凈化器件廠，混合纖維膜筒式正壓過濾器上海市新亞凈化器件廠，規(guī)格為I升，材質為不銹鋼電熱恒溫鼓風干燥箱上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司，型號為0HG-924385-III。本實施例無菌室采用提前2小時臭氧消毒或紫外燈消毒，臭氧消毒采用臭氧發(fā)生器持續(xù)消毒30分鐘，臭氧濃度為80mg/m3。超凈工作臺提前10分鐘用紫外燈消毒,紫外燈持續(xù)消毒30分鐘。本實施例種海帶塊的消毒、游孢子的放散和過濾、游孢子的附著和培養(yǎng)均在無菌室超凈工作臺內完成。本實施例所用物品，如培養(yǎng)皿，裝有濾膜的筒式正壓過濾器，夾取種海帶的鑷子，放散用的血清瓶，過濾用的400目篩絹，放有載玻片的立式染色缸，附著結束后盛放廢棄孢子水的燒杯均經壓力蒸汽滅菌器的高溫高壓濕熱滅菌，即上述需要消毒的物品用牛皮紙包好，裝入滅菌用的布袋中，扎好布袋口，入壓力蒸汽滅菌器，在溫度120°C，壓力O. 165Mpa，滅菌15分鐘，滅菌后裝有物品的布袋再放入電熱恒溫鼓風干燥箱在溫度120°C下干燥120分鐘進行烘干。本實施例滅菌脫脂棉系脫脂棉在電熱恒溫鼓風干燥箱中，在溫度120°C下滅菌120分鐘。
權利要求
1.一種海帶配子體克隆培育方法，其步驟是 (1)剪取種海帶塊剪取帶有成熟孢子囊的種海帶塊； (2)種海帶塊的預處理用滅菌脫脂棉蘸取經制冷至10°C的煮沸消毒海水，對帶有成熟孢子囊的種海帶塊進行充分擦洗； (3)種海帶塊的消毒在無菌室超凈工作臺內，預處理過的種海帶塊首先用無菌雙抗海水浸泡30分鐘,然后用I. 5%濃度的碘化鉀無菌海水溶液浸泡10分鐘,最后用無菌海水浸泡20分鐘； (4)游孢子的放散、過濾在無菌室超凈工作臺內，用無菌鑷子夾取滅菌消毒后的種海帶塊，快速移入裝有無菌海水的血清瓶中進行游孢子放散，放散后的無菌海水成為含有游孢子的孢子水，孢子水經篩絹過濾，濾出粘液及雜質； (5)游孢子的附著和培養(yǎng)在無菌室超凈工作臺內，過濾后的孢子水倒入裝有載玻片的立式染色缸中，當游孢子附著于載玻片上形成胚孢子后，倒掉孢子水，加入無菌雙抗海水，使載玻片完全浸泡在無菌雙抗海水中，然后用酒精燈烤干立式染色缸的缸口后，蓋上染色缸蓋，在立式染色缸口外側用封口膜拉伸封口進行培養(yǎng)即可得到發(fā)育成雌、雄可辨的配子體，再用微吸管將單個雌雄配子體分別分離至兩個不同的血清瓶中，每個血清瓶分別用無菌雙抗海水進行培養(yǎng)，即可得到單細胞的海帶配子體克隆團。
2.根據權利要求I所述一種海帶配子體克隆培育方法，其特征在于在步驟(4)中，所述篩絹為400目的經過高溫高壓滅菌的篩絹。
3.根據權利要求I所述一種海帶配子體克隆培育方法，其特征在于在步驟(5)中，所述無菌雙抗海水中含有有效氮、有效磷、青霉素和鏈霉素，有效氮濃度為lOppm，有效磷濃度為Ippm,青霉素濃度為120ppm,鏈霉素濃度為lOOppm。
4.根據權利要求I所述一種海帶配子體克隆培育方法，其特征在于在步驟(5)中，所述培養(yǎng)條件是溫度8 10°C，持續(xù)光照并且光照強度為800 12001UX。
5.根據權利要求I所述一種海帶配子體克隆培育方法，其特征在于所述無菌海水、I.5%濃度的碘化鉀無菌海水和無菌雙抗海水均在無菌室超凈工作臺內，經0. 22um濾膜抽濾。
全文摘要
本發(fā)明公開一種海帶配子體克隆培育方法，其步驟是剪取帶有成熟孢子囊的種海帶塊；用滅菌脫脂棉蘸取煮沸消毒海水，對種海帶塊進行擦洗；預處理過的種海帶塊分別用無菌雙抗海水浸泡30分鐘，1.5％濃度的碘化鉀無菌海水溶液浸泡10分鐘，無菌海水浸泡20分鐘；在血清瓶中進行游孢子放散和過濾過濾后的孢子水倒入裝有載玻片的立式染色缸中，當游孢子附著于載玻片上形成胚孢子后，倒掉孢子水，加入無菌雙抗海水，再用微吸管將單個雌雄配子體分離至血清瓶中，然后用無菌雙抗海水進行培養(yǎng)，即可得到單細胞的海帶配子體克隆團。使用本發(fā)明方法培育獲得的海帶配子體克隆性狀穩(wěn)定，成活率高，能有效避免污染，適于長期保存。
文檔編號A01H4/00GK102771394SQ201210279628
公開日2012年11月14日 申請日期2012年7月27日 優(yōu)先權日2012年7月27日
發(fā)明者孫娟, 宋少峰, 張壯志, 李曉捷, 李言, 李霞, 王娜, 羅世菊, 賽珊, 趙楠, 錢冠蘭 申請人:山東東方海洋科技股份有限公司