專利名稱：一種長爪沙鼠生物凈化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生物凈化領(lǐng)域，具體涉及一種長爪沙鼠生物凈化的方法。
背景技術(shù)：
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生物凈化是指在保留該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳性狀的前提下，提高該品種品系的微生物和寄生蟲質(zhì)量等級(jí)。按微生物學(xué)質(zhì)量控制的程度或根據(jù)微生物凈化程度分類，可分為五類(I)普通動(dòng)物(conventional animals):亦稱一級(jí)動(dòng)物,在微生物學(xué)控制上要求最低的動(dòng)物，它要求不攜帶人畜共患病和動(dòng)物烈性傳染病的病原。因價(jià)格低，故教學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用之。(2)清潔動(dòng)物(clean animals):亦稱二級(jí)動(dòng)物，除普通動(dòng)物應(yīng)排除的病原外，不 攜帶對(duì)動(dòng)物危害大和對(duì)科學(xué)研究干擾大的病原。(3)無特殊病原體動(dòng)物(specific-pathogen free animals):亦稱三級(jí)動(dòng)物，是指動(dòng)物體內(nèi)無特定的微生物和寄生蟲存在，但帶有非特定的微生物和寄生蟲的動(dòng)物。此類動(dòng)物應(yīng)排除一、二級(jí)動(dòng)物所排除的病原外，不攜帶主要潛在感染或條件致病和對(duì)科研實(shí)驗(yàn)干擾大的病原。(4)無菌動(dòng)物(germ-free animals):是指在動(dòng)物體內(nèi)外的任何部位都檢不出一切生命體的動(dòng)物。這類動(dòng)物系在無菌條件下剖腹產(chǎn)出，又飼養(yǎng)在無菌、恒溫、恒濕的條件下，食品飲料等全部無菌。(5)悉生動(dòng)物(gnotobiotes animals):是指機(jī)體內(nèi)帶著已知微生物的動(dòng)物。此種動(dòng)物原是無菌動(dòng)物，系人為將指定微生物叢投給其體內(nèi)，例如使大腸桿菌定居在無菌小鼠體內(nèi)，在進(jìn)行微生物檢查時(shí)僅能檢出大腸桿菌。依據(jù)GB14922-2001《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測》劃分的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物等級(jí)，并與寄生蟲學(xué)等級(jí)對(duì)應(yīng)，將實(shí)驗(yàn)小鼠和大鼠的微生物等級(jí)分為清潔級(jí)、無特定病原體級(jí)(SPF)和無菌級(jí)三個(gè)級(jí)別，普通級(jí)的實(shí)驗(yàn)小鼠和大鼠原則上不再使用；豚鼠、地鼠和兔分為普通級(jí)、清潔級(jí)、SPF級(jí)和無菌級(jí)四個(gè)級(jí)別。犬和猴分為普通級(jí)和SPF級(jí)二個(gè)級(jí)別。長爪沙鼠(Mongoliangerbil,Meriones unguiculatus)亦稱長爪沙土鼠，蒙古沙鼠或黑爪蒙古沙土鼠(內(nèi)蒙一帶)，黃耗子(河北壩上地區(qū))，砂耗子等。在動(dòng)物分類學(xué)上屬于哺乳綱，嚙齒目，倉鼠科，沙鼠亞科，沙鼠屬。分布在內(nèi)蒙古自治區(qū)及其毗鄰的省區(qū)，包括河北省北部、山西、陜西、甘當(dāng)、寧夏、青海等地的草原地帶。蒙古人民共和國和蘇聯(lián)布里亞特地區(qū)也有分布。長爪沙鼠是一個(gè)正在被國內(nèi)外開發(fā)、有著廣闊應(yīng)用前景的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品種，野生狀態(tài)的長爪沙鼠世代生活在高海拔的干旱、半干旱的草原地帶，其生存環(huán)境的典型特點(diǎn)表現(xiàn)為食物貧乏、病原微生物較內(nèi)陸地區(qū)稀少等，由于特殊環(huán)境對(duì)該種群的長期選擇，長爪沙鼠在脂質(zhì)代謝、腎功能、免疫學(xué)等諸多方面的遺傳特性上與其他人工馴化的嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存在較大區(qū)別。因其具有獨(dú)特的生物學(xué)特征，長爪沙鼠已被廣泛用于腦神經(jīng)、寄生蟲病、微生物、生殖、內(nèi)分泌、營養(yǎng)、代謝及藥理、腫瘤等諸多領(lǐng)域研究，被稱為“多功能”實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。我國現(xiàn)有的長爪沙鼠為普通級(jí)種群，隨著生命科學(xué)的發(fā)展和社會(huì)公共安全意識(shí)的提高，科研試驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量、微生物等級(jí)的要求也隨之升高，客觀上要求提供清潔級(jí)以上等級(jí)的長爪沙鼠用于科學(xué)研究。現(xiàn)階段，國內(nèi)尚無長爪沙鼠生物凈化的研究報(bào)道，也無該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)孕鼠選擇和臨產(chǎn)期判斷、無菌剖腹產(chǎn)、長爪沙鼠仔鼠的代乳、IVC飼養(yǎng)管理和微生物檢測技術(shù)等諸方面的操作技術(shù)的文字記載。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種長爪沙鼠生物凈化 的方法，該方法可以將長爪沙鼠的微生物和寄生蟲等級(jí)由普通級(jí)凈化為清潔級(jí)。一種長爪沙鼠生物凈化的方法，包括步驟(I)選取在無菌條件下剖腹產(chǎn)出的長爪沙鼠仔鼠，以ICR泌乳小鼠作為長爪沙鼠仔鼠的代乳母鼠提供母乳或者人工授乳，在長爪沙鼠仔鼠17-20日齡時(shí)開始增加含兔乳的小鼠飼料粉末，每IOOg小鼠飼料粉末中含兔乳60ml-70ml，直至長爪沙鼠仔鼠在25-30日齡體重達(dá)16g后安全離乳，得到離乳后的長爪沙鼠仔鼠；(2)對(duì)步驟(I)中生產(chǎn)長爪沙鼠仔鼠的長爪沙鼠母鼠進(jìn)行支原體、泰澤病原體和其他垂直感染微生物檢測；若長爪沙鼠母鼠泰澤病原體抗體呈陽性，則檢測離乳后的長爪沙鼠仔鼠泰澤病原體抗體，離乳后的長爪沙鼠仔鼠抗體呈陽性者棄去，呈陰性者留用；若長爪沙鼠母鼠支原體呈陽性，則棄去其生產(chǎn)的所有長爪沙鼠仔鼠；微生物檢測的主要原則為①長爪沙鼠母鼠檢測結(jié)果呈陽性，則其生產(chǎn)的長爪沙鼠仔鼠全部檢測，呈陽性者棄去，呈陰性者留用長爪沙鼠母鼠檢測結(jié)果可疑，則其生產(chǎn)的長爪沙鼠仔鼠抽樣檢測，抽樣比例為其生產(chǎn)的長爪沙鼠仔鼠總數(shù)的40%以上，呈陽性者棄去，呈陰性者留用長爪沙鼠母鼠檢測結(jié)果呈陰性，則其生產(chǎn)的長爪沙鼠仔鼠不檢測，直接留用；(3)將步驟(2)中支原體、泰澤病原體和其他垂直感染微生物檢測合格(呈陰性)的離乳后的長爪沙鼠仔鼠放入屏障系統(tǒng)單獨(dú)飼養(yǎng)，并跟蹤檢測2代支原體、泰澤病原體和其他垂直感染微生物，合格者(呈陰性)作為清潔級(jí)長爪沙鼠。為了達(dá)到更好的發(fā)明效果，優(yōu)選所述的含兔乳的小鼠飼料粉末的添加次數(shù)為每天2-5次。每次以長爪沙鼠仔鼠吃飽為宜。在長爪沙鼠仔鼠17-20日齡時(shí)開始增加含兔乳的小鼠飼料粉末，有助于剖腹產(chǎn)出的長爪沙鼠仔鼠實(shí)現(xiàn)正常離乳，并于正常離乳前達(dá)到優(yōu)于自然分娩ICR小鼠代乳的體重水平。進(jìn)一步優(yōu)選，每IOOg小鼠飼料粉末中含兔乳67ml。所述的含兔乳的小鼠飼料粉末的制備方法，包括將小鼠飼料制成小鼠飼料粉末，添加滅菌后的兔乳，混合均勻，制得含兔乳的小鼠飼料粉末。所述的小鼠飼料具體可參照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物配合飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB14924. 2-2001)和《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物配合飼料營養(yǎng)成分》(GB14924. 3-2010)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，可采用市售產(chǎn)品(如浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料生產(chǎn)基地生產(chǎn)的大、小鼠輻照繁殖料，質(zhì)量規(guī)格0 12mm顆粒)。所述的長爪沙鼠母鼠在剖腹產(chǎn)前12-24小時(shí)肌肉注射2_4mg/次 只的劑量的黃體酮，每只總劑量不超過6mg，以延長孕鼠分娩時(shí)間，方便綜合運(yùn)用觀察法、觸診法、黃體酮法等判定孕鼠分娩時(shí)間點(diǎn)，把握最佳剖腹產(chǎn)時(shí)機(jī)。在無菌條件下剖腹的條件包括應(yīng)用質(zhì)量百分濃度為2%的過氧乙酸水溶液作為消毒液，質(zhì)量百分濃度為5%的NaOH水溶液中和消毒液，以及紗布端斷臍和止血，環(huán)境溫度為30°C _33°C，提高無菌剖腹產(chǎn)手術(shù)成功率。所述的人工授乳，每日授乳量Y與大鼠體重X的關(guān)系為Y = 0. 361x-0. 167，Y的單位為mg，x的單位為g。授乳方法一般是每隔4h—次，每日6次，每次以喂飽為宜。人工授乳的乳液可采用母鼠乳液或者市售的與母鼠乳液營養(yǎng)成分相近的人工乳。所述的ICR泌乳小鼠為產(chǎn)乳周期為20天以上且性情溫順的ICR泌乳小鼠。以ICR泌乳小鼠作為長爪沙鼠仔鼠的代乳母鼠提供母乳時(shí)，在ICR泌乳小鼠和長爪沙鼠仔鼠初次接觸時(shí)預(yù)留ICR泌乳小鼠親仔1-2只，同時(shí)將長爪沙鼠仔鼠放置在ICR泌乳小鼠籠內(nèi)，輕柔地將長爪沙鼠仔鼠與籠內(nèi)墊料充分混翻，確保長爪沙鼠染味，混養(yǎng)數(shù)小時(shí) 后，若發(fā)現(xiàn)長爪沙鼠仔鼠的腹部有乳白色乳液，表明授乳成功，此時(shí)將ICR泌乳小鼠親仔取出。選取產(chǎn)乳周期相對(duì)較長，性情溫順的ICR泌乳小鼠作為長爪沙鼠仔鼠代乳鼠，在代乳鼠和仔鼠初次接觸時(shí)采用合理的染味、觀察等方法提高代乳成功率。優(yōu)選，于長爪沙鼠仔鼠17-20日齡時(shí)按5g/天/只的量添加兔乳，直至安全離乳?？蛇M(jìn)一步助于剖腹產(chǎn)出的長爪沙鼠仔鼠實(shí)現(xiàn)正常離乳，并于正常離乳前達(dá)到優(yōu)于自然分娩ICR小鼠代乳的體重水平。所述的兔乳為泌乳母兔分泌的新鮮乳汁，即兔乳原液；可人工采集泌乳母兔新鮮乳汁，于_20°C保存待用。臨用前，取出乳汁后，經(jīng)高壓蒸汽(115°C，15min)滅菌備用。所述的其他垂直感染微生物包括弓形蟲、小鼠肝炎病毒、流行性出血熱病毒等，主要包括弓形蟲、小鼠肝炎病毒和流行性出血熱病毒。因長爪沙鼠好動(dòng)，為保持內(nèi)環(huán)境清潔，安全離乳前(即整個(gè)代乳或授乳過程)最好每3天更換一次墊料。長爪沙鼠生性好動(dòng)，墊料消耗大，且容易變臟。在高壓滅菌草紙、木屑等材料中選擇合適的墊料及更換周期，理想的溫濕度控制等，是長爪沙鼠IVC飼養(yǎng)管理的重要工作。由于待凈化的孕鼠自然分娩存在病原微生物對(duì)仔鼠的污染，因此，為實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生物凈化目標(biāo)，需采用無菌剖腹產(chǎn)的仔鼠，并需建立代乳技術(shù)和微生物監(jiān)測?，F(xiàn)有長爪沙鼠為普通級(jí)種群，不適合作為無菌剖腹產(chǎn)的仔鼠的代乳鼠。本發(fā)明選擇合適的其他品種品系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物=ICR泌乳小鼠作為代乳鼠，確保仔鼠乳量充足、貫穿整個(gè)哺乳期直到離乳，是本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)。微生物檢測結(jié)果是長爪沙鼠生物凈化成功與否的衡量標(biāo)準(zhǔn)，因此，本發(fā)明在實(shí)施生物凈化前對(duì)普通級(jí)和生物凈化的長爪沙鼠種群進(jìn)行全面的微生物普查，并在生物凈化過程中不斷對(duì)親代長爪沙鼠和生物凈化后長爪沙鼠進(jìn)行微生物監(jiān)測。普查主要針對(duì)存在垂直傳播風(fēng)險(xiǎn)的泰澤病原體和支原體，選擇合適的監(jiān)測方案直接關(guān)系生物凈化的成敗。


圖I為分別以長爪沙鼠、ICR小鼠和SD大鼠代乳的自然分娩仔代長爪沙鼠(仔長爪沙鼠)每窩存活率趨勢圖；圖2為分別以長爪沙鼠、ICR小鼠和SD大鼠代乳的自然分娩仔代長爪沙鼠(仔長爪沙鼠)生長曲線比較；圖3為本發(fā)明生物凈化代乳仔代長爪沙鼠與自然分娩母乳喂養(yǎng)長爪沙鼠的生長曲線比較；圖4為剖腹產(chǎn)長爪沙鼠仔鼠由ICR泌乳小鼠代乳并配合輔料飼養(yǎng)與剖腹產(chǎn)長爪沙鼠仔鼠由ICR小鼠代乳至斷奶、自然分娩長爪沙鼠仔鼠由ICR小鼠代乳和由親母鼠代乳的生長曲線比較。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I長爪沙鼠孕鼠選擇和臨產(chǎn)期判斷、無菌剖腹產(chǎn)、長爪沙鼠仔鼠的代乳、IVC飼養(yǎng)管理和微生物檢測技術(shù)等諸方面的關(guān)鍵技術(shù)。
I.孕鼠選擇和臨產(chǎn)期判斷長爪沙鼠與大鼠、小鼠不同，長爪沙鼠是“一夫一妻”長期同居的繁殖方式，因此選擇普通級(jí)3月齡的長爪沙鼠雌雄比I : I進(jìn)行同居交配。小鼠的妊娠期為19-21天，長爪沙鼠妊娠期24-26天，因此代乳ICR小鼠的交配一般較剖腹產(chǎn)母鼠交配時(shí)間遲3-4天，即ICR代乳母鼠在剖腹產(chǎn)手術(shù)前12-36小時(shí)內(nèi)分娩。長爪沙鼠交配后不容易見到明顯的陰道栓，很難通過查找陰道栓的方法推算長爪沙鼠的預(yù)產(chǎn)期。此外，嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在接近出生前的24h內(nèi)生長發(fā)育最旺盛，仔鼠初生時(shí)20%體重都是在最后24h內(nèi)生長的，提早幾個(gè)小時(shí)或者十幾小時(shí)進(jìn)行剖腹產(chǎn)都會(huì)對(duì)胎兒的成熟造成很大影響，因此通過計(jì)算長爪沙鼠雌雄同居時(shí)間，綜合運(yùn)用觀察法、觸診法、黃體酮法等多種方法來判斷確定孕長爪沙鼠分娩時(shí)間點(diǎn)，把握最佳剖腹產(chǎn)時(shí)機(jī)。通過①觀察法觀察分娩前孕鼠躁動(dòng)不安、清理產(chǎn)床，孕長爪沙鼠下腹部膨大、外陰濕潤鮮紅且陰道口擴(kuò)大，待孕鼠俯臥巢內(nèi)并見流血和羊水后即表明將分娩。②觸診法安靜自然保定分娩期(妊娠后期)孕長爪沙鼠，通過觸摸其腹部，對(duì)比感覺腹肌松弛度，胎仔頭硬度，胎仔頭和軀干大小，當(dāng)胎仔頭和軀干大小一致(寬度達(dá)到約0.8-1. 2cm)，腹肌松弛，胎仔頭硬度較大時(shí)，則可判斷為孕長爪沙鼠分娩時(shí)機(jī)成熟。③黃體酮法長爪沙鼠分娩通常發(fā)生在夜間，為適當(dāng)順延分娩時(shí)間，提高剖腹產(chǎn)手術(shù)的成功率，需預(yù)先給孕長爪沙鼠肌肉注射黃體酮。一般對(duì)預(yù)計(jì)2小時(shí)內(nèi)或夜間產(chǎn)仔的孕長爪沙鼠肌肉注射2-4mg/(次 只)劑量的黃體酮，動(dòng)物可于注射后12-24小時(shí)內(nèi)施行剖腹產(chǎn)手術(shù)。須注意給藥總劑量不宜過多(總劑量不超過6mg，次數(shù)不超過3次)，否則易導(dǎo)致剖腹產(chǎn)胎仔鼠發(fā)黑、過于成熟，甚至出現(xiàn)死胎現(xiàn)象。2.剖腹產(chǎn)手術(shù)整個(gè)手術(shù)過程應(yīng)無菌操作。用約35°C的蒸餾水配制質(zhì)量百分濃度為2%過氧乙酸消毒液。采用頸椎脫白法處死孕鼠后，迅速將其浸入消毒液5s，置于手術(shù)臺(tái)，固定四肢。消毒大鼠腹部，用滅菌剪、鑷開腹腔，暴露子宮。用止血鉗夾住兩側(cè)輸卵管前側(cè)和子宮遠(yuǎn)端，從遠(yuǎn)端切斷子宮，此過程操作應(yīng)迅速，約需45-60S。切取子宮后，將其連同止血鉗迅速放入35°C滅菌消毒液中浸泡約10s。立即以質(zhì)量百分濃度5% NaOH堿液(溶劑為水)中和消毒液，并用滅菌蒸餾水沖洗，以紗布吸附剩余液體。滅菌鑷子迅速撕開子宮，破羊膜取出胎仔，用紗布或棉簽去除羊水，擦凈胎盤和胎仔，特別是胎仔的口鼻處。以濕棉簽輕輕按摩胎仔胸部，刺激其獲得自主呼吸，全過程需密切注意保溫。至胎仔全身呈鮮紅色，扭曲臍帶，并用無菌紗布扯斷臍帶并壓迫止血。自主呼吸的仔鼠體色由紫紅色逐漸轉(zhuǎn)成鮮紅色，約半小時(shí)后可開始授乳或接受代乳。留取部分胎盤和子宮放入試管，取出隔離器后進(jìn)行微生物檢測。新生幼仔的剖腹取胎時(shí)手術(shù)臺(tái)環(huán)境溫度一般控制在30_33°C，與代乳鼠合攏后降至 20-26 °C，濕度 40-70%。3.雌鼠代乳技術(shù)選取經(jīng)產(chǎn)、母性較好的ICR雌鼠為剖腹產(chǎn)長爪沙鼠的代乳母鼠。在已確定乳母鼠懷孕的情況下，應(yīng)將雄鼠移出，以免生產(chǎn)后又懷孕，影響帶乳。將生產(chǎn)前2-3天的ICR小鼠轉(zhuǎn)移到凈化室，以適應(yīng)環(huán)境。ICR小鼠在生產(chǎn)前三天停止更換墊料。選取產(chǎn)乳周期為20天以上且性情溫順的ICR泌乳小鼠作為長爪沙鼠仔鼠的代乳母鼠，在完成剖腹產(chǎn)術(shù)后，ICR泌乳小鼠的親仔留下1-2只，同時(shí)將剛剖腹產(chǎn)出來的長爪沙鼠仔鼠(仔長爪沙鼠)放置在乳母鼠籠內(nèi)，輕柔地將其與籠內(nèi)墊料充分混翻，確保長爪沙鼠染味，該程序?qū)θ槟甘蟮氖谌橹陵P(guān)重要。混養(yǎng)數(shù)小時(shí)后，若發(fā)現(xiàn)長爪沙鼠仔鼠的腹部有乳白色乳液，表明授乳成功，此時(shí)應(yīng) 將ICR泌乳小鼠親仔取出。由于長爪沙鼠和ICR小鼠在離乳期上的差別，代乳長爪沙鼠仔鼠從17日齡開始體重增加會(huì)出現(xiàn)明顯停滯，提示營養(yǎng)供應(yīng)不足，因此在17-20日齡時(shí)開始增加軟料，即含67%(v/w,ml兔乳/IOOg小鼠飼料粉末)兔乳的小鼠飼料粉末，每天至少添加兩次，每次以長爪沙鼠仔鼠吃飽為宜。軟料(即含兔乳的小鼠飼料粉末)的制備將小鼠飼料(浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料生產(chǎn)基地生產(chǎn)的大、小鼠輻照繁殖料，質(zhì)量規(guī)格0 12mm顆粒)粉碎成粉末，置無菌瓶皿中，添加高壓滅菌后的兔乳，將飼料粉末充分?jǐn)嚢杌靹蛑吝m當(dāng)濕度即可，每次添加兔乳不可太多。同時(shí)在長爪沙鼠仔鼠17-20日齡時(shí)按5g/天/只的量添加兔乳，直至安全離乳。代乳期間每3天更換一次墊料。代乳仔長爪沙鼠在25-30日齡間，體重達(dá)16g可安全離乳，得到離乳后的長爪沙鼠仔鼠。4.微生物檢測本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在長爪沙鼠易感病原體中存在垂直感染導(dǎo)致生物凈化失敗風(fēng)險(xiǎn)的主要為支原體和泰澤病原體。孕長爪沙鼠在實(shí)施剖腹產(chǎn)手術(shù)前摘眼球采血檢測泰澤病原體抗體，剖腹產(chǎn)手術(shù)后迅速實(shí)施無菌取氣管，經(jīng)研磨過0. 45 y m濾膜，進(jìn)行支原體培養(yǎng)。泰澤病原體抗體檢測及支原體培養(yǎng)具體操作依據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物質(zhì)量控制的國家標(biāo)準(zhǔn)(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物泰澤病原體檢測方法GB/T 14926. 10-2008,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物支原體檢測方法GB/T14926.8-2001)。根據(jù)母鼠抗體檢測與支原體培養(yǎng)情況分別進(jìn)行處理。若母鼠泰澤病原體抗體陽性，則在仔鼠斷奶后進(jìn)行眼靜脈竇采血，再次測抗體，抗體陽性者棄去或迅速處死，以防止接觸傳播病原體。若母鼠支原體陽性，則棄去整窩仔鼠。微生物檢測的主要原則為①長爪沙鼠母鼠檢測結(jié)果呈陽性，則其生產(chǎn)的長爪沙鼠仔鼠全部檢測，呈陽性者棄去，呈陰性者留用長爪沙鼠母鼠檢測結(jié)果可疑，則其生產(chǎn)的長爪沙鼠仔鼠抽樣檢測，抽樣比例為其生產(chǎn)的長爪沙鼠仔鼠總數(shù)的40%以上，呈陽性者棄去，呈陰性者留用長爪沙鼠母鼠檢測結(jié)果呈陰性，則其生產(chǎn)的長爪沙鼠仔鼠不檢測，直接留用。將支原體、泰澤病原體和其他垂直感染微生物檢測合格的離乳后的長爪沙鼠仔鼠放入屏障系統(tǒng)單獨(dú)飼養(yǎng)，并跟蹤檢測2代支原體、泰澤病原體和其他垂直感染微生物，合格者作為清潔級(jí)長爪沙鼠。微生物跟蹤檢測主要針對(duì)易造成垂直感染病原體，主要包括泰澤氏病原體、支原體、弓形蟲、小鼠肝炎病毒、流行性出血熱病毒(檢測方法分別依據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物弓形蟲檢測方法GB/T 18448. 2-2008，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠肝炎病毒檢測方法GB/T 14926. 22-2001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物漢坦病毒檢測方法GB/T 14926. 19-2001)等。 長爪沙鼠、ICR小鼠和SD大鼠代乳比較仔長爪沙鼠經(jīng)長爪沙鼠、ICR小鼠和SD大鼠代乳后的存活率見圖I。由圖可知，SD大鼠代乳的長爪沙鼠仔鼠在3日齡開始出現(xiàn)顯著性死亡，存活率降至80%以下，到11日齡，仔鼠存活率降至47%，在17日齡更有2窩仔鼠整體淘汰；仔鼠25日齡時(shí)，存活率僅為31% ;在整個(gè)代乳期，仔鼠均存在陸續(xù)死亡現(xiàn)象。ICR小鼠代乳的48只仔鼠中，有46只存活，25日齡時(shí)存活率為95%。長爪沙鼠代乳的仔鼠中，僅一組動(dòng)物出現(xiàn)3只死亡，其余45 只均存活。通過比較各組仔鼠平均體重(見圖2)，發(fā)現(xiàn)ICR小鼠代乳的長爪沙鼠仔鼠在20日齡前平均體重均略高于長爪沙鼠代乳和SD大鼠代乳的長爪沙鼠仔鼠，個(gè)別日齡存在顯著性差異，表明ICR小鼠代乳的長爪沙鼠仔鼠生長發(fā)育情況較為理想。在20日齡后，與長爪沙鼠代乳的長爪沙鼠仔鼠比較，ICR小鼠代乳長爪沙鼠仔鼠體重增重明顯變緩，這可能與ICR小鼠哺乳周期有關(guān)。此外，SD大鼠代乳長爪沙鼠仔鼠的體重變化存在較為明顯的組內(nèi)波動(dòng)。綜合上述結(jié)果，選擇ICR小鼠作為長爪沙鼠生物凈化后的代乳鼠。 剖腹產(chǎn)及代乳情況采用未添加軟料組的生物凈化方法，共實(shí)施長爪沙鼠生物凈化臨產(chǎn)期判斷150多胎次，無菌剖腹產(chǎn)達(dá)85胎次，通過ICR代乳鼠代乳并成功斷乳167只，平均胎仔出生體重
2.9g/只，窩平均胎子數(shù)8. 4只/窩，共完成20只生物凈化代乳長爪沙鼠和正常長爪沙鼠生長曲線比較(圖3)。與母乳喂養(yǎng)的普通級(jí)長爪沙鼠相比，未添加軟料組的生物凈化后的代乳長爪沙鼠體重普遍較低，從I日齡到25日齡均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由圖4可知，與自然分娩仔鼠的ICR小鼠代乳組相比，剖腹產(chǎn)仔長爪沙鼠的生長曲線普遍較低，提示剖腹產(chǎn)手術(shù)對(duì)仔長爪沙鼠的生長發(fā)育帶來較大影響，本發(fā)明添加軟料組可顯著提高17日齡后剖腹產(chǎn)仔長爪沙鼠的體重增長速度，并于斷奶前達(dá)到優(yōu)于自然分娩ICR小鼠代乳組的體重水平，表明所添軟料有助于剖腹產(chǎn)手術(shù)中的仔長爪沙鼠實(shí)現(xiàn)正常離乳。此外，人工授乳方式可替代以ICR泌乳小鼠為長爪沙鼠仔鼠的代乳母鼠來實(shí)現(xiàn)生物凈化后仔鼠的代乳，該技術(shù)的操作方法為(以大鼠人工授乳為例說明)新生動(dòng)物(長爪沙鼠仔鼠)經(jīng)人工授乳需要非常熟練的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，包括強(qiáng)飼、吸吮二種人工授乳方法。強(qiáng)飼法可保證每次灌喂人工乳的量，而吸吮法模擬自然吸吮的方式，但控制不了每次的哺乳量。授乳方法是每隔4h—次，每日6次。每日授乳量Y(mg)與大鼠體重x(g)的關(guān)系參照一次方程Y = 0. 361x-0. 167。對(duì)于授乳時(shí)下腹部脹滿的動(dòng)物，要用脫脂棉壓迫刺激其下腹部，促其排尿；還要用浸水后擰干的脫脂棉刺激肛門，使其排糞。最為理想的人工乳是采集哺乳期8 21天的母鼠乳，或處死哺乳期幼鼠，從胃中取乳，但由于采集困難，很少采用。目前，國內(nèi)外主要采用配制與母鼠乳營養(yǎng)成分相近的人工乳，人工乳可采用市售無菌大鼠王氏(1991年)人工乳的配方(見表I)。乳鼠隨著其自身的生長發(fā)育，對(duì)營養(yǎng)的需求也在不斷變化，因而，隨著乳鼠的生長有針對(duì)性地設(shè)計(jì)不同配方的人工乳，有利于不同日齡動(dòng)物獲得生長所需營養(yǎng)。
權(quán)利要求
1.一種長爪沙鼠生物凈化的方法，包括步驟 (1)選取在無菌條件下剖腹產(chǎn)出的長爪沙鼠仔鼠，以ICR泌乳小鼠作為長爪沙鼠仔鼠的代乳母鼠提供母乳或者人工授乳，在長爪沙鼠仔鼠17-20日齡時(shí)開始增加含兔乳的小鼠飼料粉末，每IOOg小鼠飼料粉末中含兔乳60ml-70ml，直至長爪沙鼠仔鼠在25-30日齡體重達(dá)16g后安全離乳，得到離乳后的長爪沙鼠仔鼠； (2)對(duì)步驟(I)中生產(chǎn)長爪沙鼠仔鼠的長爪沙鼠母鼠進(jìn)行支原體、泰澤病原體和其他垂直感染微生物檢測；若長爪沙鼠母鼠泰澤病原體抗體呈陽性，則檢測離乳后的長爪沙鼠仔鼠泰澤病原體抗體，離乳后的長爪沙鼠仔鼠抗體呈陽性者棄去，呈陰性者留用；若長爪沙鼠母鼠支原體呈陽性，則棄去其生產(chǎn)的所有長爪沙鼠仔鼠；微生物檢測的主要原則為①長爪沙鼠母鼠檢測結(jié)果呈陽性，則其生產(chǎn)的長爪沙鼠仔鼠全部檢測，呈陽性者棄去，呈陰性者留用長爪沙鼠母鼠檢測結(jié)果可疑，則其生產(chǎn)的長爪沙鼠仔鼠抽樣檢測，抽樣比例為其生產(chǎn)的長爪沙鼠仔鼠總數(shù)的40%以上，呈陽性者棄去，呈陰性者留用；③長爪沙鼠母鼠檢測結(jié)果呈陰性，則其生產(chǎn)的長爪沙鼠仔鼠不檢測，直接留用； (3)將步驟(2)中支原體、泰澤病原體和其他垂直感染微生物檢測合格的離乳后的長爪沙鼠仔鼠放入屏障系統(tǒng)單獨(dú)飼養(yǎng)，并跟蹤檢測2代支原體、泰澤病原體和其他垂直感染微生物，合格者作為清潔級(jí)長爪沙鼠。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的長爪沙鼠生物凈化的方法，其特征在于，所述的含兔乳的小鼠飼料粉末的添加次數(shù)為每天2-5次。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的長爪沙鼠生物凈化的方法，其特征在于，每IOOg小鼠飼料粉末中含兔乳67ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或3所述的長爪沙鼠生物凈化的方法，其特征在于，所述的含兔乳的小鼠飼料粉末的制備方法，包括將小鼠飼料粉碎成小鼠飼料粉末，添加滅菌后的兔乳，混合均勻，制得含兔乳的小鼠飼料粉末。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的長爪沙鼠生物凈化的方法，其特征在于，長爪沙鼠母鼠在剖腹產(chǎn)前12-24小時(shí)肌肉注射2-4mg/次·只的劑量的黃體酮，每只總劑量不超過6mg。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的長爪沙鼠生物凈化的方法，其特征在于，所述的人工授乳，每日授乳量Y與大鼠體重X的關(guān)系為Y = O. 361χ-0. 167，Y的單位為mg，x的單位為g。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的長爪沙鼠生物凈化的方法，其特征在于，所述的ICR泌乳小鼠為產(chǎn)乳周期為20天以上且性情溫順的ICR泌乳小鼠。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的長爪沙鼠生物凈化的方法，其特征在于，以ICR泌乳小鼠作為長爪沙鼠仔鼠的代乳母鼠提供母乳時(shí)，在ICR泌乳小鼠和長爪沙鼠仔鼠初次接觸時(shí)預(yù)留ICR泌乳小鼠親仔1-2只，同時(shí)將長爪沙鼠仔鼠放置在ICR泌乳小鼠籠內(nèi)，輕柔地將長爪沙鼠仔鼠與籠內(nèi)墊料充分混翻，確保長爪沙鼠染味，混養(yǎng)數(shù)小時(shí)后，若發(fā)現(xiàn)長爪沙鼠仔鼠的腹部有乳白色乳液，表明授乳成功，此時(shí)將ICR泌乳小鼠親仔取出。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的長爪沙鼠生物凈化的方法，其特征在于，步驟(I)中，安全離乳前每3天更換一次墊料。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的長爪沙鼠生物凈化的方法，其特征在于，于長爪沙鼠仔鼠17-20日齡時(shí)按5g/天/只的量添加兔乳，直至安全離乳。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種長爪沙鼠生物凈化的方法，包括選取在無菌條件下剖腹產(chǎn)出的長爪沙鼠仔鼠，以ICR泌乳小鼠作為長爪沙鼠仔鼠的代乳母鼠給長爪沙鼠仔鼠提供母乳或者人工授乳，在長爪沙鼠仔鼠17-20日齡時(shí)開始增加含兔乳的小鼠飼料粉末，每100g小鼠飼料粉末中含兔乳60ml-70ml，直至長爪沙鼠仔鼠在25-30日齡體重達(dá)16g后安全離乳，得到離乳后的長爪沙鼠仔鼠；對(duì)長爪沙鼠母鼠和仔鼠進(jìn)行支原體和泰澤病原體等微生物檢測，合格的離乳后的仔鼠放入屏障系統(tǒng)單獨(dú)飼養(yǎng)，并跟蹤檢測2代支原體和泰澤病原體等微生物，合格者作為清潔級(jí)長爪沙鼠。該方法實(shí)現(xiàn)了將長爪沙鼠的微生物等級(jí)由普通級(jí)凈化為清潔級(jí)。
文檔編號(hào)A01K67/02GK102812920SQ201210288188
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月14日
發(fā)明者戴方偉, 盧領(lǐng)群, 宋曉明, 周莎桑, 薩曉嬰, 李長龍, 馬偉鋒, 柯賢福, 樓琦 申請(qǐng)人:浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院