專利名稱：一種蛭弧菌消毒劑及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物制劑，尤其還涉及其制備方法和用途，具體的是一種應用于養(yǎng)殖業(yè)消毒的噬菌蛭弧菌顆粒劑。
背景技術(shù)：
卩遼菌蛭弧菌(Bdellovibriobacteriovorus)(以下簡稱蛭弧菌)是一種專門以捕食細菌為生的寄生性細菌，研究指出，蛭弧菌在凈化養(yǎng)殖水體水質(zhì)、控制或減少水生動物疾病的發(fā)生與流行上效果顯著。近年來，關(guān)于蛭弧菌應用在貝類、蝦類、蟹類、魚類等水產(chǎn)養(yǎng)殖中的研究也越來越多，這些研究都表明，在養(yǎng)殖過程中添加了蛭弧菌可以起到疾病防治、提高成活率、增長體重體長和凈化養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境的效果。陳麗蕓等研究發(fā)現(xiàn)，添加蛭弧菌后可以使大菱鲆紅嘴病的發(fā)生率由10. 17%降到O. 93%，說明蛭弧菌能有效預防紅嘴病的發(fā)
生，另外，在治療紅嘴病方面，添加蛭弧菌后能100 %治愈紅嘴病。因此，應用蛭弧菌防治水產(chǎn)動物細菌性病害和消毒具有良好的發(fā)展前景，然而，目前我國商品化的蛭弧菌制劑主要是水劑，還有少量的凍干粉劑，蛭弧菌水劑因保存時間短，質(zhì)量不穩(wěn)定以及運輸不便等因素而影響了其使用效果，凍干粉劑也因生產(chǎn)成本高而在很大程度上限制了其應用，而微生物固定化法可將游離微生物定位于限定的空間區(qū)域，并保持活性，且能反復利用，尤其是包埋固定化法，因操作簡單，在制備過程中對微生物活性影響小，制備的顆粒強度較高，更是深受微生態(tài)制劑研發(fā)人員的青睞。固定化微生物技術(shù)是將特選的微生物固定在選證的載體上，使其高度密集并保持生物活性，在適宜條件下能夠快速、大量增殖的生物技術(shù)。在微生物的固定化方法中，以包埋法最為常用。它的原理是將生物體細胞截留在水不溶性的凝膠聚合物孔隙的網(wǎng)絡中，通過聚合作用或通過離子網(wǎng)絡形成，或通過沉淀作用，或通過改變?nèi)軇?、溫度、PH值使細胞截留。凝膠聚合物的網(wǎng)絡可以阻止細胞的泄露，同時能讓基質(zhì)滲入和產(chǎn)物擴散出來。包埋材料可以分為兩大類(I)天然高分子多糖類，如海藻酸鹽、瓊脂、明膠等，其中以海藻酸鈉和卡拉膠應用最多，它們具有固化方便，對微生物毒性小及固定化密度高等優(yōu)點，但是它們抗微生物分解性能較差，機械強度低，但是可使用交聯(lián)劑進行穩(wěn)定化處理，但活力和傳質(zhì)性能又會下降。(2)合成高分子化合物，如聚丙烯酞胺等。這類交聯(lián)劑的突出優(yōu)點是抗微生物分解性能好，機械強度高，化學性能穩(wěn)定。但是聚合物網(wǎng)絡的形成條件比較劇烈，對微生物細胞的損害較大，而且成形的多樣性和可控性不好。張小能等在《噬菌蛭弧菌顆粒劑制備條件的優(yōu)化》中用海藻酸鈉包埋法研究了噬菌蛭弧菌顆粒劑制備條件的優(yōu)化，因為海藻酸鈉價格較高，制得的蛭弧菌顆粒劑成本較高，不適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的所要解決的技術(shù)問題是提供一種成本較低，活力和機械強度等更佳的噬菌蛭弧菌顆粒劑。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種蛭弧菌顆粒劑的制備方法，包括以下步驟(I)蛭弧菌菌液的制備將蛭弧菌菌種接種于IOOmL 1/10NB培養(yǎng)基中，同時加入100L的，于35°C _37°C溫度下100r/min-800r/min下?lián)u床振蕩培養(yǎng)24h_48h,優(yōu)化的,搖床振蕩為500r/min,使蛭弧菌菌液濃度為 I. OX 109CFU/mL-l. OX 1013CFU/mL ；(2)蛭弧菌包埋顆粒的制備取質(zhì)量分數(shù)為1% -10%濃度的瓊脂膠體溶液和步驟(I)制得蛭弧菌菌液，體積比為20 100-50 100，放入攪拌器中，并加入花生油，花生油和瓊脂膠體-蛭弧菌混合液的
體積比為I : 100-5 100 ；攪拌器在30°C恒溫攪拌30min，快速吸入無菌注射器中，滴入到質(zhì)量分數(shù)為1% -10%的CaCl2溶液中固化12h-24h，然后收集蛭弧菌固定化顆粒于_20°C _30°C條件下冷凍干燥24h既得蛭弧菌顆粒劑。大腸桿菌菌懸液的的濃度為I. OX 106CFU/mL-l. OX 109CFU/mL。瓊脂膠體溶液也可以用明膠代替。蛭弧菌包埋顆粒的制備中還加入戊二醛交聯(lián)劑，體積分數(shù)為O. 1% _1%。蛭弧菌菌種為市場上銷售的蛭弧菌制劑,經(jīng)增殖、純化,保存?zhèn)溆?。大腸桿菌菌懸液為常規(guī)微生物實驗制得。本發(fā)明的有益效果是采用瓊脂膠體溶液、明膠溶液包埋法和戊二醛交聯(lián)法相結(jié)合的方式，制備一種活力和機械強度等更佳的噬菌蛭弧菌顆粒劑，經(jīng)濟安全、保存時間長，可以用于水產(chǎn)養(yǎng)殖、畜禽養(yǎng)殖等多個行業(yè)。
具體實施例方式實施例I(I)蛭弧菌菌液的制備將蛭弧菌菌種接種于IOOmL 1/10NB培養(yǎng)基中，同時加入100L濃度為I. OX 106CFU/mL大腸桿菌菌懸液，于35°C溫度下100r/min下?lián)u床振蕩培養(yǎng)48h，菌落總數(shù)檢測蛭弧菌菌液濃度為I. OX 109CFU/mL。(2)蛭弧菌包埋顆粒的制備取IOOg瓊脂粉，用滅菌蒸餾水制備質(zhì)量分數(shù)為I %濃度的瓊脂膠體溶液，取步驟
(I)制得蛭弧菌菌液混合，兩者體積比為20 100，放入攪拌器中，并加入花生油，花生油和瓊脂膠體-蛭弧菌混合液的體積比為I : 100，加入戊二醛交聯(lián)劑，使溶液中戊二醛體積分數(shù)為O. 1%。攪拌器在30°C恒溫攪拌30min，快速吸入無菌注射器中，滴入到質(zhì)量分數(shù)為1%的CaCl2溶液中固化12h，然后收集蛭弧菌固定化顆粒于-20°C條件下冷凍干燥24h既得蛭弧菌顆粒劑。實施例2(I)蛭弧菌菌液的制備將蛭弧菌菌種接種于IOOmL 1/10NB培養(yǎng)基中，同時加入IOOL濃度為I. OX 109CFU/mL大腸桿菌菌懸液，于35°C溫度下800r/min下?lián)u床振蕩培養(yǎng)48h，菌落總數(shù)檢測蛭弧菌菌液濃度為I. OX 1013CFU/mL。(2)蛭弧菌包埋顆粒的制備取IOOOg瓊脂粉，用滅菌蒸餾水制備質(zhì)量分數(shù)為10%濃度的瓊脂膠體溶液，取步驟(I)制得蛭弧菌菌液混合，兩者體積比為50 100，放入攪拌器中，并加入花生油，花生油和瓊脂膠體-蛭弧菌混合液的體積比為5 100，加入戊二醛交聯(lián)劑，使溶液中戊二醛體積分數(shù)為I%。攪拌器在30°C恒溫攪拌30min，快速吸入無菌注射器中，滴入到質(zhì)量分數(shù)為10%的CaC12溶液中固化24h，然后收集蛭弧菌固定化顆粒于_30°C條件下冷凍干燥24h既得蛭弧菌顆粒劑。實施例3(I)蛭弧菌菌液的制備將蛭弧菌菌種接種于lOOmLl/lONB培養(yǎng)基中，同時加入100L濃度為I. OX IO9CFU/mL大腸桿菌菌懸液，于35°C溫度下500r/min下?lián)u床振蕩培養(yǎng)48h，菌落總數(shù)檢測蛭弧菌菌液濃度為 I. OX 1013CFU/mL。(2)蛭弧菌包埋顆粒的制備取500g瓊脂粉，用滅菌蒸餾水制備質(zhì)量分數(shù)為5%濃度的瓊脂膠體溶液，取步驟
(I)制得蛭弧菌菌液混合，兩者體積比為30 100，放入攪拌器中，并加入花生油，花生油和瓊脂膠體-蛭弧菌混合液的體積比為3 100，加入戊二醛交聯(lián)劑，使溶液中戊二醛體積分數(shù)為O. 5% O攪拌器在30°C恒溫攪拌30min，快速吸入無菌注射器中，滴入到質(zhì)量分數(shù)為5%的CaCl2溶液中固化24h，然后收集蛭弧菌固定化顆粒于-30°C條件下冷凍干燥24h既得蛭弧菌顆粒劑。
權(quán)利要求
1.一種蛭弧菌消毒劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟 (1)蛭弧菌菌液的制備 將蛭弧菌菌種接種于lOOmLl/lONB培養(yǎng)基中，同時加入IOOL的大腸桿菌菌懸液，于35 0C _37°C溫度下100r/min-800r/min下?lián)u床振蕩培養(yǎng)24h_48h，使蛭弧菌菌液濃度為I.OX 109CFU/mL-l. OX 1013CFU/mL ； (2)蛭弧菌包埋顆粒的制備 取質(zhì)量分數(shù)為1% -10%濃度的瓊脂膠體溶液和步驟(I)制得蛭弧菌菌液，體積比為20 100-50 100，放入攪拌器中，并加入花生油和交聯(lián)劑，花生油和瓊脂膠體-蛭弧菌混合液的體積比為I : 100-5 100 ； 攪拌器在30°C恒溫攪拌30min，快速吸入無菌注射器中，滴入到質(zhì)量分數(shù)為1% -10%的CaC12溶液中固化12h-24h，然后收集蛭弧菌固定化顆粒于_20°C _30°C條件下冷凍干燥24h既得蛭弧菌顆粒劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蛭弧菌顆粒劑的制備方法，其特征在于所述交聯(lián)劑為戊二醛，戊二醛的體積分數(shù)為O. 1% -1%。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蛭弧菌顆粒劑的制備方法，其特征在于所述蛭弧菌菌液的制備中以500r/min搖床振蕩培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蛭弧菌顆粒劑的制備方法，其特征在于所述大腸桿菌菌懸液的的濃度為 I. OX 106CFU/mL-L OX 109CFU/mL。
5.一種按照權(quán)利要求I制備的蛭弧菌顆粒劑，為白色固體顆粒。
6.一種按照權(quán)利要求I制備的蛭弧菌顆粒劑的用途，可以用于水產(chǎn)養(yǎng)殖、畜禽養(yǎng)殖等環(huán)境的消毒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蛭弧菌消毒劑及其制備方法和用途，具體的是一種噬菌蛭弧菌顆粒劑，屬于微生物固定化領(lǐng)域。包括以下步驟(1)蛭弧菌菌液的制備將蛭弧菌菌種接種于大腸桿菌菌懸液中增殖培養(yǎng)，使蛭弧菌菌液濃度為1.0×109CFU/mL-1.0×1013CFU/mL；(2)蛭弧菌包埋顆粒的制備將蛭弧菌菌液與瓊脂膠體溶液、戊二醛和花生油恒溫攪拌30min，滴入到CaCl2溶液中固化，冷凍干燥24h既得蛭弧菌顆粒劑。本發(fā)明采用包埋法和戊二醛交聯(lián)法相結(jié)合的方式，制備一種活力和機械強度等更佳的噬菌蛭弧菌顆粒劑，經(jīng)濟、安全、保存時間長，可以用于水產(chǎn)養(yǎng)殖、畜禽養(yǎng)殖等多個行業(yè)。
文檔編號A01N25/12GK102870819SQ20121031339
公開日2013年1月16日 申請日期2012年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月21日
發(fā)明者邵緒霞 申請人:青島叁鼎衛(wèi)生制品有限公司