專利名稱：一種金鐵鎖不定根培養(yǎng)體系的建立與擴大培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)與培養(yǎng)不定根系的方法，特別涉及一種金鐵鎖狀不定根系的誘導(dǎo)與生物反應(yīng)器擴大培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
金鐵鎖(Psammosilenetuniceoides ff. C. Wu et C. Y. Wu)為石竹科金鐵鎖屬植物，是我國西南地區(qū)特有的藥用植物。金鐵鎖主要以根入藥，臨床上常用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病。金鐵鎖主要化學(xué)成分是三萜、三萜皂苷、環(huán)肽以及內(nèi)酰胺。藥理試驗表明，金鐵鎖總皂苷鎮(zhèn)痛和抗炎效果明顯。傳統(tǒng)的中草藥獲取方法是以采集和消耗大量的野生植 物資源為代價的，當(dāng)采集和消耗量超過自然資源的再生能力時，必然會導(dǎo)致物種瀕危甚至滅絕。近年來由于金鐵鎖的市場需求不斷增加，野生植物資源數(shù)量急劇下降，已成為珍稀瀕危物種。為了解決藥用植物的供需矛盾，人們多采用人工栽培的方法擴大藥源。但在人工栽培的藥用植物中，一些藥用植物生產(chǎn)周期很長，若以常規(guī)方法育種或育苗，需要花費較長時間。還有一些藥用植物因繁殖系數(shù)小、耗種量大，導(dǎo)致發(fā)展速度很慢且生產(chǎn)成本增加。另外一些藥用植物，則因病毒危害導(dǎo)致退化，嚴(yán)重影響了產(chǎn)量和品質(zhì)。為保證藥用植物資源的可持續(xù)利用，利用生物工程的途徑對珍貴資源進行細(xì)胞或組織培養(yǎng)、有效成分的關(guān)鍵基因克隆與轉(zhuǎn)化等技術(shù)，可能是解決中藥產(chǎn)業(yè)化的有效途徑。于是，積極研究藥用植物資源的再生技術(shù)，使有限的資源為人類持續(xù)利用迫在眉睫。應(yīng)用植物組織培養(yǎng)生產(chǎn)藥用植物，具有不受地區(qū)、季節(jié)與氣候限制，便于工廠化生產(chǎn)等優(yōu)勢，同時組織培養(yǎng)中的細(xì)胞生長速度要比植物正常生長速度快，接近于分生組織的生長速度，因此利用組織培養(yǎng)手段快速繁殖藥用植物種苗，或者利用組織培養(yǎng)或細(xì)胞培養(yǎng)手段直接生產(chǎn)藥物便隨之日益發(fā)展。在金鐵鎖植物細(xì)胞培養(yǎng)方面，歐陽志勤等進行了金鐵鎖離體培養(yǎng)和快速繁殖試驗，他們將金鐵鎖莖尖、帶芽的莖段誘導(dǎo)分化和培養(yǎng)得到植物芽、帶芽莖段和愈傷組織無根苗，進一步增殖培養(yǎng)，無根苗形成試管苗。楊耀文等對金鐵鎖進行了組織培養(yǎng)和快速繁殖研究，他們以金鐵鎖幼嫩莖段為外植體，從而獲得組織培養(yǎng)苗。為了實現(xiàn)金鐵鎖的快速繁殖，他們進一步使用正交試驗探討不同生長調(diào)節(jié)劑對其增殖的影啊和最佳培養(yǎng)條件的篩選，發(fā)現(xiàn) MS 培養(yǎng)基 + BA O. 5mg/L + KT O. lmg/L + IAA O. lmg/L + 2,4-D 0. 5mg/L 培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度19. 5±1°C，光照強度1200Lx，光照周期12小時為最優(yōu)培養(yǎng)條件。但是到目前為止，金鐵鎖植物細(xì)胞培養(yǎng)還停留在離體培養(yǎng)和快速繁殖研究層面，還未見有關(guān)利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)金鐵鎖組織，金鐵鎖次生代謝產(chǎn)物皂苷的細(xì)胞內(nèi)合成途徑，以及通過綜合調(diào)控技術(shù)提高金鐵鎖植物細(xì)胞生物量，進而提高金鐵鎖總皂苷等次生代謝產(chǎn)物含量方面的報道。主要問題是對金鐵鎖植物細(xì)胞培養(yǎng)的生長穩(wěn)定性、培養(yǎng)條件和各種調(diào)節(jié)參數(shù)、細(xì)胞生長與次生代謝產(chǎn)物積累的矛盾研究不足。
本發(fā)明建立了金鐵鎖愈傷組織和不定根培養(yǎng)體系，大大降低愈傷的褐化率并提高愈傷誘導(dǎo)率，確定了愈傷組織和不定根的生長周期，通過植物細(xì)胞培養(yǎng)獲得其藥用成分皂苷。進一步優(yōu)化了細(xì)胞愈傷組織培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的條件和參數(shù)，促使植物細(xì)胞次生代謝向著有利于皂苷類物質(zhì)合成的方向進行，進而提高皂苷類物質(zhì)含量。為金鐵鎖不定根利用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)及生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。組織培養(yǎng)技術(shù)特別是大規(guī)模工業(yè)化培養(yǎng)技術(shù)，對解決藥用植物資源緊張的現(xiàn)狀具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于通過組織培養(yǎng)技術(shù)和發(fā)酵工程技術(shù)手段大量生產(chǎn)金鐵鎖不定根，以得到金鐵鎖次生代謝產(chǎn)物，從而替代野生資源，以保證中藥的可持續(xù)利用。本發(fā)明以金鐵鎖植株幼嫩莖為外植體，成功誘導(dǎo)金鐵鎖愈傷組織，并建立了光照和暗培養(yǎng)條件下的金鐵 鎖愈傷組織培養(yǎng)體系，并誘導(dǎo)產(chǎn)生不定根，建立金鐵鎖不定根培養(yǎng)體系。進而對金鐵鎖總皂苷的含量進行測定，建立金鐵鎖高產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)體系，以實現(xiàn)金鐵鎖植物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)生產(chǎn)不定根替代金鐵鎖原植物入藥。本發(fā)明所述技術(shù)方案的具體步驟如下
(I)植物材料的選取與消毒處理
選取金鐵鎖葉或切成f 3cm的小段的金鐵鎖莖為外植體，并對其進行消毒處理。所述消毒過程如下
1)對材料進行流水沖洗；
2)用吐溫20浸泡25min，無菌水沖洗3次；
3)用O.1% HgCl2處理8min，無菌水洗沖3次；
4)再用75%乙醇處理8s，無菌水沖洗3次；
5)用無菌濾紙吸干水分。(2)植物愈傷組織的誘導(dǎo)
將步驟(I)中的外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在(25±1)°C下培養(yǎng)，IOd左右開始長出乳白色愈傷組織；20d左右愈傷組織逐漸覆蓋外植體，在25d時挑選質(zhì)地松散、生長良好的愈傷組織用于繼代培養(yǎng)。植物愈傷組織誘導(dǎo)所用培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+ 2,4-D (2，4-二氯苯氧基乙酸)O. 5 mg/L + NAA (萘乙酸)O. 5 mg/L + KT (激動素)O. lmg/L +半胱氨酸O 2. Omg/L, pH6. O。(3)植物愈傷組織的培養(yǎng)
取步驟(2)中得到的愈傷組織O. 5g接種于組織培養(yǎng)用培養(yǎng)基進行繼代培養(yǎng)2 4次，每隔15d繼代一次，在(25±1)°C下培養(yǎng)。植物愈傷組織繼代培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+ 蔗糖40g/L + KNO3 I. 9 g/L + NH4NO3 I. 65 g/L + KH2PO4 I mmol/L + CaCl2 4. 5mmol/L。(4)不定根的誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)
采用附加3%蔗糖、卩引哚丁酸(IBA)l-2mg/L、激動素(KT)O. 2mg/L的MS培養(yǎng)基對步驟
(3)中得到的愈傷組織進行不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)，在(25±1)°C下培養(yǎng)；待成功誘導(dǎo)出不定根后(約培養(yǎng)30d)，對不定根進行繼代培養(yǎng)兩次以上，每隔20天繼代一次，具體方法如下將成團生長的金鐵鎖不定根搗碎，剔除顏色發(fā)黑、生長老化的部分，取生長比較旺盛、顏色較淺的不定根接種于內(nèi)裝IOOmL液體培養(yǎng)基(附加3%蔗糖、吲哚丁酸(IBA)l-2mg/L、激動素(KT)O. 2mg/L的MS培養(yǎng)基)的250mL的三角瓶中，每瓶的接種量為l.Og左右(鮮重)，在普通搖床中振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為100r/min，溫度為25°C ;
(5)生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)金鐵鎖不定根
將步驟(4)中繼代培養(yǎng)的成團的金鐵鎖不定根搗碎，剔除其老化部分，作為反應(yīng)器培養(yǎng)的材料。每個反應(yīng)器裝有500mL MS培養(yǎng)基，pH值6.0，含有3%蔗糖、吲哚丁酸(IBA) 1-2mg/L、激動素(KT) O. 2mg/L，接種量為5g左右，整個操作在超凈臺內(nèi)，培養(yǎng)溫度為25°C，通氣量為O. 025 m3/h。作為一種優(yōu)選，在進行上述方案的步驟(5)之前對不定根不同根系進行篩選和擴繁，從而選擇最優(yōu)不定根系進行大規(guī)模培養(yǎng)，其具體步驟如下
對培養(yǎng)出的不同生長情況、不同顏色及不同粗細(xì)的不定根進行分類，進行擴繁與繼代培養(yǎng)，待株系穩(wěn)定后，進行活性成分(總皂苷)的測定，并建立相應(yīng)成分的指紋圖譜，然后根據(jù)檢測結(jié)果篩選出最優(yōu)不定根系，并接種于內(nèi)裝含3%蔗糖的MS液體培養(yǎng)基的不同體積三角瓶中，并加入濃度為lmg/L的IBA植物生長調(diào)節(jié)劑，在100r/min速度的搖床上、25°C的溫度下進行擴繁，培養(yǎng)周期為3-4周。金鐵鎖總皂苷的提取
金鐵鎖總皂苷的最佳提取工藝為將金鐵鎖根粉碎后用80%乙醇浸潰3次，48 h /次，過濾，濾液減壓濃縮成浸膏，加水溶解，水溶液經(jīng)DM-IOl型大孔吸附樹脂柱層析，分別用10%、20%及80%的乙醇洗脫，收集80%乙醇洗脫液，減壓濃縮經(jīng)噴霧干燥得金鐵鎖提取物。MS培養(yǎng)基的組成
MS培養(yǎng)基是Murashige和Skoog于1962年為煙草細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計的，其中固體培養(yǎng)基是在配制1000 ml培養(yǎng)基時，加硝酸銨I. 65克、硝酸鉀I. 9克、氯化鈣O. 44克、硫酸鎂O. 37克、磷酸二氫鉀O. 17克、碘化鉀O. 83毫克、硼酸6. 2毫克、硫酸錳22. 3毫克、硫酸鋅8. 6毫克、鑰酸鈉O. 25毫克、硫酸銅O. 025毫克、氯化鈷O. 025毫克、硫酸亞鐵27. 8毫克、乙二胺四乙酸二鈉37. 3毫克、肌醇IOOmg,甘氨酸2mg ,鹽酸硫胺素O. Img,鹽酸卩比卩多醇O. 5mg,煙酸O. 5mg，蔗糖30g和瓊脂7g。液體培養(yǎng)基不含瓊脂，其他成分與固體培養(yǎng)基相同。本發(fā)明所述反應(yīng)器的滅菌及接種方法
1)反應(yīng)器的清洗肥皂水洗滌一次，清水反復(fù)沖洗數(shù)次，最后用蒸餾水沖洗干凈；
2)滅菌采用高壓蒸汽滅菌鍋濕熱滅菌，反應(yīng)器裝入培養(yǎng)液后進行實罐滅菌，在121°C下滅菌30min，滅菌冷卻后打開鍋蓋，立即取出滅菌物品，置于超凈臺，紫外線滅菌15min ；
3)接種在超凈臺將反應(yīng)器的塞子打開，并用外火焰燒瓶口，打開裝有金鐵鎖不定根的搖瓶，將瓶口在火焰上燒，迅速將不定根放入反應(yīng)器中，將反應(yīng)器的塞子在火焰上滅菌以后，擰緊塞子，熄滅火焰；
4)安裝儀器將反應(yīng)器放置好，接通電源，開啟空氣壓縮機，打開流量計，調(diào)至較大量程，將進氣口連接流量計的那端硅膠管在火焰上滅菌，用火焰燒烤流量計的出口，迅速將硅膠管接入出口 ；
5)通氣、培養(yǎng)打開置于進氣口處硅膠管上的夾子通氣，調(diào)節(jié)流量，開始培養(yǎng)。
本發(fā)明中所涉及的測定方法 不定根鮮重的測定方法
將培養(yǎng)得到的不定根用濾紙吸去表面的培養(yǎng)基，置于萬分之一天平稱重。組織干重的測定方法
將測定完鮮重的不定根首先在105°C下烘30min，使其酶系滅活；再在60°C的條件下，烘至恒重，置于萬分之一天平稱重即可。增殖倍數(shù)的測定方法
增殖倍數(shù)=(收獲時的重量-接種量)/接種量 愈傷組織誘導(dǎo)率的測定方法
愈傷組織誘導(dǎo)率(％ )=誘導(dǎo)出的愈傷組織塊數(shù)/接種的愈傷組織塊數(shù) 愈傷組織褐化率的測定方法
愈傷組織褐化率(％ )=發(fā)生褐化的愈傷組織塊數(shù)/愈傷組織總塊數(shù) 本發(fā)明具有以下有益效果
1、能夠保證在一個限定的生產(chǎn)系統(tǒng)中連續(xù)、均勻地生產(chǎn)，不使用農(nóng)藥化肥、不受病蟲害.、地理和季節(jié)等各種環(huán)境因素的影響；
2、可以在生物反應(yīng)器中進行大規(guī)模培養(yǎng)，通過細(xì)胞生長的自動控制和代謝過程的合理凋節(jié)保證產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量的穩(wěn)定，并通過控制環(huán)境條件得到超過整株植物含量水平的代謝產(chǎn)物；
3、所獲得的產(chǎn)物可以從培養(yǎng)體系內(nèi)直接提取，并快速、高效地回收利用，從而簡化了分離與純化的步驟；
4、有利于研究植物的代謝途徑，還可以利用某些基因工程手段探索與創(chuàng)造新的合成途徑，從而得到價值更高的代謝產(chǎn)物；
5、還可以節(jié)省大量用于種植原植物的土地，降低了生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率；
6、大大降低了愈傷組織的褐化率并提高愈傷組織的誘導(dǎo)率，
7、組織培養(yǎng)一般的周期為1-2個月，比野外生長要短的多。不定根的反應(yīng)器培養(yǎng)方法簡單、效率高，次生代謝產(chǎn)物含量高、主要皂苷成分均得以表達且其比例與藥材相近；
8、不定根生長迅速、無內(nèi)生真菌污染，本培養(yǎng)工藝操作簡單、重復(fù)性好、規(guī)模生產(chǎn)迅速方便。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明所述技術(shù)方案作進一步說明，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述實施例。下列實施例中所用的金鐵鎖植株為市售或采自四川省甘孜州九龍縣海拔2500米的貢嘎山。實施例I
(1)選取金鐵鎖葉作為外植體，進行消毒處理流水沖洗后用吐溫20浸泡25min，無菌水沖洗3次；再用O. 1% HgCl2處理8min，無菌水洗沖3次；后用75%乙醇處理8s，無菌水沖洗3次，最后無菌濾紙吸干水分；
(2)誘導(dǎo)愈傷組織將步驟(I)中的外植體接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基+2，4-D 0. 5 mg/L + NAA 0. 5 mg/L + KT 0. lmg/L+ 半胱氨酸 I. Omg/L，pH6. 0，在 25±1°C下暗培養(yǎng)。葉片接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基IOd左右開始長出乳白色愈傷組織；20d左右愈傷組織逐漸覆蓋外植體，在25d時挑選質(zhì)地松散、生長良好的愈傷組織進行繼代培養(yǎng)；
(3)誘導(dǎo)愈傷組織繼代培養(yǎng)取步驟(2)中得到的愈傷組織O.5g接種于MS培養(yǎng)基+蔗糖 40g/L + KNO3 I. 9 g/L + NH4NO3 I. 65 g/L + KH2PO4 I mmol/L + CaCl2 4. 5mmol/L 進行繼代培養(yǎng)，每隔15d繼代一次,在25±1°C下暗培養(yǎng)；
(4)不定根的誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)
取步驟(2)中繼代培養(yǎng)了 3次的愈傷組織接種于附加3%蔗糖、吲哚丁酸(IBA)l. 5mg/L、激動素(KT)0.2mg/L的MS培養(yǎng)基中進行不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)，在25± 1°C下暗培養(yǎng)；待成功誘導(dǎo)出不定根后(約培養(yǎng)30d)，將成團生長的金鐵鎖不定根搗碎，剔除顏色發(fā)黑、生長老化的部分，取生長比較旺盛、顏色較淺的不定根接種于內(nèi)裝IOOmL液體培養(yǎng)基(附加3%蔗糖、吲哚丁酸(IBA)1.5mg/L、激動素(KT)O. 2mg/L的MS液體培養(yǎng)基)的250mL的三角瓶中 進行繼代培養(yǎng)，每瓶的接種量為l.Og左右(鮮重)，在普通搖床中振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為IOOr/min，溫度為25°C下暗培養(yǎng)，每隔20天繼代一次；
(5)生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)金鐵鎖不定根
將步驟(4)中繼代培養(yǎng)了 2次的成團的金鐵鎖不定根搗碎，剔除其老化部分，作為反應(yīng)器培養(yǎng)的材料，每個反應(yīng)器裝有500mL MS液體培養(yǎng)基，pH值6.0，含有3%蔗糖、吲哚丁酸(IBA) 1.5mg/L、激動素(KT)0.2mg/L，接種量為5g左右，整個操作在超凈臺內(nèi)完，培養(yǎng)溫度為25°C，通氣量為O. 020vvm。實施例2
(1)選取長度為I.ο-l. 5cm的金鐵鎖莖段作為外植體,進行消毒處理流水沖洗后用吐溫20浸泡25min，無菌水沖洗3次；再用O. 1% HgCl2處理8min，無菌水洗沖3次；后用75%乙醇處理8s，無菌水沖洗3次，最后無菌濾紙吸干水分；
(2)誘導(dǎo)愈傷組織將步驟(I)中的外植體接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基+
2,4-D O. 5 mg/L + NAA O. 5 mg/L + KT O. lmg/L+半胱氨酸 2. Omg/L，ρΗ6· 0，在 25± 1°C下暗培養(yǎng)。葉片接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基IOd左右開始長出乳白色愈傷組織；20d左右愈傷組織逐漸覆蓋外植體，在25d時挑選質(zhì)地松散、生長良好的愈傷組織進行繼代培養(yǎng)；
(3)誘導(dǎo)愈傷組織繼代培養(yǎng)取步驟(2)中得到的愈傷組織O.5g接種于MS培養(yǎng)基+蔗糖 40g/L + KNO3 I. 9 g/L + NH4NO3 I. 65 g/L + KH2PO4 I mmol/L + CaCl2 4. 5mmol/L 進行繼代培養(yǎng)，每隔15d繼代一次,在25±1°C下暗培養(yǎng)；
(4)不定根的誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)
取步驟(2)中繼代培養(yǎng)了 4次的愈傷組織接種于附加3%蔗糖、吲哚丁酸(IBA) Img/L、激動素(KT)O. 2mg/L的MS培養(yǎng)基中進行不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)，在25± 1°C下暗培養(yǎng)；待成功誘導(dǎo)出不定根后(約培養(yǎng)30d)，將成團生長的金鐵鎖不定根搗碎，剔除顏色發(fā)黑、生長老化的部分，取生長比較旺盛、顏色較淺的不定根接種于內(nèi)裝IOOmL液體培養(yǎng)基(附加3%蔗糖、卩引哚丁酸(IBA) lmg/L、激動素(KT)O. 2mg/L的MS液體培養(yǎng)基)的250mL的三角瓶中進行繼代培養(yǎng)，每瓶的接種量為l.Og左右(鮮重)，在普通搖床中振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為IOOr/min，溫度為25°C，自然光照培養(yǎng)，每隔20天繼代一次；
(5)不定根的篩選及擴繁對步驟(4)中繼代3次后培養(yǎng)出的不同生長情況、不同顏色及不同粗細(xì)的不定根進行分類，然后再進行繼代培養(yǎng)，待株系穩(wěn)定后，進行活性成分(總皂苷)的測定，并建立相應(yīng)成分的指紋圖譜，檢測結(jié)果顯示，顏色呈黃褐色、生長旺盛的健壯的不定根系中所含活性成分最高，為最優(yōu)不定根系，將其接種于內(nèi)裝含3%蔗糖的MS液體培養(yǎng)基的不同體積三角瓶中，并加入濃度為lmg/L的IBA植物生長調(diào)節(jié)劑，在100r/min速度的搖床上、25°C避光條件下進行擴繁，培養(yǎng)周期為3-4周；
(6)生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)金鐵鎖不定根
將步驟(5)中經(jīng)擴繁得到的成團的金鐵鎖不定根搗碎，剔除其老化部分，作為反應(yīng)器培養(yǎng)的材料，每個反應(yīng)器裝有500mL MS液體培養(yǎng)基，pH值6.0，含有3%蔗糖、吲哚丁酸(IBA)lmg/L、激動素(KT)O. 2mg/L，接種量為5g左右，整個操作在超凈臺內(nèi)完，培養(yǎng)溫度為25°C，通氣量為 O. 030vvm。實施例3 (1)選取長度為2.0-3. Ocm的金鐵鎖莖段作為外植體，進行消毒處理流水沖洗后用吐溫20浸泡25min，無菌水沖洗3次；再用O. 1% HgCl2處理8min，無菌水洗沖3次；后用75%乙醇處理8s，無菌水沖洗3次，最后無菌濾紙吸干水分；
(2)誘導(dǎo)愈傷組織將步驟(I)中的外植體接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基+
2,4-D O. 5 mg/L + NAA O. 5 mg/L + KT O. lmg/L，ρΗ6· 0，在 25± 1°C、自然光照下培養(yǎng)。葉片接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基IOd左右開始長出乳白色愈傷組織；20d左右愈傷組織逐漸覆蓋外植體，在25d時挑選質(zhì)地松散、生長良好的愈傷組織進行繼代培養(yǎng)；
(3)誘導(dǎo)愈傷組織繼代培養(yǎng)取步驟(2)中得到的愈傷組織O.5g接種于MS培養(yǎng)基+蔗糖 40g/L + KNO3 I. 9 g/L + NH4NO3 I. 65 g/L + KH2PO4 I mmol/L + CaCl2 4. 5mmol/L 進行繼代培養(yǎng)，每隔15d繼代一次，在25±1°C、自然光照下培養(yǎng)；
(4)不定根的誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)
取步驟(2)中繼代培養(yǎng)了 2次的愈傷組織接種于附加3%蔗糖、吲哚丁酸(IBA)2mg/L、激動素(KT)0.2mg/L的MS培養(yǎng)基中進行不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)，在25± 1°C、自然光照下培養(yǎng)；待成功誘導(dǎo)出不定根后(約培養(yǎng)30d)，將成團生長的金鐵鎖不定根搗碎，剔除顏色發(fā)黑、生長老化的部分，取生長比較旺盛、顏色較淺的不定根接種于內(nèi)裝IOOmL液體培養(yǎng)基(附加3%蔗糖、吲哚丁酸(IBA)2mg/L、激動素(KT)0.2mg/L的MS液體培養(yǎng)基)的250mL的三角瓶中進行繼代培養(yǎng)，每瓶的接種量為l.Og左右(鮮重)，在普通搖床中振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為100r/min，溫度為25°C，自然光照培養(yǎng)，每隔20天繼代一次；
(5)生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)金鐵鎖不定根
將步驟(4)中繼代培養(yǎng)了 4次的成團的金鐵鎖不定根搗碎，剔除其老化部分，作為反應(yīng)器培養(yǎng)的材料，每個反應(yīng)器裝有500mL MS液體培養(yǎng)基，pH值6.0，含有3%蔗糖、吲哚丁酸(IBA)2mg/L、激動素(KT)O. 2mg/L，接種量為5g左右，整個操作在超凈臺內(nèi)完，培養(yǎng)溫度為25°C，通氣量為0. 035vvm。實施例4半胱氨酸含量對愈傷組織褐化率的影響
(1)選取長度為I.0-3. Ocm的金鐵鎖莖段作為外植體，進行消毒處理流水沖洗后用吐溫20浸泡25min，無菌水沖洗3次；再用0. 1% HgCl2處理8min，無菌水洗沖3次；后用75%乙醇處理8s，無菌水沖洗3次，最后無菌濾紙吸干水分；
(2)誘導(dǎo)愈傷組織將步驟(I)中的外植體接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基+2，4-D 0.5 mg/L + NAA 0.5 mg/L + KT 0. lmg/L+半胱氨酸0 2. Omg/L，pH6. 0，在25± 1°C下暗培養(yǎng)。接種時對于半胱氨酸含量分別為O mg/L、O. 5 mg/L>l. O mg/L、1.5 mg/L>2. Omg/L的5種培養(yǎng)基，各取1000個外植體接種于其上，培養(yǎng)25d后計算褐化率，結(jié)果顯示外植體在5種培養(yǎng)基上的愈傷組織褐化率分別為36. 6%,37. 5%,28. 1%、20. 9%,29. 5%，半胱氨酸的含量I. 5 mg/L時，可以明顯降低愈傷的褐化率。實施例5外植體尺寸對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響
(1)選取莖段長度分別為I. 0-1. 5cm(105 個)、1. 6-2. Ocm (278 個)和 2. 0-3. Ocm(117個)的三組金鐵鎖莖段外植體，進行消毒處理流水沖洗后用吐溫20浸泡25min，無菌水沖洗3次；再用O. 1% HgCl2處理8min，無菌水洗沖3次；后用75%乙醇處理8s，無菌水沖洗3次，最后無菌濾紙吸干水分；
(2)誘導(dǎo)愈傷組織將步驟(I)中的外植體接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基+2，4-D O. 5 mg/L + NAA O. 5 mg/L + KT O. lmg/L+ 半胱氨酸 I. 5mg/L，ρΗ6· 0，在 25±1°C 下暗培養(yǎng)。培養(yǎng)25d后，統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率，結(jié)果顯示三組外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率分別 為55. 7%,68. 7%,58. 5%，選取長度為I. 6-2. Ocm的莖段，具有較高的愈傷組織誘導(dǎo)率。實施例6金鐵鎖總皂苷含量測定
分別稱取野生金鐵鎖根、實施例3中經(jīng)步驟(3)繼代培養(yǎng)2次的愈傷組織和實施例3中經(jīng)步驟(3)繼代培養(yǎng)2次的不定根，以同樣方法提取其總皂苷，具體步驟為將原料干燥、粉碎后用80%乙醇浸潰3次，48 h /次,過濾，濾液減壓濃縮成浸膏,加水溶解，水溶液經(jīng)DM-IOl型大孔吸附樹脂柱層析，分別用10%、20%及80%的乙醇洗脫，收集80%乙醇洗脫液，減壓濃縮經(jīng)噴霧干燥得金鐵鎖提取物。計算粗總皂苷重量百分含量，結(jié)果顯示，
具體結(jié)果對比如下
種類I干重(g)I粗總皂苷重量(g) I粗總皂苷含量(%)
金鐵鎖藥材_ 150. 27. 62_^07_
金鐵鎖植物愈傷組織^ 97.85. 755.88"
金鐵鎖植物不定根 |94. 5\ . 17\ . 5權(quán)利要求
1.一種金鐵鎖不定根培養(yǎng)體系的建立與擴大培養(yǎng)方法，其特征在于具體步驟如下 (1)植物材料的選取與消毒處理 選取金鐵鎖葉或切成f3cm的小段的金鐵鎖莖為外植體，并對其進行消毒處理； (2)植物愈傷組織的誘導(dǎo) 將步驟(I)中外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在25 ± I °C下培養(yǎng)，在25天時挑選質(zhì)地松散、生長良好的愈傷組織用于繼代培養(yǎng)； (3)植物愈傷組織的繼代培養(yǎng) 取步驟(2)中得到的愈傷組織O. 5g接種于組織培養(yǎng)用培養(yǎng)基，進行繼代培養(yǎng)2 4次，每隔15天繼代一次，在(25±1)°C下培養(yǎng)； (4)不定根的誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng) 采用不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基對步驟(3)中得到的愈傷組織進行不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)，在25±1°〇下培養(yǎng)；待成功誘導(dǎo)出不定根后，對不定根進行繼代培養(yǎng)兩次以上，每隔20天繼代一次，繼代培養(yǎng)具體方法如下將成團生長的金鐵鎖不定根搗碎，剔除顏色發(fā)黑、生長老化的部分，取生長比較旺盛、顏色較淺的不定根接種于內(nèi)裝IOOmL培養(yǎng)基的250mL的三角瓶中，每瓶的接種量為鮮重l.Og左右，在普通搖床中振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為100r/min，溫度為25 0C ； (5)生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)金鐵鎖不定根 將步驟(4)中經(jīng)繼代培養(yǎng)的成團的金鐵鎖不定根搗碎，剔除其老化部分，作為反應(yīng)器培養(yǎng)的材料，每個反應(yīng)器裝有500mL MS液體培養(yǎng)基，pH值6.0，含有3%蔗糖、l_2mg/L吲哚丁酸、0.2mg/L激動素，接種量為5g左右，整個操作在超凈臺內(nèi)完成，然后在溫度為25°C，通氣量為O. 020-0. 035 vvm的條件下進行大規(guī)模培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的金鐵鎖不定根培養(yǎng)體系的建立與擴大培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(I)中所述消毒處理的具體步驟為 1)對材料進行流水沖洗； 2)用吐溫20浸泡25min，無菌水沖洗3次； 3)用O.1% HgCl2處理8min，無菌水洗沖3次； 4)再用75%乙醇處理8s，無菌水沖洗3次； 5)用無菌濾紙吸干水分。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的金鐵鎖不定根培養(yǎng)體系的建立與擴大培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(I)中所述金鐵鎖莖被切成I. 6-2. Ocm長。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的金鐵鎖不定根培養(yǎng)體系的建立與擴大培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(2)中所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+ 2,4-D 0.5 mg/L + NAA 0.5 mg/L + KTO.lmg/L + 半胱氨酸 O 2. Omg/L, pH=6. 0。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的金鐵鎖不定根培養(yǎng)體系的建立與擴大培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(3)中所述愈傷組織繼代培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+蔗糖40g/L + KNO3 1.9 g/L +NH4NO3 I. 65 g/L + KH2PO4 I mmol/L + CaCl2 4. 5mmol/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的金鐵鎖不定根培養(yǎng)體系的建立與擴大培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(4)中所用的培養(yǎng)基為附加3%蔗糖、l-2mg/L吲哚丁酸、0.2mg/L激動素的MS培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的金鐵鎖不定根培養(yǎng)體系的建立與擴大培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(2)中所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的半胱氨酸的含量為I. 5 mg/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的金鐵鎖不定根培養(yǎng)體系的建立與擴大培養(yǎng)方法，其特征在于在用生物反應(yīng)器進行大規(guī)模培養(yǎng)之前對不定根不同根系進行篩選及擴繁從而選擇最優(yōu)不定根系進行大規(guī)模培養(yǎng)，其具體步驟如下 對培養(yǎng)出的不同生長情況、不同顏色及不同粗細(xì)的不定根進行分類，進行擴繁與繼代培養(yǎng)，待株系穩(wěn)定后，進行活性成分的測定，并建立相應(yīng)成分的指紋圖譜，然后根據(jù)檢測結(jié)果篩選出最優(yōu)不定根系。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的篩選步驟，其特征在于所述最優(yōu)不定根系為顏色呈黃褐色、生長旺盛的健壯不定根系。
全文摘要
本發(fā)明以金鐵鎖植株幼嫩葉或莖為外植體，成功誘導(dǎo)金鐵鎖愈傷組織，并建立了光照和暗培養(yǎng)條件下的金鐵鎖愈傷組織培養(yǎng)體系，誘導(dǎo)愈傷組織分化產(chǎn)生不定根，建立金鐵鎖不定根培養(yǎng)體系。并對金鐵鎖總皂苷的含量進行測定，進一步優(yōu)化植物細(xì)胞培養(yǎng)的條件和參數(shù)，建立金鐵鎖高產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)體系，從而實現(xiàn)金鐵鎖植物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)生產(chǎn)不定根替代金鐵鎖原植物入藥。
文檔編號A01H4/00GK102771397SQ201210293609
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月17日
發(fā)明者馮敏, 張宗申, 柴素真, 洪漢君, 熊小燦 申請人:成都市三禾田生物技術(shù)有限公司