專利名稱：一種鋅指蛋白基因在調(diào)節(jié)水稻根系發(fā)育中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體涉及一種鋅指蛋白基因在調(diào)節(jié)水稻根系發(fā)育中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
根在植物生長(zhǎng)發(fā)育中具有吸收、固著、輸導(dǎo)、合成、儲(chǔ)藏和繁殖等重要作用；同時(shí)，根也是赤霉素、細(xì)胞分裂素和植物堿等一些重要生物活性物質(zhì)的合成部位，這些物質(zhì)對(duì)植物地上部位的組織細(xì)胞生長(zhǎng)、器官形態(tài)建成有很大影響。因此，根系發(fā)育的好壞直接影響著植物的生長(zhǎng)發(fā)育狀況。利用大量的根發(fā)育突變體進(jìn)行研究，目前雙子葉植物根發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制已取得了一定的進(jìn)展。研究表明，生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素等植物激素在調(diào)節(jié)植物根的發(fā)育起重要作用，許多影響根系形態(tài)發(fā)育的基因是通過(guò)參與激素信號(hào)途徑來(lái)調(diào)控根系發(fā)育(Hirota et al. , 2007 ；0kushima et al. , 2007 ；Kubo et al. , 1999;Rogg et al.,2001)。與雙子葉植物相比，水稻等單子葉植物根發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制的研究相對(duì)落后(Loet al. , 2008; Zhaoet al.，2009)。由于單、雙子葉植物根系結(jié)構(gòu)和組成不同，推測(cè)控制兩者根系發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制可能不完全相同。因此，開(kāi)展水稻等單子葉植物的分子遺傳的研究具有重要意義。水稻是重要的糧食作物，而根系是水稻的重要營(yíng)養(yǎng)器官，是決定水稻生長(zhǎng)、產(chǎn)量、以及抗性的重要部分。但目前對(duì)水稻根系發(fā)育分子遺傳的研究不多。與雙子葉植物一樣，目前報(bào)道的幾個(gè)影響水稻根系形態(tài)建成的基因中，多數(shù)參與了植物激素信號(hào)途徑從而影響到根系的發(fā)育。其中，影響水稻不定根生長(zhǎng)發(fā)育的won I基因可能通過(guò)生長(zhǎng)素信號(hào)途徑和細(xì)胞分裂途徑調(diào)控水稻不定根的生長(zhǎng)發(fā)育(Zhaoet al. , 2009) -,CRLKCROWN ROOTLESS I)是水稻根形態(tài)建成的重要因子，該基因突變影響不定根的生長(zhǎng)，其表達(dá)水平受生長(zhǎng)素作用因子調(diào)節(jié)(Inukaiet al. , 2005)。C2H2型鋅指蛋白是一類(lèi)普遍存在于植物中、具有指狀結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，在植物等真核生物基因組中數(shù)量多、且分布廣泛。盡管目前已有的研究表明，C2H2型鋅指蛋白對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆、抗病等方面均起重要作用，但絕大多數(shù)鋅指基因的具體功能并不清楚。特別是，有關(guān)C2H2型鋅指蛋白基因參與調(diào)節(jié)植物根系發(fā)育的方面的報(bào)道還很少。最近，從擬南芥從克隆了一個(gè)受Pi饑餓誘導(dǎo)表達(dá)的C2H2型鋅指基因ZAT6。該基因被認(rèn)為是第一個(gè)報(bào)道、涉及調(diào)節(jié)根發(fā)育與養(yǎng)分應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程有關(guān)的C2H2型鋅指基因。ZAT6過(guò)表達(dá)降低了 Pi的吸收從而影響根的發(fā)育、阻礙幼苗的生長(zhǎng)，推測(cè)該基因的主要功能是抑制初生根的生長(zhǎng)、控制根的結(jié)構(gòu)從而動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)植物對(duì)Pi的吸收(Devaiah et al.，2007)。此外,玉曉紅等(2011)的研究表明，過(guò)量表達(dá)AsZTPZ的轉(zhuǎn)基因幼苗因根系不能正常發(fā)育而死亡，初步推測(cè)OsZRL可能與水稻根系發(fā)育有關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種鋅指蛋白基因在調(diào)節(jié)水稻根系發(fā)育中的應(yīng)用，該水稻根系發(fā)育控制基因?yàn)镃2H2型鋅指蛋白基因該基因能夠調(diào)節(jié)水稻根的發(fā)育，這為改良水稻的根部性狀提供了新的途徑。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下
所述鋅指蛋白基因?yàn)镃2H2型鋅指蛋白基因《517^-07，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示，該基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。將含有基因的過(guò)表達(dá)真核重組質(zhì)?；蚝谢虻腞NA干涉表達(dá)真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化水稻，獲得轉(zhuǎn)基因植株。所述過(guò)表達(dá)真核重組質(zhì)粒是將基因全長(zhǎng)編碼序列插入到真核表達(dá)載體中獲得。所述真核表達(dá)載體為PTCK303。所述RNA干涉表達(dá)真核重組質(zhì)粒是由基因片段和真核表達(dá)載體構(gòu)成；所述《517^-07基因片段是位于起始密碼子下游335bp至917bp的核苷酸序列，將所述
基因片段分別以正向和反向插入到真核表達(dá)載體中，正向插入的基因片段和反 向插入的基因片段之間存在有478bp的內(nèi)含子序列。所述真核表達(dá)載體為PTCK303。本發(fā)明所述控制水稻根系發(fā)育的基因命名為(Oryza sativazinc-finger protein,位于水稻第5染色體上的第7個(gè)鋅指蛋白基因)，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. I所示，所編碼的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，具有一個(gè)C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域。根據(jù)水稻基因組注釋的mRNA序列(基因序列名稱為L(zhǎng)0C_0s05g20930，從水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)下載獲得)，利用互聯(lián)網(wǎng)提供的在線引物設(shè)計(jì)軟件Web-Primer，設(shè)計(jì)了一對(duì)擴(kuò)增
基因的特異引物。因該基因無(wú)內(nèi)含子序列，利用PCR技術(shù)從粳稻品種日本晴的基因組的DNA中分離到0sZPT5-07的編碼序列。將含上述基因的過(guò)量表達(dá)和干涉表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化水稻，獲得轉(zhuǎn)基因植株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與野生型比較，過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的根系發(fā)達(dá)，而降低表達(dá)的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的根系生長(zhǎng)明顯受到抑制，表明該基因能夠調(diào)節(jié)水稻根的發(fā)育，并可在水稻性狀改良中應(yīng)用。


圖I :構(gòu)建基因的過(guò)量表達(dá)載體其中圖I中A -.0sZPT5~07基因過(guò)量載體的結(jié)構(gòu)示意圖；圖I中B :中間載體pMDT18-T-flsZ/T5-W菌液的PCR檢測(cè)(分子量標(biāo)記BM5000，箭頭所示為1029bp的目標(biāo)條帶);圖I中C :雙酶切檢測(cè)量表達(dá)載體Ubi/0sZPT5~07 (Marker :BM5000，箭頭所示為1029bp的目標(biāo)條帶)。Hyg:潮霉素抗性基因；Nos: 一種終止子；UBI-1: —種啟動(dòng)子；OTS: β-葡萄糖苷酸酶基因；LB，RB:載體的左、右邊界。圖2 :構(gòu)建勺干擾載體 AsZZ7T^-W-RNAi ;其中圖 2 中 A -.0sZPT5~07擾載體的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2中B :中間載體？了0(303- 517^-07-1的雙酶切檢測(cè)(分子量標(biāo)記BM2000，箭頭所示為O. 6kb左右的目標(biāo)條帶)；圖2中C :質(zhì)粒？了0(303- 517^-^7的雙酶切檢測(cè)(Marker BM2000,箭頭所示為I. 7kb左右的目標(biāo)條帶)。Hyg:潮霉素抗性基因；Nos: 一種終止子；UBI-1: —種啟動(dòng)子；OTS: β-葡萄糖苷酸酶基因；LB，RB:載體的左、右邊界；Intron，一種水稻內(nèi)含子。圖3 :增強(qiáng)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)及其表型特征；其中圖3中A :轉(zhuǎn)基因植株的潮霉素抗性基因片段的鑒定(Marker BM5000 ;1_4 :4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系);圖3中B :半定量RT-PCR檢測(cè)過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中0sZPT5-07的表達(dá)水平；圖3中C :轉(zhuǎn)基因植株的表型。ACTIN :—種水稻基因；Wildtype :非轉(zhuǎn)基因水稻。圖4抑制表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)及其表型特征；其中圖4中A:轉(zhuǎn)基因植株的潮霉素鑒定(Marker BM5000 ;1_6 6個(gè)轉(zhuǎn)基因植株)；圖4中B :半定量RT-PCR檢測(cè)2株0sZPT5-07-mki植株的表達(dá)水平；圖4中C :發(fā)芽7天的Tl代轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照的根部形態(tài)特征。ACTIN :—種水稻基因；Wildtype :非轉(zhuǎn)基因水稻。
具體實(shí)施例方式 下面結(jié)合實(shí)例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。本實(shí)施例中所用弓丨物由上海生物工程公司合成,序列測(cè)定由北京三博生物科技有限公司完成。各種DNA聚合酶，限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶，克隆載體pMD18-T-Simplevector,均購(gòu)自TaKaRa公司，DNA回收試劑盒購(gòu)自Promega公司。
實(shí)施例I :構(gòu)建基因過(guò)量表達(dá)載體
用SDS法提取水稻日本晴基因組DNA。因基因(基因序列名稱為L(zhǎng)0C_0s05g20930,從水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)下載獲得)無(wú)內(nèi)含子序列，可用PCR方法從水稻基因組DNA中擴(kuò)增出該基因的ORF序列。利用的基因組序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，以日本晴基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增出長(zhǎng)度為1029bp的基因序列并插入到含pTCK303質(zhì)粒中UBI啟動(dòng)子的下游，構(gòu)建了如圖I中A所示的過(guò)量表達(dá)載體PCR擴(kuò)增目的基因序列所用的引物是(下劃線部分為治7/7 I和fee I的酶切位點(diǎn))
上游引物式I GGGGTACCATGGATCCAGCAAGGTACT 下游引物 Sae I CGAGCTC GAAACACGAGTGGTGAATAA。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收后與中間載體pMDT18-T連接，隨后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中；挑取轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌單菌落培養(yǎng)，菌液經(jīng)PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示有一條如圖I中B所示的1029bp條帶。該序列經(jīng)測(cè)序確認(rèn)完全正確后，提取中間載體pMDTl用兩種內(nèi)切酶命/ I /Sac I 同時(shí)酶切質(zhì)粒 pMDTlS-T-flsl/^-i^ 和PTCK303，將兩者分別用膠回收試劑盒回收。將兩種回收產(chǎn)物混勻后于16°C過(guò)夜連接后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中。挑取大腸桿菌單菌落培養(yǎng)，后提取質(zhì)粒pTCK303-fls^7^-i 7，用治7/7 I /Sac I雙酶切該質(zhì)粒,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示有一條如圖I中C所示的Ikb左右的特異條帶，說(shuō)明目的基因已經(jīng)連入表達(dá)載體。提取該質(zhì)粒，并利用凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞中，挑選出陽(yáng)性克隆用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化。 PCR擴(kuò)增0sZPT5_07基因序列全長(zhǎng)的反應(yīng)體系為將48ul超純水、8ul10XBuffer、9ul dntp (2. 5 mm)、7ul 引物、4ul ExTaq 和 4ul 基因組 DNA 混勻，總體積為80ul。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?41預(yù)變性41^11，941變性 lmin，65°C退火 50s，72°C延伸 lmin，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸10min，10°C保存。所用的酶切體系為30ul PCR產(chǎn)物或者質(zhì)粒，8ul IXL Buffer，命/ \ RSac I各3ul，超純水36ul，總體積80ul，混浴后放于37°C水浴鍋保溫4_6小時(shí)。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備的方法是接種受體菌DH5 α，挑取單菌落于無(wú)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中37°C搖床培養(yǎng)過(guò)夜；取Iml過(guò)夜培養(yǎng)菌液于100ml LB培養(yǎng)基中，在37°C搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約2. 5-3小時(shí)；將O. IM CaCl2溶液置于冰上預(yù)冷；吸取I. 4ml培養(yǎng)好的菌液至I. 5ml離心管中，在冰上冷卻IOmin ;于4°C、5000rpm冷凍離心IOmin ;棄去上清，加入100 μ I預(yù)冷O. IM CaC12溶液，重新懸浮細(xì)胞，在冰放置30min ;4°C、5000rpm冷凍離心IOmin ;棄上清液，加入100 μ I預(yù)冷O. IM CaC12溶液，重新懸浮細(xì)胞。細(xì)胞懸浮液可立即用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)或添加15% - 20%甘油后于超低溫冷凍貯存?zhèn)溆?。大腸桿菌細(xì)胞的熱激法轉(zhuǎn)化法是取出制備好的感受態(tài)細(xì)胞，放在冰上融化；每100 μ I感受態(tài)細(xì)胞加入約5 μ I連接產(chǎn)物混勻，在冰上放置20min ;將離心管放置42°C水浴，熱擊60 - 90秒；快速將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴，放置I 一 2min ;每管加400 μ I預(yù)熱至37°C的LB液體培養(yǎng)基，在37°C搖床溫和搖動(dòng)溫育60min ;取適當(dāng)體積均勻涂布于含IPTG、X-gal和抗生素的LB平板；倒置培養(yǎng)皿，于37°C培養(yǎng)12 — 16小時(shí)即可觀察到轉(zhuǎn)化菌落。質(zhì)粒DNA提取方法是取含有質(zhì)粒的大腸桿菌菌液于LB培養(yǎng)基上37°C過(guò)夜培養(yǎng)；用接種針挑取單菌落，接種于含有抗生素的LB培養(yǎng)基中，37°C搖床 200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)；吸取I. 5 ml菌液至離心管中，12000 g離心lmin，收集菌體，倒掉菌液；加入120 μ I溶液I振蕩打勻，重新懸浮細(xì)胞，震蕩混勻，冰上放置2 - 3min ;加入240 μ I溶液II，輕柔顛 倒混勻，冰上放置5min ;加入180 μ I溶液III顛倒混勻，放置于冰上5min ；12000 g離心5 min ;將上清夜轉(zhuǎn)移至另一干凈離心管中，加入等體積的苯酚氯仿抽提溶液中的蛋白等雜質(zhì)。室溫離心3min，再將上清液轉(zhuǎn)移至另一干凈的離心管中，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，一20度下放置20min ;12000 g常溫離心5min ;倒盡上清，加75%乙醇浸洗；12000 g常溫離心5min ;超凈臺(tái)上風(fēng)干DNA ;根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的加入10 — 20 μ I RNase A的水溶解，37° C消化半小時(shí)，質(zhì)粒于_20°C保存?zhèn)溆谩８┺r(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞制備方法是挑取單菌落接種于5ml含rif的YEB液體培養(yǎng)基中，28 °C，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；取2ml菌液轉(zhuǎn)入50mlYEB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD值為O. 3-0. 4 ;轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管,冰浴30min ；5000rpm離心5min,去上清；加入Iml20mmol/LCaC12 重懸菌液；5000rpm 離心 5min,去上清；加入 200 μ I 20mmol/L CaC12 重懸菌液，細(xì)胞懸浮液可立即用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)或添加冷凍保護(hù)劑后超低溫冷凍貯存?zhèn)溆谩＾r(nóng)桿菌細(xì)胞的凍融法轉(zhuǎn)化方法是取5 μ I純化的質(zhì)粒DNA，加入200 μ I感受態(tài)細(xì)胞，混勻；冰浴15min，轉(zhuǎn)入液氮冷凍lmin，迅速置37°C水浴溫浴5min ;加入600 μ IYEB液體培養(yǎng)基，280C，250r/min預(yù)表達(dá)4_5h ;取適當(dāng)體積均勻涂布于含有抗生素YEB平板；28°C培養(yǎng)2天，即可觀察到轉(zhuǎn)化子。實(shí)施例2 :構(gòu)建基因干涉表達(dá)載體
利用0sZPT5-07的基因組序列設(shè)計(jì)出兩對(duì)含不同酶切位點(diǎn)的特異引物，以日本晴基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增出兩段基因的干涉表達(dá)片段，將這兩段基因組序列分別以正向和反向連接的方式插入到PTCK303質(zhì)粒中一段水稻內(nèi)含子的兩側(cè)，構(gòu)建了如圖2中A所示的基因的干涉表達(dá)載體0sZPT5-07- RNAi。PCR擴(kuò)增正向和反向連接片段所用的引物分別是(下劃線部分分別為治7/7 I /BatnH \ ^Spe I /Sac I的酶切位點(diǎn))
正向連接GGGGTACCGCCAAACCAAAACTACATGA CGGGATCCTCTAGTTCTTCAACCGAGGA，
反向連接GGACTAGTGCCAAACCAAAACTACATGA CGAGCTC TCTAGTTCTTCAACCGAGGA 以日本晴基因組DNA模板和正向連接序列弓丨物PCR擴(kuò)增出582bp的0sZPT5_07正向連接片段。用式μ I /BamH I同時(shí)雙酶切PCR產(chǎn)物及pTCK303載體。將兩者用膠回收試劑盒分別回收后，回收產(chǎn)物按照一定比例混勻、于16°C過(guò)夜連接后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中。挑取大腸桿菌單菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒,用治7/7 I /BamH I雙酶切后電泳檢測(cè)結(jié)果顯示有一條如圖2中B所示的580bp左右的條帶，表明0sZPT5-07的干擾片段已經(jīng)正向連接入載體pTCK303中，暫將該中間載體命名為口了0(303- 517^-07-1。以日本晴的基因組DNA模板和反向連接序列弓丨物PCR擴(kuò)增出582bp的Z0S5-07序列。用I /Sac I同時(shí)雙酶切該P(yáng)CR產(chǎn)物和中間載體？了0(303- 517^-07-1。將兩者用膠回收試劑盒分別回收后，將兩種回收產(chǎn)物按照一定比例混勻、于16°C過(guò)夜連接后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中。挑取大腸桿菌單菌落搖菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用I /Sac I雙酶切后電泳檢測(cè)結(jié)果顯示有一條如圖2中C所示的I. 7kb左右的條帶(包括兩段0sZPT5-07的干擾片段和PTCK303質(zhì)粒上原有的一段水稻內(nèi)含子序列)，表明的干擾片段已經(jīng)反向連接入中間載體pTCK303-flsZ/^-07-l中。至此，兩段0sZPT5-07的干擾片段分別以正向和反向連接入PTCK303質(zhì)粒中，提取該質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，挑選出陽(yáng)性克隆用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化。 擴(kuò)增0sZPT5_07干擾片段的PCR反應(yīng)體系是將48ul超純水、8ul IOXExTaq Buffer、9ul dntp (2. 5 mm)、7ul引物、4ul ExTaq酶和4ul基因組DNA充分混勻，總體積為80ul。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性 4min，94°C變性 lmin，65°C退火 30s，72°C延伸 40s, 32個(gè)循環(huán)，72°C延伸10min，10°C保存。所用的酶切體系為30ul PCR產(chǎn)物或者質(zhì)粒，8ul I XL Buffer，每種內(nèi)切酶3ul，無(wú)菌水36 ul，總體積80ul?；靹蚝蠓庞?7°C水浴鍋保溫4-6小時(shí)。質(zhì)粒DNA的提取、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備和與熱激法轉(zhuǎn)化、根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞制備與凍融法轉(zhuǎn)化的方法同實(shí)施例I。實(shí)施例3 :過(guò)量表達(dá)和干涉表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化水稻 ⑴水稻遺傳轉(zhuǎn)化
將粳稻品種中花15的種子放入50ml的三角瓶中，用70%的乙醇消毒2分鐘后加入3%的次氯酸繼續(xù)消毒滅菌25min ;種子用無(wú)菌水清洗2_3次后轉(zhuǎn)入無(wú)菌的濾紙上于超凈工作臺(tái)上晾干；將種子接到NB培養(yǎng)基上，每皿以15 20粒為宜，置于27° C恒溫箱中暗培養(yǎng)2周；將種子長(zhǎng)出的芽和根掐掉，留下的愈傷組織經(jīng)過(guò)1-2次繼代培養(yǎng)；挑選生長(zhǎng)迅速、顏色鮮黃、表面光滑、質(zhì)地致密、直徑大小為2-3mm的胚性愈傷組織顆粒用于遺傳轉(zhuǎn)化。將挑選出的愈傷組織置于27°C預(yù)培養(yǎng)3 5天；分別將活化好的帶有過(guò)量表達(dá)和干涉表達(dá)重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌EHA105懸浮于添加有IOOuM乙酰丁香酮的AMM液體培養(yǎng)基中，于超凈臺(tái)中混勻后靜置I 2h形成農(nóng)桿菌懸浮液；將預(yù)培養(yǎng)3 5天的愈傷轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌懸浮液中，30min后倒掉菌液，將愈傷組織置于無(wú)菌紙上晾干后轉(zhuǎn)入添加有IOOuM乙酰丁香酮的NB培養(yǎng)基上，于25°C條件下暗培養(yǎng)3天；用含潮霉素和抗生素的無(wú)菌水將愈傷組織經(jīng)表面的農(nóng)桿菌洗脫后置于在含有30 mg/L潮霉素的篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)15天，后再重復(fù)篩選培養(yǎng)一次；30天后，將篩選出的愈傷組織轉(zhuǎn)至含有50 mg/L潮霉素的篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選一周。將繼續(xù)增生分裂的抗性愈傷轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上于光照條件下培養(yǎng)，一周后愈傷開(kāi)始轉(zhuǎn)綠，三周后開(kāi)始長(zhǎng)出幼芽和根，當(dāng)芽長(zhǎng)至2-3cm時(shí)，移至1/2MS培養(yǎng)基上；待幼苗在生根培養(yǎng)基上生長(zhǎng)10天、在水中煉苗3天后再移至大田。⑵增強(qiáng)0sZPT5_07表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株表型
利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將基因過(guò)量表達(dá)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化中花15后分化出23個(gè)Ttl株系。提取葉片的DNA，用潮霉素抗性基因的特異引物對(duì)Ttl株系進(jìn)行PCR檢測(cè)(轉(zhuǎn)基因水稻能擴(kuò)增出780bp的片段)。結(jié)果顯示有18個(gè)Ttl株系能擴(kuò)增出一條如圖3中A所示的780bp左右的特異條帶，說(shuō)明這18個(gè)Ttl株系就是轉(zhuǎn)基因植株，按單株收獲其種子。同時(shí)，提取這些轉(zhuǎn)基因Ttl植株根系的RNA，用半定量RT-PCR分析0sZPT5_07在轉(zhuǎn)基因水稻中的表達(dá)水平。結(jié)果如圖3中B所示，所有檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因植株中0sZPT5-07的表達(dá)水平明顯增強(qiáng)。用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻的PCR擴(kuò)增潮霉素抗性基因片段的引物是上游引物為ATGCCTGAACTCACCGCGAC，下游引物為 CTATTCCTTTGCCCTCGGAC。PCR 擴(kuò)增的體系為超純水13 ul, IOXExTaq Buffer2ul,2. 5 mm dNTP O. 4ul，引物 I. 6ul，ExTaq 酶O. 2ul，基因組DNA1.6ul。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94°〇預(yù)變性41^11，941變性 lmin，68°C退火 40s，72°C延伸 40s，32個(gè)循環(huán)，72°C延伸10min，10°C保存。半定量RT-PCR分析方法是用TRIZOL法(Invitrogen)提取水稻幼根中的總RNA。用SYBRk Primescript RT-PCR kit將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，稀釋10倍后用于半定·量RT-PCR分析，并以JOT#基因作對(duì)照。半定量RT-PCR分析所用基因的引物序列是上游引物為GCCAAACCAAAACTACATGA，和下游引物為T(mén)CTAGTTCTTCAACCGAGGA ;半定量RT-PCR分析所用JCTJtV引物序列是上游引物為CCAGATCATGTTTGAGACCT，下游引物為GTACCACCACTGAGAACGAT。為了觀察0sZPT5_07過(guò)量表達(dá)對(duì)水稻根系發(fā)育的影響，將6個(gè)轉(zhuǎn)基因T1株系的種子發(fā)芽后用自來(lái)水于28°C光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行水培；一周后每個(gè)株系選取生長(zhǎng)基本一致的植株，換用營(yíng)養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2周。同時(shí)提取幼苗葉片DNA，用潮霉素特異引物進(jìn)行PCR鑒定，將T1株系中的植株區(qū)分為轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株。結(jié)果如圖3中C所示，轉(zhuǎn)基因水稻幼苗的根系生長(zhǎng)明顯旺盛，其主根的平均長(zhǎng)度比對(duì)照長(zhǎng) 3cm(轉(zhuǎn)基因幼苗的主根長(zhǎng)度平均
5.52±0. 87cm，非轉(zhuǎn)基因幼苗主根長(zhǎng)度平均2. 55±0. 69cm)，而且側(cè)根的數(shù)量也比對(duì)照明顯增多。表明增強(qiáng)0sZPT5-07的表達(dá)明顯促進(jìn)了稻幼苗的根系的生長(zhǎng)。⑶減少0sZPT5_07基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株表型
利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將干擾基因表達(dá)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化中花15后分化出37個(gè)Ttl株系。提取葉片的DNA，用潮霉素抗性基因特異引物對(duì)這些Ttl株系進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示有21個(gè)Ttl株系能擴(kuò)增出一條如圖4中A所示的780bp左右的特異條帶，說(shuō)明這21個(gè)Ttl株系就是轉(zhuǎn)基因植株，按單株收獲其種子。同時(shí)，提取這些轉(zhuǎn)基因Ttl植株根系的RNA，用半定量RT-PCR分析在轉(zhuǎn)基因水稻中的表達(dá)水平。結(jié)果如圖4中B所示，所有檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因植株中基因在根系中的表達(dá)量明顯下降。轉(zhuǎn)基因植株的鑒定和基因表達(dá)水平的半定量RT-PCR分析方法與上述⑵相同。為了觀察干擾表達(dá)對(duì)水稻根系發(fā)育的影響，將21個(gè)轉(zhuǎn)基因T1株系中的8個(gè)株系的種子發(fā)芽后用自來(lái)水于28°C光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行水培。從發(fā)芽后3天起，每隔2天記錄單株的幼苗的根部形態(tài)。同時(shí)，提取幼苗葉片DNA，用潮霉素特異引物進(jìn)行PCR鑒定，將T1株系中的植株區(qū)分為轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株。結(jié)果如圖4中C所示，降低
表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻幼苗的根系生長(zhǎng)明顯受到抑制。其中，發(fā)芽后7天的轉(zhuǎn)Z0K7-RNAi幼苗根平均為4. 18±0· 57 cm,比對(duì)照非轉(zhuǎn)基因幼苗主根(平均為6. 43±0· 81 cm)短 2cm (圖3中C);同時(shí)，轉(zhuǎn)基因水稻幼苗側(cè)根的數(shù)目和長(zhǎng)度也比對(duì)照明顯減少。表明降低表達(dá)明顯抑制了水稻幼苗根系的生長(zhǎng)。
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權(quán)利要求
1.一種鋅指蛋白基因在調(diào)節(jié)水稻根系發(fā)育中的應(yīng)用，其特征在于，所述鋅指蛋白基因?yàn)镃2H2型鋅指蛋白基因其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示，該基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的鋅指蛋白基因在調(diào)節(jié)水稻根系發(fā)育中的應(yīng)用，其特征在于，將含有基因的過(guò)表達(dá)真核重組質(zhì)粒或含有基因的RNA干涉表達(dá)真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化水稻，獲得轉(zhuǎn)基因植株。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的鋅指蛋白基因在調(diào)節(jié)水稻根系發(fā)育中的應(yīng)用，其特征在于，所述過(guò)表達(dá)真核重組質(zhì)粒是將基因全長(zhǎng)編碼序列插入到真核表達(dá)載體中獲得。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鋅指蛋白基因在調(diào)節(jié)水稻根系發(fā)育中的應(yīng)用，其特征在于，所述真核表達(dá)載體為PTCK303。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的鋅指蛋白基因在調(diào)節(jié)水稻根系發(fā)育中的應(yīng)用，其特征在于，所述RNA干涉表達(dá)真核重組質(zhì)粒是由基因片段和真核表達(dá)載體構(gòu)成；所述0sZPT5-07基因片段是位于起始密碼子下游335bp至917bp的核苷酸序列，將所述基因片段分別以正向和反向插入到真核表達(dá)載體中，正向插入的基因片段和反向插入的基因片段之間存在有478bp的內(nèi)含子序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因的RNA干涉表達(dá)真核重組質(zhì)粒，其特征在于，所述真核表達(dá)載體為PTCK303。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體涉及一種鋅指蛋白基因在調(diào)節(jié)水稻根系發(fā)育中的應(yīng)用。其核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示，其編碼的氨基酸序列如序列表SEQIDNO.2所示。將所述基因全長(zhǎng)編碼序列、所述基因片段正向和反向插入到真核載體中，獲得本發(fā)明所述OsZPT5-07基因過(guò)量表達(dá)、RNA干涉表達(dá)的真核重組質(zhì)粒。將上述兩種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化水稻，分別獲得OsZPT5-07過(guò)量表達(dá)和降低表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。實(shí)驗(yàn)表明與野生型相比，增強(qiáng)OsZPT5-07表達(dá)的水稻幼苗根系發(fā)達(dá)，而減少OsZPT5-07表達(dá)的水稻幼苗根系短而少。因此，本發(fā)明所述的基因?qū)λ靖档陌l(fā)育具有調(diào)控作用，可以用于改良水稻根系性狀。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102796760SQ201210283798
公開(kāi)日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月10日
發(fā)明者段遠(yuǎn)霖, 吳為人, 王傳蕾 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)