專利名稱：一種歐美雜種山楊的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
楊樹屬于楊柳科(Salicaceae)楊屬(Populus L.),屬下共分白楊派、大葉楊派、青楊派、黑楊派、胡楊派5派。全世界約有楊樹百余種，其自然分布主要是在北半球的溫帶 和寒帶。我國(guó)有楊樹53種，主要分布在西南，西北，東北及華北地區(qū)。楊樹基因組較小(約為450 550Mbp),僅為擬南芥基因組的4倍,易于農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化,種間可雜交,被認(rèn)為是林木生物技術(shù)的模式樹種。楊屬白楊派又分兩個(gè)亞派白楊亞派和山楊亞派。白楊亞派包括新疆楊(P. bo I Ieana)(銀白楊變種)、銀灰楊(P. canescens)、毛白楊(P. tomentosa)；山楊亞派包括歐洲山楊(P. tremula L)、美洲山楊(P. tremuloides)、中國(guó)山楊(P. devidiana)和響葉楊(P. adenopoda);歐美雜種山楊是歐洲山楊和北美山楊的雜交種，具有生長(zhǎng)快、樹形高大、材性好等特點(diǎn)；另外該樹種材色淺，材質(zhì)較軟、細(xì)密、樹干端直，是造紙、制備膠合板和刨花板等的優(yōu)質(zhì)原料。但是楊樹屬于多年生樹種，要在短時(shí)間內(nèi)通過常規(guī)育種培育出楊樹新品種是很困難的，且通過傳統(tǒng)的楊樹育種方法己遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代育種的要求，所以利用組織培養(yǎng)技術(shù)和基因工程方法來培育抗逆楊樹新品種對(duì)楊樹育種具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種歐美雜種山楊的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種歐美雜種山楊的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法，包括如下步驟( I)預(yù)培養(yǎng)歐美雜種山楊在1/2MS培養(yǎng)基上繼代繁殖得到組培苗；選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的組培苗上帶有部分葉片的葉柄作為外植體，將所述外植體置于MS液體培養(yǎng)基中于22-24°C、80-100rpm 暗培養(yǎng) l_2d ；(2)農(nóng)桿菌的培養(yǎng)①攜帶雙元載體pMP90、pBI121的農(nóng)桿菌C58在含有30mg/L慶大霉素、50mg/L利福平、50mg/L卡那霉素的YEB固體培養(yǎng)基上于28°C劃線暗培養(yǎng)2_3d ；②挑單菌落接種到含有30mg/L慶大霉素、50mg/L利福平、50mg/L卡那霉素的60-75mlYEB 液體培養(yǎng)基中于 28 °C、150-200rpm 暗培養(yǎng) 24h，至 0D_ 為 0. 6-0. 8 ；③將步驟②獲得的菌液在3000-4000rpm離心8_10min，棄去上清液，用含有100 μ M乙酰丁香酮的MS液體培養(yǎng)基重懸菌體至OD6tltl為0. 4-0. 5，于28°C、80_100rpm繼續(xù)培養(yǎng)0. 5-lh，得到侵染液；
(3)共培養(yǎng)與芽的誘導(dǎo)①將預(yù)培養(yǎng)后的外植體浸于侵染液中，于22-24°C、80-100rpm培養(yǎng)O. 5_2h，轉(zhuǎn)移至含有100 μ M乙酰丁香酮的MSl固體培養(yǎng)基上，于22-24°C黑暗共培養(yǎng)2d ；②將共培養(yǎng)后的外植體用滅菌的300_400mg/L頭孢霉素水溶液清洗2_3次，再置于含有350mg/L頭孢霉素、50mg/L卡那霉素的MSl固體培養(yǎng)基在22-24°C，培養(yǎng)至長(zhǎng)出不定芽，在第1-7天，光照強(qiáng)度為400-6001uX，16h/d ;在第8天開始，光照強(qiáng)度為1500-20001ux，16h/d,每14d更換一次培養(yǎng)基；(4)芽的伸長(zhǎng)將帶有不定芽的外植體轉(zhuǎn)至含有350mg/L頭孢霉素、50mg/L卡那霉素的MS2固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)芽伸長(zhǎng)至3-5cm ；
(5)根的誘導(dǎo)將伸長(zhǎng)的芽轉(zhuǎn)入含有350mg/L頭孢霉素、50mg/L卡那霉素的1/2MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。步驟(I)中所述1/2MS 培養(yǎng)基包括MS 鹽 2. 2g/L，蔗糖 25_30g/L，pH=5. 6-5. 8，瓊脂 7. 0-7. 2g/L。步驟(I)中所述MS液體培養(yǎng)基包括MS鹽4. 4g/L，蔗糖25_30g/L，生長(zhǎng)素NAA1. 86mg/L,細(xì)胞分裂素 2ipl. 02mg/L, pH=5. 6-5. 8。步驟(2)中所述YEB固體培養(yǎng)基包括牛肉浸膏5.(^/1，胰蛋白胨5.(^/1，酵母提取物 I. Og/L，蔗糖 5. Og/L, MgSO4. 7H200. 5g/L，瓊脂 15g/L，pH=7. 0。步驟(2)中所述YEB液體培養(yǎng)基包括牛肉浸膏5. Og/L，胰蛋白胨5. Og/L，酵母提取物 I. Og/L，蔗糖 5. 0g/L, MgSO4. 7Η200· 5g/L，pH=7. 0。步驟(3)中所述MSI固體培養(yǎng)基包括MS鹽4. 4g/L，蔗糖20_30g/L，生長(zhǎng)素 ΙΒΑ0. lmg/L，細(xì)胞分裂素 ΒΑΡ0. 2mg/L,細(xì)胞分裂素 TDZ0. 001mg/L pH=5. 6-5. 8，瓊脂7. 0-7. 2g/L。步驟(4)中所述MS2固體培養(yǎng)基包括MS鹽4.4g/L，蔗糖20_30g/L，生長(zhǎng)素ΙΒΑ0. lmg/L,細(xì)胞分裂素 ΒΑΡ0. 2mg/L，ρΗ=5· 6-5. 8，瓊脂 7. 0-7. 2g/L。本發(fā)明的方法從外植體選擇、遺傳轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化等方面建立歐美雜種山楊高效遺傳轉(zhuǎn)化體系，本發(fā)明的方法遺傳轉(zhuǎn)化效率高。通過建立高效的歐美雜種山楊遺傳轉(zhuǎn)化體系，可在短時(shí)間內(nèi)培育出雜種山楊抗逆新品種，對(duì)楊樹抗性改良和抗逆新品種選育具有一定的理論和實(shí)際意義。


圖I為誘導(dǎo)劑乙酰丁香酮對(duì)誘導(dǎo)歐美雜種山楊(T89楊)Knf芽的影響。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。本發(fā)明的實(shí)施例是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明但不用于對(duì)本發(fā)明作任何限制。實(shí)施例I
一種歐美雜種山楊的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法，包括如下步驟( I)預(yù)培養(yǎng)T89楊(歐美雜種山楊的一種)在1/2MS培養(yǎng)基上繼代繁殖得到組培苗；選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的組 培苗上帶有部分葉片的葉柄作為外植體，將所述外植體置于MS液體培養(yǎng)基中于22°C、90rpm暗培養(yǎng)Id ；(2)農(nóng)桿菌的培養(yǎng)①攜帶雙元載體pMP90、pBI121的農(nóng)桿菌C58在含有30mg/L慶大霉素、50mg/L利福平、50mg/L卡那霉素的YEB固體培養(yǎng)基上于28°C劃線暗培養(yǎng)3d ；②挑單菌落接種到含有30mg/L慶大霉素、50mg/L利福平、50mg/L卡那霉素的70mlYEB液體培養(yǎng)基中于28°C、200rpm暗培養(yǎng)24h，至OD6tltl為O. 8 ;③將步驟②獲得的菌液在4000rpm離心8min，棄去上清液，用含有100 μ M乙酰丁香酮的MS液體培養(yǎng)基重懸菌體至OD6tltl為O. 4，于28°C、IOOrpm繼續(xù)培養(yǎng)O. 5h，得到侵染液；(3)共培養(yǎng)與芽的誘導(dǎo)①將預(yù)培養(yǎng)后的外植體浸于侵染液中，于22°C、90rpm培養(yǎng)lh，轉(zhuǎn)移至含有100 μ M乙酰丁香酮的MSl固體培養(yǎng)基上，于22°C黑暗共培養(yǎng)2d;②將共培養(yǎng)后的外植體用滅菌的300mg/L頭孢霉素水溶液清洗3次，再置于含有350mg/L頭孢霉素、50mg/L卡那霉素的MSl固體培養(yǎng)基在22°C，培養(yǎng)至長(zhǎng)出不定芽，在第1-7天，光照強(qiáng)度為5001ux, 16h/d ;在第8天開始,光照強(qiáng)度為18001ux, 16h/d,每14d更換一次培養(yǎng)基；(4)芽的伸長(zhǎng)將帶有不定芽的外植體轉(zhuǎn)至含有350mg/L頭孢霉素、50mg/L卡那霉素的MS2固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)芽伸長(zhǎng)至3-5cm ；(5)根的誘導(dǎo)將伸長(zhǎng)的芽轉(zhuǎn)入含有350mg/L頭孢霉素、50mg/L卡那霉素的1/2MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。1/2MS 培養(yǎng)基包括MS 鹽 2. 2g/L，蔗糖 25g/L，pH=5. 6，瓊脂 7. Og/L。MS液體培養(yǎng)基包括MS鹽4. 4g/L，蔗糖25g/L，生長(zhǎng)素NAA1. 86mg/L,細(xì)胞分裂素2ipl. 02mg/L, pH=5. 6。YEB固體培養(yǎng)基包括牛肉浸膏5. Og/L，胰蛋白胨5. Og/L，酵母提取物I. Og/L，蔗糖 5. Og/L, MgSO4. 7Η200· 5g/L，瓊脂 15g/L，pH=7. 0。YEB液體培養(yǎng)基包括牛肉浸膏5. 0g/L，胰蛋白胨5. 0g/L，酵母提取物I. 0g/L，蔗糖 5. 0g/L, MgSO4. 7H200. 5g/L, pH=7. 0。MSI固體培養(yǎng)基包括MS鹽4. 4g/L，蔗糖20g/L，生長(zhǎng)素IBA0. lmg/L,細(xì)胞分裂素ΒΑΡ0. 2mg/L,細(xì)胞分裂素 TDZ0. 00lmg/L pH=5. 6，瓊脂 · 0g/L。MS2固體培養(yǎng)基包括MS鹽4. 4g/L，蔗糖20g/L，生長(zhǎng)素ΙΒΑ0. lmg/L,細(xì)胞分裂素ΒΑΡ0. 2mg/L, ρΗ=5· 6，瓊脂 7. 0g/L。實(shí)施例2一種歐美雜種山楊的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法，包括如下步驟
(I)預(yù)培養(yǎng)T89楊(歐美雜種山楊的一種)在1/2MS培養(yǎng)基上繼代繁殖得到組培苗；選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的組培苗上帶有部分葉片的葉柄作為外植體，將所述外植體置于MS液體培養(yǎng)基中于24°C、80rpm暗培養(yǎng)2d ；(2)農(nóng)桿菌的培養(yǎng)①攜帶雙元載體pMP90、pBI121的農(nóng)桿菌C58在含有30mg/L慶大霉素、50mg/L利福平、50mg/L卡那霉素的YEB 固體培養(yǎng)基上于28°C劃線暗培養(yǎng)2d ；②挑單菌落接種到含有30mg/L慶大霉素、50mg/L利福平、50mg/L卡那霉素的60mlYEB液體培養(yǎng)基中于28 °C、150rpm暗培養(yǎng)24h，至OD6tltl為O. 6 ;③將步驟②獲得的菌液在3000rpm離心lOmin，棄去上清液，用含有100 μ M乙酰丁香酮的MS液體培養(yǎng)基重懸菌體至OD6tltl為O. 5，于28°C、80rpm繼續(xù)培養(yǎng)lh，得到侵染液；(3)共培養(yǎng)與芽的誘導(dǎo)①將預(yù)培養(yǎng)后的外植體浸于侵染液中，于24°C、80rpm培養(yǎng)2h，轉(zhuǎn)移至含有100 μ M乙酰丁香酮的MSl固體培養(yǎng)基上，于24°C黑暗共培養(yǎng)2d;②將共培養(yǎng)后的外植體用滅菌的350mg/L頭孢霉素水溶液清洗2次，再置于含有350mg/L頭孢霉素、50mg/L卡那霉素的MSl固體培養(yǎng)基在24°C，培養(yǎng)至長(zhǎng)出不定芽，在第1-7天，光照強(qiáng)度為6001ux, 16h/d ;在第8天開始,光照強(qiáng)度為15001ux, 16h/d,每14d更換一次培養(yǎng)基；(4)芽的伸長(zhǎng)將帶有不定芽的外植體轉(zhuǎn)至含有350mg/L頭孢霉素、50mg/L卡那霉素的MS2固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)芽伸長(zhǎng)至3-5cm ；(5)根的誘導(dǎo)將伸長(zhǎng)的芽轉(zhuǎn)入含有350mg/L頭孢霉素、50mg/L卡那霉素的1/2MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。1/2MS 培養(yǎng)基包括MS 鹽 2. 2g/L，蔗糖 28g/L，pH=5. 7，瓊脂 7. lg/L。MS液體培養(yǎng)基包括MS鹽4. 4g/L，蔗糖28g/L，生長(zhǎng)素NAA1. 86mg/L,細(xì)胞分裂素2ipl. 02mg/L, pH=5. 7。YEB固體培養(yǎng)基包括牛肉浸膏5. Og/L，胰蛋白胨5. Og/L，酵母提取物I. Og/L，蔗糖 5. Og/L, MgSO4. 7Η200· 5g/L，瓊脂 15g/L，pH=7. 0。YEB液體培養(yǎng)基包括牛肉浸膏5. 0g/L，胰蛋白胨5. 0g/L，酵母提取物I. 0g/L，蔗糖 5. 0g/L, MgSO4. 7H200. 5g/L, pH=7. 0。MSI固體培養(yǎng)基包括MS鹽4.4g/L，蔗糖25g/L，生長(zhǎng)素ΙΒΑ0. lmg/L，細(xì)胞分裂素ΒΑΡ0. 2mg/L，細(xì)胞分裂素 TDZ0. 00lmg/L pH=5. 7，瓊脂 7. lg/L。MS2固體培養(yǎng)基包括MS鹽4. 4g/L，蔗糖25g/L，生長(zhǎng)素ΙΒΑ0. lmg/L,細(xì)胞分裂素ΒΑΡ0. 2mg/L, pH=5. 7，瓊脂 7. lg/L。實(shí)施例3一種歐美雜種山楊的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法，包括如下步驟(I)預(yù)培養(yǎng)T89楊(歐美雜種山楊的一種)在1/2MS培養(yǎng)基上繼代繁殖得到組培苗；選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的組培苗上帶有部分葉片的葉柄作為外植體，將所述外植體置于MS液體培養(yǎng)基中于24°C、IOOrpm暗培養(yǎng)2d ；(2)農(nóng)桿菌的培養(yǎng)①攜帶雙元載體pMP90、pBI121的農(nóng)桿菌C58在含有30mg/L慶大霉素、50mg/L利福平、50mg/L卡那霉素的YEB固體培養(yǎng)基上于28°C劃線暗培養(yǎng)3d ；②挑單菌落接種到含有30mg/L慶大霉素、50mg/L利福平、50mg/L卡那霉素的75mlYEB液體培養(yǎng)基中于28°C、180rpm暗培養(yǎng)24h，至OD6tltl為O. 7 ;③將步驟②獲得的菌液在3500rpm離心9min，棄去上清液，用含有100 μ M乙酰丁香酮的MS液體培養(yǎng)基重懸菌體至0D_為O. 5，于28°C、90rpm繼續(xù)培養(yǎng)lh，得到侵染液；(3)共培養(yǎng)與芽的誘導(dǎo) ①將預(yù)培養(yǎng)后的外植體浸于侵染液中，于24°C、IOOrpm培養(yǎng)O. 5h，轉(zhuǎn)移至含有100 μ M乙酰丁香酮的MSl固體培養(yǎng)基上，于24°C黑暗共培養(yǎng)2d;②將共培養(yǎng)后的外植體用滅菌的400mg/L頭孢霉素水溶液清洗2次，再置于含有350mg/L頭孢霉素、50mg/L卡那霉素的MSl固體培養(yǎng)基在24°C，培養(yǎng)至長(zhǎng)出不定芽，在第1-7天，光照強(qiáng)度為4001ux, 16h/d ;在第8天開始,光照強(qiáng)度為20001ux, 16h/d,每14d更換一次培養(yǎng)基；(4)芽的伸長(zhǎng)將帶有不定芽的外植體轉(zhuǎn)至含有350mg/L頭孢霉素、50mg/L卡那霉素的MS2固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)芽伸長(zhǎng)至3-5cm ；(5)根的誘導(dǎo)將伸長(zhǎng)的芽轉(zhuǎn)入含有350mg/L頭孢霉素、50mg/L卡那霉素的1/2MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。1/2MS 培養(yǎng)基包括MS 鹽 2. 2g/L，蔗糖 30g/L，pH=5. 8，瓊脂 7. 2g/L。MS液體培養(yǎng)基包括MS鹽4. 4g/L，蔗糖30g/L，生長(zhǎng)素NAA1. 86mg/L,細(xì)胞分裂素2ipl. 02mg/L, pH=5. 8。YEB固體培養(yǎng)基包括牛肉浸膏5. Og/L，胰蛋白胨5. Og/L，酵母提取物I. Og/L，蔗糖 5. Og/L, MgSO4. 7Η200· 5g/L，瓊脂 15g/L，pH=7. 0。YEB液體培養(yǎng)基包括牛肉浸膏5. Og/L，胰蛋白胨5. 0g/L，酵母提取物I. 0g/L，蔗糖 5. 0g/L, MgSO4. 7H200. 5g/L, pH=7. 0。MSI固體培養(yǎng)基包括MS鹽4. 4g/L，蔗糖30g/L，生長(zhǎng)素IBA0. lmg/L,細(xì)胞分裂素ΒΑΡ0. 2mg/L,細(xì)胞分裂素 TDZ0. 00lmg/L pH=5. 8，瓊脂 · 2g/L。MS2固體培養(yǎng)基包括MS鹽4. 4g/L，蔗糖30g/L，生長(zhǎng)素ΙΒΑ0. lmg/L,細(xì)胞分裂素ΒΑΡ0. 2mg/L, ρΗ=5· 8，瓊脂 7. 2g/L。注本發(fā)明采用的雙元載體pMP90、pBI121的農(nóng)桿菌C58卿C58/pMP90/pBI121),C58具有利福平抗性，輔助Ti質(zhì)粒pMP90具有慶大霉素抗性；表達(dá)載體pBI121上的卡那霉素抗性基因可作為轉(zhuǎn)基因楊樹的篩選基因，編碼蛋白具有卡那霉素抗性。實(shí)施例4 :不同受體材料對(duì)誘導(dǎo)T89楊Knf芽的影響轉(zhuǎn)化受體是一個(gè)重要的影響因素，建立一個(gè)好的受體系統(tǒng)是基因轉(zhuǎn)化的先決條件。轉(zhuǎn)化受體通常來自于植物的原生質(zhì)體和外植體組織。外植體組織包括子葉、子葉柄、下胚軸、莖段。楊樹的遺傳轉(zhuǎn)化中大多選用子葉、莖段。大量的楊樹轉(zhuǎn)基因研究表明，楊樹葉片是最好的受體材料。但是，也有一些研究發(fā)現(xiàn)，莖段的誘導(dǎo)率高于葉片。因此，植物轉(zhuǎn)化中最適的受體材料隨著植物的種類不同而不同。本實(shí)驗(yàn)采用T89楊帶有葉片的葉柄、葉片、莖段三種不同的受體材料，各自的誘導(dǎo)效率如下表表I不同受體材料對(duì)誘導(dǎo)T89楊Knf芽的影響
權(quán)利要求
1.一種歐美雜種山楊的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法，其特征是包括如下步驟 (1)預(yù)培養(yǎng) 歐美雜種山楊在1/2MS培養(yǎng)基上繼代繁殖得到組培苗；選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的組培苗上帶有部分葉片的葉柄作為外植體，將所述外植體置于MS液體培養(yǎng)基中于22-24°C、80-100rpm 暗培養(yǎng) l_2d ； (2)農(nóng)桿菌的培養(yǎng) ①攜帶雙元載體PMP90、pBI121的農(nóng)桿菌C58在含有30mg/L慶大霉素、50mg/L利福平、50mg/L卡那霉素的YEB固體培養(yǎng)基上于28°C劃線暗培養(yǎng)2_3d ； ②挑單菌落接種到含有30mg/L慶大霉素、50mg/L利福平、50mg/L卡那霉素的60-75mlYEB 液體培養(yǎng)基中于 28 °C、150-200rpm 暗培養(yǎng) 24h，至 0D_ 為 O. 6-0. 8 ； ③將步驟②獲得的菌液在3000-4000rpm離心8_10min，棄去上清液，用含有100μ M乙酰丁香酮的MS液體培養(yǎng)基重懸菌體至OD6tltl為O. 4-0. 5，于28°C、80-100rpm繼續(xù)培養(yǎng)O.5-lh，得到侵染液； (3)共培養(yǎng)與芽的誘導(dǎo) ①將預(yù)培養(yǎng)后的外植體浸于侵染液中，于22-24°C、80-100rpm培養(yǎng)O.5_2h，轉(zhuǎn)移至含有100 μ M乙酰丁香酮的MSl固體培養(yǎng)基上，于22-24°C黑暗共培養(yǎng)2d ； ②將共培養(yǎng)后的外植體用滅菌的300-400mg/L頭孢霉素水溶液清洗2_3次，再置于含有350mg/L頭孢霉素、50mg/L卡那霉素的MSl固體培養(yǎng)基在22_24°C，培養(yǎng)至長(zhǎng)出不定芽，在第1-7天，光照強(qiáng)度為400-6001ux，16h/d ;在第8天開始，光照強(qiáng)度為1500_20001ux，16h/d,每14d更換一次培養(yǎng)基； (4)芽的伸長(zhǎng) 將帶有不定芽的外植體轉(zhuǎn)至含有350mg/L頭孢霉素、50mg/L卡那霉素的MS2固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)芽伸長(zhǎng)至3-5cm ； (5)根的誘導(dǎo) 將伸長(zhǎng)的芽轉(zhuǎn)入含有350mg/L頭孢霉素、50mg/L卡那霉素的1/2MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種歐美雜種山楊的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于步驟(I)中所述 1/2MS 培養(yǎng)基包括=MS 鹽 2. 2g/L，蔗糖 25_30g/L，pH=5. 6-5. 8，瓊脂 7. 0-7. 2g/L0
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種歐美雜種山楊的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于步驟(I)中所述MS液體培養(yǎng)基包括MS鹽4. 4g/L，蔗糖25-30g/L，生長(zhǎng)素NAA1. 86mg/L，細(xì)胞分裂素 2ip I. 02mg/L，ρΗ=5· 6-5. 8。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種歐美雜種山楊的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于步驟(2)中所述YEB固體培養(yǎng)基包括牛肉浸膏5. Og/L，胰蛋白胨5. Og/L，酵母提取物l.Og/L，蔗糖 5. Og/L, MgSO4. 7H20 O. 5g/L，瓊脂 15g/L，pH=7. 0。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種歐美雜種山楊的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于步驟(2)中所述YEB液體培養(yǎng)基包括牛肉浸膏5. Og/L，胰蛋白胨5. Og/L，酵母提取物I. Og/L，蔗糖 5. 0g/L, MgSO4. 7H20 0. 5g/L, pH=7. 0。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種歐美雜種山楊的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于步驟(3)中所述MSl固體培養(yǎng)基包括:MS鹽4. 4g/L，蔗糖20_30g/L，生長(zhǎng)素IBA O. lmg/L，細(xì)胞分裂素 BAP O. 2mg/L,細(xì)胞分裂素 TDZ O. OOlmg/L pH=5. 6-5. 8，瓊脂 7. 0-7. 2g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種歐美雜種山楊的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于步驟(4)中所述MS2固體培養(yǎng)基包括MS鹽4. 4g/L，蔗糖20_30g/L，生長(zhǎng)素IBA O. lmg/L，細(xì)胞分裂素 BAP O. 2mg/L, pH=5. 6-5. 8，瓊脂 7. 0-7. 2g/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種歐美雜種山楊的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法，包括如下步驟(1)預(yù)培養(yǎng)歐美雜種山楊在1/2MS培養(yǎng)基上繼代繁殖得到組培苗；選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的組培苗上帶有部分葉片的葉柄作為外植體，將外植體暗培養(yǎng)；(2)農(nóng)桿菌的培養(yǎng)攜帶雙元載體pMP90、pBI121的農(nóng)桿菌C58培養(yǎng)得到侵染液；(3)共培養(yǎng)與芽的誘導(dǎo)將預(yù)培養(yǎng)后的外植體浸于侵染液中培養(yǎng)。本發(fā)明的方法從外植體選擇、遺傳轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化等方面建立歐美雜種山楊高效遺傳轉(zhuǎn)化體系，本發(fā)明的方法遺傳轉(zhuǎn)化效率高。通過建立高效的歐美雜種山楊遺傳轉(zhuǎn)化體系，可在短時(shí)間內(nèi)培育出雜種山楊抗逆新品種，對(duì)楊樹抗性改良和抗逆新品種選育具有一定的理論和實(shí)際意義。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102796761SQ201210292958
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月16日
發(fā)明者王潔華, 籍燕, 昝艷君, 楊少輝, 宋英今 申請(qǐng)人:天津大學(xué)