專利名稱：一株多粘類芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株多粘類芽孢桿菌及其應(yīng)用，特別涉及該株多粘類芽孢桿菌及其在抑制病原真菌、病原細(xì)菌和防治植物真菌病害中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多粘類芽抱桿菌(Paenibacilluspolymyxa(Prazmonski)Ash, Priest&Collins)是ー種產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性細(xì)菌，為類芽孢桿菌屬的模式種，1993年之前分類上歸為芽孢桿菌屬，拉丁名為Bacillus polymyxa(Prazmonski)Mac6。多粘類芽孢桿菌對植物具有非致病性，同時具有防病作用和促生作用，作為生防菌廣泛應(yīng)用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。研究表明多粘類芽孢桿菌有從土壤向植物根部移動定殖的能力，并能產(chǎn)生肽類和蛋白質(zhì)類，以及核 苷類、吡嗪類和酚類等多種抗菌物質(zhì)，可防治多種植物病害。多粘類芽孢桿菌產(chǎn)生的肽類抗菌物質(zhì)按作用效果不同可分為兩類，一類是只對細(xì)菌(包括革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌)有抑制作用的抗菌物質(zhì)，這類肽類抗生素包括多粘菌素、粘菌素、環(huán)桿菌素、多肽菌素、Paenibacillin、Gavaserin和Saltavidin。而另一類是對真菌和革蘭氏陽性細(xì)菌均有活性的抗菌物質(zhì)，包括喬利肽菌素、谷纈菌素、殺錸孢菌素等。多粘類芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌蛋白主要為水解酶類，這些蛋白類抗菌物質(zhì)通常只能給出分子量及部分性質(zhì)，分子量從IOKDa到37KDa不等,立體結(jié)構(gòu)及氨基酸ー級結(jié)構(gòu)還需進ー步研究。多粘類芽孢桿菌的核苷類抗菌活性物質(zhì)主要為多氧霉素(Polyxin)此外，多粘類芽孢桿菌能通過固氮和溶磷作用為宿主植物提供養(yǎng)料，促進植株生長，提高植物的抗病原微生物效果。多粘類芽孢桿菌作用范圍廣，對植物病原細(xì)菌、病原真菌、根結(jié)線蟲(Khan Z, Kim S G,Jeon YH, et al. , 2008, A plantgrowth promoting rhizoDacterium，PaembacilJ_us poiymyxa stramGBR-1, suppressesroot-knot nematode, Bioresource Technology, 99 (8) : 3016-3023)等多種有害生物均有抑制作用。其作用機理多祥，既可產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)，又有可以菌體直接起作用，還能與植物互作而增強植物抗病性。綜上所述，多粘類芽孢桿菌能分泌多種胞外抗菌物質(zhì)，對多種植物病原物有抑制活性，是ー種很好的生防菌。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的ー個目的是提供一株新的多粘類芽孢桿菌，該菌株經(jīng)過發(fā)酵后產(chǎn)生具有強烈抑菌作用的活性代謝產(chǎn)物，該菌株及其活性代謝產(chǎn)物可用于制備廣譜性抑制病原真菌和病原細(xì)菌的生防制劑，用于防治植物真菌和細(xì)菌病害。本發(fā)明所提供的多粘類芽孢桿菌，是多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001，已于2011年12月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏登記號為CGMCC No. 5563。本發(fā)明的另ー個目的是提供一種生防制劑。該生防制劑的活性成分為所述多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563的代謝產(chǎn)物，或/和所述多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563。所述代謝產(chǎn)物可從除去多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001CGMCC No. 5563菌體的發(fā)酵濾液中獲得。在本發(fā)明中，所述生防制劑具體為如下兩種生防制劑I :菌體與代謝產(chǎn)物混合制劑，即所述多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563 的發(fā)酵液，或所述多粘類芽抱桿菌(Paenibacilluspolymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563的發(fā)酵液和草炭的混合物。生防制劑2 :代謝產(chǎn)物制劑，即所述多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563 的無菌發(fā)酵濾液。 在本發(fā)明的一個實施例中，所述生防制劑具體按照如下如下A)或B)的方法獲得A)將所述多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563活化培養(yǎng)后取2 — 3環(huán)接種到裝液量為搖瓶1/10體積的NB培養(yǎng)基中。28°C，26mm振幅，170r/min振蕩培養(yǎng)48h，收集發(fā)酵液。收集發(fā)酵液后可根據(jù)需要將所述發(fā)酵液與草炭按照體積比I :1的比例混合，得到混合物。所述發(fā)酵液或所述混合物即為所述生防制劑I。B)將所述多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563活化培養(yǎng)后取2 — 3環(huán)接種到裝液量為搖瓶1/10體積的NB培養(yǎng)基中。28°C，26mm振幅，170r/min振蕩培養(yǎng)48h，室溫離心，取上清并過濾滅菌，得到所述多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563 的無菌發(fā)酵濾液，即為所述生防制劑2。所述NB培養(yǎng)基的pH為7.0-7. 2，溶質(zhì)為葡萄糖、蛋白胨和牛肉膏，溶劑為水；所述葡萄糖、所述蛋白胨和所述牛肉膏在所述NB培養(yǎng)基中的終濃度依次為0. 5g/100ml、0.5g/100ml、0. 3g/100ml。所述生防制劑為下述I) -4)中任一的生防制劑I)用于防治植物真菌病害的生防制劑；2)用于防治植物細(xì)菌病害的生防制劑；3)用于抑制病原真菌的生防制劑；4)用于抑制病原細(xì)菌的生防制劑。所述多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563在制備下述I) -4)中任一生防制劑中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍I)用于防治植物真菌病害的生防制劑；2)用于防治植物細(xì)菌病害的生防制劑；3)用于抑制病原真菌的生防制劑；4)用于抑制病原細(xì)菌的生防制劑。在上述生防制劑和生防制劑的應(yīng)用中，所述病原真菌具體可為下述真菌中至少一種蘋果輪紋病菌(Botryosphaeria berengeriana f. sp piricela)、棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae)、桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)、禾谷絲核菌(小麥紋枯病菌)(Rhizoctonia cerealis)、百合基腐病菌(Fusarium oxysporum f. sp. lilii)和甘藍(lán)枯奏病菌(Fusarium oxysporum f. sp. conglutinansノ ；
所述病原細(xì)菌具體可為下述細(xì)菌中至少ー種黃瓜角斑病菌(Pseudomonassyringae pv. Iachrymans)和根癌土壤桿菌(桃冠瘦病菌)(Agrobacterium tumefaciens)。在本發(fā)明的一個實施例中，所述植物真菌病害具體為枯萎病，更加具體的，所述枯萎病具體為由尖錸孢粘團?；?Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans),即上述甘藍(lán)枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans)所引起的十字花科枯萎病。所述植物為甘藍(lán)；所述甘藍(lán)的具體品種為中甘21。所述多粘類芽抱桿菌(Paenibacilluspolymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563,或所述生防制劑在如下a)或b)中應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍a)促進植物生長；所述促進植物生長體現(xiàn)在促進根系擴展和/或提高植株鮮重和/或提高植株干重上；所述植物具體可為甘藍(lán)，如中甘21。
b)制備微生物肥料。本發(fā)明的再ー個目的是提供ー種含有所述多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563，或所述生防制劑的微生物肥料。通常情況下，所述微生物肥料為含有所述多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563 發(fā)酵液的肥料。所述生防制劑的制備方法也屬于本發(fā)明的保護范圍。該方法包括如下步驟將所述多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polxmyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563 的代謝產(chǎn)物，或/ 和所述多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563 作為活性成分，得到所述生防制劑。所述代謝產(chǎn)物可從除去多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001CGMCC No. 5563菌體的發(fā)酵濾液中獲得。在本發(fā)明的一個實施例中，所述生防制劑具體按照如下如下A)或B)的方法獲得A)將所述多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563活化培養(yǎng)后取2 — 3環(huán)接種到裝液量為搖瓶1/10體積的NB培養(yǎng)基中。28°C，26mm振幅，170r/min振蕩培養(yǎng)48h，收集發(fā)酵液。收集發(fā)酵液后可根據(jù)需要將所述發(fā)酵液與草炭按照體積比I :1的比例混合，得到混合物。所述發(fā)酵液或所述混合物即為所述生防制劑I。B)將所述多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563活化培養(yǎng)后取2 — 3環(huán)接種到裝液量為搖瓶1/10體積的NB培養(yǎng)基中。28°C，26mm振幅，170r/min振蕩培養(yǎng)48h，室溫離心，取上清并過濾滅菌，得到所述多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563 的無菌發(fā)酵濾液，即為所述生防制劑2。所述NB培養(yǎng)基的pH為7.0-7. 2，溶質(zhì)為葡萄糖、蛋白胨和牛肉膏，溶劑為水；所述葡萄糖、所述蛋白胨和所述牛肉膏在所述NB培養(yǎng)基中的終濃度依次為0. 5g/100ml、
0.5g/100ml、0. 3g/100ml。本發(fā)明所提供的多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001CGMCCNo. 5563具有如下優(yōu)點I、本發(fā)明所提供的多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001CGMCCNo. 5563及其無菌發(fā)酵濾液具有明顯的抗菌活性，抗菌譜廣，對甘藍(lán)枯萎病菌(F. oxysporum f. sp. conglutinans)、禾谷絲核菌(小麥紋枯病菌)(R. cerealis)、桃褐腐病菌(M. fructicola)、蘋果輪紋病菌(B. berengeriana f. sp piricola)、百合基腐病菌(F. oxysporum f. sp. lilii)、棉花黃萎病菌(V. dahliae)、黃瓜角斑病菌(P. syringaepv. lachrymans)、根癌土壤桿菌(桃冠癭病菌)(Agrobacterium tumefaciens)等病原菌和蠟狀芽孢桿菌(B. cereus)、枯草芽孢桿菌(B. subtilis)、大腸桿菌(E. coli)、等細(xì)菌均有強烈的抑制作用。2、在甘藍(lán)枯萎病的溫室和田間防治試驗中，本發(fā)明所提供的多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563發(fā)酵液的防治效果均優(yōu)于陽性對照50%多菌靈500倍液,在溫室盆栽防治試驗中，多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563發(fā)酵液對甘藍(lán)枯萎病的平均預(yù)防和治療效果分別可達(dá)91. 21%和67. 43%o在田間小區(qū)栽培防治試驗中，多粘類芽孢桿菌(PaenibaciIIus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563發(fā)酵液及其生防制劑(草炭+發(fā)酵液)對甘藍(lán)枯萎病的平均防治效果分別可達(dá)79. 93%和88.03%。另外，多粘類芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563的發(fā)酵液對甘藍(lán)根系擴展和植株生長有促進作用。表現(xiàn)出良好的開發(fā)應(yīng)用前景。3、多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563 的無菌發(fā)酵濾液PH值范圍耐受范圍寬，在pH 1-14的條件下均能保持較高的抑菌活性，對紫外線的照射不敏感，并能經(jīng)受90°C的高溫,這些特點使得多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563發(fā)酵產(chǎn)物在田間應(yīng)用中具有較強的環(huán)境適應(yīng)能力，為多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001 CGMCCNo. 5563生防制劑的開發(fā)應(yīng)用提供了很好的依據(jù)。保藏說明菌種名稱多粘類芽孢桿菌拉丁名“Paenibacillus polymyxa)菌株編號JZB120001保藏機構(gòu)中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機構(gòu)簡稱CGMCC地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號保藏日期2011年12月9日保藏中心登記入冊編號CGMCC No. 556

圖I 為多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563 的菌體形態(tài)顯微照片(1000X )。圖2 為多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563 的芽孢染色結(jié)果的顯微照片(1000X )。圖3 為多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563 的16S rDNA擴增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果。其中，泳道M為250bp DNA Ladder Marker ;泳道I和泳道2均為16S rDNA PCR產(chǎn)物。圖4 為多粘類芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563 基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。圖5 為多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563對不同真菌的抑菌活性檢測結(jié)果。其中，a為甘藍(lán)枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp.conglutinans) ;b為禾谷絲核菌(小麥紋枯病菌)(Rhizoctonia cerealis) ;c為桃褐腐病菌(Monilinia fructicola) ;d 為蘋果輪紋病菌(Botryosphaeria berengerianaf. sp piricola) ;e為百合基腐病菌(F. oxysporum f. sp. lilii) ;f為棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae)。圖6 為多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563無菌發(fā)酵濾液對不同細(xì)菌的抑菌活性檢測結(jié)果。其中，a為蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus) ;b 為枯草芽抱桿菌(B. subtilis) ;c 為大腸桿菌(Escberichia coli) ;(1為桃根癌炳菌(Agrobacterium tumefaciens) ;e 為黃瓜角斑炳菌(Pseudomonas syringaepv. lachrymans) o a_e中，位于平板左側(cè)的A均為多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563無菌發(fā)酵濾液處理組；位于平板右側(cè)的B均為無菌水對照。圖7 為多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563無菌發(fā)酵濾液抗細(xì)菌活性穩(wěn)定性檢測的結(jié)果。其中，a為多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563無菌發(fā)酵濾液經(jīng)不同pH處理后的檢測結(jié)果；數(shù)值
1、3、5、9、11、14分別表示六個不同的pH處理組。b為多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563無菌發(fā)酵濾液經(jīng)紫外線(254nm)光照處理不同時間后的檢測結(jié)果；數(shù)值30、60、90、120、150分別表示五個不同時間的紫外線(254nm)光照處理組，單位為min。。為多粘類芽抱桿菌(Paenibacillus poIymyxa)JZB 120001 CGMCC No. 5563無菌發(fā)酵濾液經(jīng)不同溫度處理后的檢測結(jié)果；數(shù)值60、70、80、90、100分別表示五個不同的溫度處理組，單位為。C。a_c中，A均為多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCCNo. 5563無菌發(fā)酵濾液對照組；B均為50 u g/ml的硫酸鏈霉素(20 U I)陽性對照。圖8 為多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563 發(fā)酵液對甘藍(lán)苗植株的促生作用。其中，從左至右依次為促生空白對照、發(fā)酵液単獨處理(促生作用組)、發(fā)酵液處理后接種枯萎病菌(預(yù)防作用組)、接種枯萎病菌后用發(fā)酵液處理(治療作用組)、接種枯萎病菌后用多菌靈處理(藥劑治療對照組)、単獨接種枯萎病菌(防治空白對照組)。
具體實施例方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。供試菌臘狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)提供(中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌株庫藏號ACCC10263)；甘藍(lán)枯萎病菌(Fusariumoxysporum f. sp. conglutinans):李明遠(yuǎn)，張濤濤，李興紅，等.十字花科蔬菜枯萎病及其病原鑒定[J].植物保護，2003，29(3) :44-45.
禾谷絲核菌(小麥紋枯病菌)(Rhizoctonia cerealis):中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌株庫藏號ACCC37699 ；桃褐腐病菌(Monilinia Fructicola):陳笑瑜，師迎春，駱勇，國立耘.桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)對3種殺菌劑的敏感性[J].植物保護，2006，32(3) :25-28.蘋果輪紋病菌(Botryosphaeriaberengeriana f. sp piricola):冷偉鋒,李保華，國立耘，等.蘋果輪紋病菌誘導(dǎo)產(chǎn)孢方法.植物病理學(xué)報，2009，39 (5) : 536-539.百合基腐病菌(F. oxysporum f. sp. lilii):許志剛 拉漢ー漢拉植物病原生物名稱.北京中國農(nóng)業(yè)出版社，2007.棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae):中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心,菌株庫藏號ACCC 30308 ； 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis):中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心,菌株庫藏號 ACCC 10115 ；大腸桿菌(Escherichia coli):中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心,菌株庫藏號ACCC 10080 ；根癌土壤桿菌(桃冠癭病菌)(Agrobacterium tumefaciens):中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌株庫藏號ACCC 10055 ；；黃瓜角斑病菌(Pseudomonassyringae pv. lachrymans):許志剛 拉漢ー漢拉植物病原生物名稱.北京中國農(nóng)業(yè)出版社，2007.；以上各供試菌公眾均可從北京市農(nóng)林科學(xué)院植環(huán)所獲得。NB培養(yǎng)基葡萄糖5. Og,蛋白胨5. Og,牛肉膏3. Og,蒸懼水定容1000ml,pH7. 0-7. 2，121°C 滅菌 20min。PDA培養(yǎng)基葡萄糖20g，瓊脂18g，馬鈴薯200g，加水IOOOmL煮沸30min濾取汁液，加水補足 1000ml, pH6. 0-7. 0，121°C滅菌 20min。NA培養(yǎng)基葡萄糖5. 0g，蛋白胨5. 0g，牛肉膏3. Og,瓊脂18g，水1000ml，pH7. 0-7. 2，121°C 滅菌 20min。甘藍(lán)品種中甘21號中國農(nóng)科院蔬菜花卉研究所，中甘21號甘藍(lán)種子。實施例I、多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001的分離與鑒定一、菌株JZB120001的分離篩選多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001,是從北京郊區(qū)種植蔬菜的耕作土壌中分離篩選獲得。具體方法如下從北京郊區(qū)蔬菜田采集土壤樣品，取10 g加入裝有IOOml無菌水和10粒玻璃珠的三角瓶中，于26mm振幅搖床上100r/min振蕩20min，取0. 5ml加入4. 5ml無菌水中制成土壤懸液，再依次稀釋10_2，10_3，10_4倍，分別取各稀釋土壤懸液0. Iml在NA培養(yǎng)基平板上均勻涂布，超凈工作臺內(nèi)吹至略干；每濃度3個重復(fù)，置28°C恒溫箱中培養(yǎng)5-10d，挑取細(xì)菌單菌落在NA平板上再次稀釋劃線獲得純培養(yǎng)。以甘藍(lán)枯萎病菌等病原真菌和黃瓜角斑病菌等細(xì)菌為靶標(biāo)菌，利用對峙培養(yǎng)法分別在PDA培養(yǎng)基和NA培養(yǎng)基平板上進行拮抗菌的初篩；對初篩獲得的有拮抗活性的菌株進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液經(jīng)0. 45 y m的無菌微孔濾膜過濾除菌獲得無菌發(fā)酵濾液；分別利用牛津杯法和凹玻片法進ー步測試無菌發(fā)酵濾液對病原菌菌絲生長和分生孢子萌發(fā)的抑制作用，利用溫室盆栽接種試驗測試發(fā)酵液對甘藍(lán)枯萎病的溫室防病效果，最終篩選出性狀優(yōu)良的生防菌株。將篩選所得的ー株菌編號為JZB120001。ニ、菌株 JZB120001 的鑒定從以下幾個方面對步驟一中分離得到的菌株JZB120001進行分類鑒定I、形態(tài)學(xué)鑒定將上述步驟一分離得到的菌株JZB120001培養(yǎng)至對數(shù)生長期且菌落大小穩(wěn)定吋，進行菌落形態(tài)描述，主要包括菌落的大小、顔色、透明度、濕潤度、菌落表面狀態(tài)(是否平坦、突起、褶皺、凹陷等)、菌落邊緣狀態(tài)(是否整齊、不規(guī)則、放射狀等)。對于處于對數(shù)生長期的所述菌株JZB120001，經(jīng)涂片后進行美藍(lán)染色、芽孢染色和 革蘭氏染色，光鏡下觀察菌體和芽孢形態(tài)及革蘭氏染色特性。結(jié)果表明，上述步驟一分離得到的菌株JZB120001菌落在NA培養(yǎng)基平板上呈薄層、似變形蟲的移動擴散狀；在PDA培養(yǎng)基平板上為大型粘液狀，乳白至淺黃色，表面光滑，中央常有小突起；菌體桿狀，2-5X0. 6-0.8 iim (圖1)，革蘭氏染色陽性，芽孢膨大，呈橢圓形，位于菌體的末端或次末端(圖2)。2、生理生化特征分析采用常規(guī)方法對菌株JZB120001進行生理生化特性分析，試驗項目及其結(jié)果見表
Io表I拮抗菌株JZB120001的生理生化特性
試驗項S結(jié)果試驗項S結(jié)果
接觸_+利用tt露醇產(chǎn)酸+
氧化酶—利用葡萄糖產(chǎn)氣+
厭氧生長+利用檸懞酸鹽—
VP試驗+硝酸鹽還原+
VP<pH6+50°C 生長_
VP>pH7—pH5.7 生[_<:+
甲基紅試驗+7%NaCl生長一
利用葡萄糖產(chǎn)酸+淀粉水解+
利用木糖產(chǎn)酸+明膠液化+
利用L-阿拉伯糖產(chǎn)酸 j+j 分解酪I !_ +3、16s rDNA序列同源性分析常規(guī)方法培養(yǎng)上述步驟一分離得到的菌株JZB120001，提取菌株的總DNA作為基因擴增模板，以細(xì)菌 16s rDNA 通用引物，27f :5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ' , 1492r 5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'進行 PCR 反應(yīng)。反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸2min，30個循環(huán)；72°C延伸8min。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目標(biāo)條帶送北京三博遠(yuǎn)志測序。所得序列通過美國國家生物技術(shù)信息中心 NCBI 數(shù)據(jù)庫(http: //www. ncbi. nlm. nih. gov)在線 Blast 比對，選擇與其 16S rDNA 序列相似性高的模式菌株利用Mega5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
菌株JZB120001的16S rDNA擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得了約1500bp的條帶(圖3)，測序結(jié)果表明其長度為1463bp，其序列詳見序列表中序列I ;經(jīng)在線Blast比對，與其序列相似性較高的前23個菌株中，除枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株RZ(EU220428. I)和 4 個 Paenibacillus sp.菌株(HQ317156. I、⑶328695. I、⑶979221. I和⑶328690. I)タト，包括前8個菌株在內(nèi)的其余18個菌株均為多粘類芽孢桿菌；而枯草芽孢桿菌的模式菌株DSM IOt (NR_027552. I) 16S rRNA基因序列與菌株JZB120001的相似性卻相距較遠(yuǎn)，應(yīng)用兩序列比對程序比對的結(jié)果僅為87%，由此推測枯草芽孢桿菌菌株RZ與菌株JZB120001的相似性尚不能代表枯草芽孢桿菌與菌株JZB120001的親緣關(guān)系。選擇Blast結(jié)果中與菌株JZB120001相似性在97%以上的6個種及枯草芽孢桿菌的模式菌株與菌株JZB120001 —起構(gòu)建的基于16S rDNA序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4。由圖4可見，菌株JZB120001與多粘類芽孢桿菌的2個模式菌株IAM 134191和DSM 36T聚為同一分支，與其另ー模式菌株NRS-11051的距離也較近；而枯草芽孢桿菌的模式菌株DSM IOt與所有菌株 的遺傳距離均最遠(yuǎn)，成為該發(fā)育樹的外群。 鑒于上述形態(tài)、生理生化特征和16s rDNA序列同源性分析結(jié)果，將步驟一分離得到的菌株JZB120001鑒定為類芽孢桿菌科(Paenibacillaceae)類芽孢桿菌屬(Paemibacillus)多粘類芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa)。該菌株 JZB120001 已于2011年12月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)，建議的分類命名為多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa),保藏編號為 CGMCC No. 5563。實施例2、多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563及其代謝產(chǎn)物的抑菌活性檢測一、多粘類芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563 發(fā)酵液及無菌發(fā)酵濾液的制備將多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563 在 NA培養(yǎng)基斜面上活化培養(yǎng)后取2-3環(huán)接種到500ml三角瓶內(nèi)的50ml NB培養(yǎng)基中。28°C，26mm振幅，170r/min振蕩培養(yǎng)24h作為種子培養(yǎng)液；將其按2% (v/v)的接種量轉(zhuǎn)接于500ml三角瓶內(nèi)的50ml NB培養(yǎng)基中，28 °C，170r/min振蕩培養(yǎng)48h，得多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563 發(fā)酵液(原液)。所得發(fā)酵液6. 87X IO3g (8500r/min)室溫離心15min，取上清用0. 45 y m微孔濾膜過濾滅菌，得到多粘類芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563 的無菌發(fā)酵濾液(除去菌體的代謝產(chǎn)物溶液)。ニ、多粘類芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563 抗真菌活性的測定供試的病原真菌為甘藍(lán)枯萎病菌(Fusariumoxysporum f. sp. conglutinans)、禾谷絲核菌(小麥紋枯病菌)(Rhizoctonia cerealis)、桃褐腐病菌(Moniliniafructicola)、蘋果祀紋ラ丙 M (Botryosphaeria berengeriana f. sp piricolaノ、百合務(wù)腐炳囷(Fusarium oxysporum f. sp. Iiliiノ、棉花黃_炳M (Verticillium dahliae)。采用平板對峙培養(yǎng)法先在PDA平板相對兩側(cè)接種拮抗菌多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563，28°C培養(yǎng) 2d后，在上述已接種好多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563 的 PDA 平板中央接種靶標(biāo)病原真菌，28°C繼續(xù)培養(yǎng)3d，觀察并測量接種拮抗菌和病原真菌菌落之間的抑菌帶寬度(楊慧勇，李飛鳳，陸瓊嫻，等，2006.拮抗菌株AFR0406對小麥赤霉病菌和紋枯病菌的生物活性測定.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，6:142-144)。每個處理三次重復(fù)，實驗結(jié)果以三次重復(fù)的平均值土標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。同時設(shè)置只接病原真菌而不接多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563 的對照。測定結(jié)果如表2和圖5所示，多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563在PDA平板上對所有供試的病原真菌都有抑制作用。其中對蘋果輪紋病菌(Botryosphaeria berengeriana f. sp piricola)的抑菌帶寬度達(dá) 15. 6mm ;對桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)和棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae)的抑菌帶寬度可達(dá)14. 5mm以上；對甘藍(lán)枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans)、禾谷絲核菌(小麥紋枯病菌)(Rhizoctonia cerealis)和百合基腐病菌(F. oxysporum f. sp.lilii)的抑菌帶寬度也達(dá)11. 5mm以上。表2 多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001 CGMCC No. 5563 的抗
權(quán)利要求
1.多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa) JZB120001,它在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的藏編號為CGMCC No. 5563。
2.ー種生防制劑，它的活性成分為權(quán)利要求I所述的多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563的代謝產(chǎn)物和/或權(quán)利要求I所述的多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生防制劑，其特征在于所述生防制劑為下述I)-4)中任一的生防制劑 1)用于防治植物真菌病害的生防制劑； 2)用于防治植物細(xì)菌病害的生防制劑； 3)用于抑制病原真菌的生防制劑； 4)用于抑制病原細(xì)菌的生防制劑。
4.權(quán)利要求I所述的多粘類芽抱桿菌(Paenibacilluspolymyxa) JZB120001CGMCCNo. 5563在制備下述I) _4)中任一生防制劑中的應(yīng)用 1)用于防治植物真菌病害的生防制劑； 2)用于防治植物細(xì)菌病害的生防制劑； 3)用于抑制病原真菌的生防制劑； 4)用于抑制病原細(xì)菌的生防制劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生防制劑或權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述病原真菌為下述中至少一種蘋果輪紋病菌(Botryosphaeria berengeriana f. sppiricola)、棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae)、桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)、小麥紋枯病菌(Rhizoctonia cerealis)、百合基腐病菌(Fusarium oxysporum f. sp. lilii)和甘藍(lán)枯姜病菌(Fusarium oxysporum f. sp. conglutinansノ ； 所述病原細(xì)菌為下述中至少一種黃瓜角斑病菌(Pseudomonas Iachrymans)和桃冠癭炳囷(Agrobacterium tumefaciens)； 所述植物真菌病害為枯萎病。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生防制劑或應(yīng)用，其特征在于所述枯萎病為由甘藍(lán)枯萎病|if I Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans)所弓 I起的炳舍。
7.權(quán)利要求I所述的多粘類芽抱桿菌(Paenibacilluspolymyxa) JZB120001CGMCCNo. 5563，或權(quán)利要求2、3、5或6所述的生防制劑在如下a)或b)中應(yīng)用 a)促進植物生長； b)制備微生物肥料。
8.含有權(quán)利要求I所述多粘類芽抱桿菌(Paenibacilluspolymyxa) JZB120001CGMCCNo. 5563，或權(quán)利要求2、3、5或6所述生防制劑的微生物肥料。
9.權(quán)利要求2、3、5或6所述生防制劑的制備方法，包括如下步驟將所述多粘類芽孢桿菌(Paenibaeillus polymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563 的代謝產(chǎn)物，或/和所述多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa) JZB120001 CGMCC No. 5563 作為活性成分，得到所述生防制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株多粘類芽孢桿菌及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的多粘類芽孢桿菌是多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)JZB120001，它在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的藏編號為CGMCC No.5563。該菌株經(jīng)過發(fā)酵后產(chǎn)生具有強烈抑菌作用的活性代謝產(chǎn)物，該菌株及其活性代謝產(chǎn)物可用于制備廣譜性抑制病原真菌和病原細(xì)菌的生防制劑，用于防治植物真菌病害。
文檔編號A01P1/00GK102851243SQ20121033025
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月7日
發(fā)明者劉偉成, 盧彩鴿, 劉霆, 董丹, 張濤濤, 吳慧玲, 劉德文, 張殿朋, 裘季燕, 趙爽 申請人:北京市農(nóng)林科學(xué)院