專(zhuān)利名稱(chēng)：一株根際拮抗細(xì)菌多粘類(lèi)芽孢桿菌yc0136及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株根際拮抗細(xì)菌多粘類(lèi)芽孢桿菌YC0136及其應(yīng)用，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，主要是ー株多粘類(lèi)芽孢桿菌能有效促進(jìn)煙株生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其系統(tǒng)抗性。
背景技術(shù)：
煙草黑胚病(Phytophthoraparasitica var. nicotianae)是我國(guó)發(fā)生最為嚴(yán)重的煙草土傳病害之一，其造成的年均損失12303. 38萬(wàn)元，僅次于病毒病。目前我國(guó)主要采用甲霜靈等化學(xué)農(nóng)藥來(lái)防治該病，但是長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致防治效果下降。此外，長(zhǎng)期、反復(fù)和大量使用化學(xué)農(nóng)藥可引起土壌、水體和大氣的污染，同時(shí)也殺傷了其他有益微生物、昆蟲(chóng)和畜禽，破壞了生態(tài)平衡。生物防治越來(lái)越受到人們的重 視，其中利用植物根際促生細(xì)菌(PGPR)防治土傳病害成為生物防治的重要研究領(lǐng)域。利用PGPR誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性使煙草具有對(duì)多種病害的抵抗能力在煙草生產(chǎn)中具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一株根際拮抗細(xì)菌多粘類(lèi)芽孢桿菌YC0136及其應(yīng)用，目的是研究煙草黑胚病拮抗菌多粘類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)YC0136的防病和促生效果，并且通過(guò)測(cè)定煙草抗性相關(guān)生理指標(biāo)來(lái)探討其對(duì)煙株系統(tǒng)抗性的誘導(dǎo)作用，為拮抗菌在煙草田間的應(yīng)用提供理論依據(jù)。本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)—株分離自貴州煙田根際土壤的多粘類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)菌株編號(hào)為YC0136,平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)中對(duì)煙草寄生疫霉(Phytophthora nicotianaevar.nicotianae)和煙草青枯病病原菌爺科雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)具有很強(qiáng)的拮抗能力。該菌株分類(lèi)命名為PaenibacilluspolymyxaYC0136,已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。以菌株YC0136的總DNA為模板，利用細(xì)菌16S rDNA通用引物(27F :5’ -GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 和 1495R :5’ -CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’ )進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，得到約為I. 4kb的擴(kuò)增產(chǎn)物，其核苷酸序列如SEQ NO. I所示。根據(jù)GenBank序列Blast比對(duì)，菌株YC0136與多粘類(lèi)芽孢桿菌PaenibacilluspolymyxaDSM 8320 的 16S rDNA 序列相似性達(dá) 99%。結(jié)合菌株的生理生化特征，將YCO13 6初歩鑒定為多粘類(lèi)芽孢桿菌，命名為多粘類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa) YC0136。多粘類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa) YC0136菌株的菌落和菌體特征為在LB平板上培養(yǎng)24h后呈圓形不透明，微黃，表面干燥；產(chǎn)芽抱，卵圓形，芽孢囊膨大，G+，細(xì)胞桿狀。多粘類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa) YC0136菌株的生理生化特征為接觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性，氧化酶實(shí)驗(yàn)陰性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽(yáng)性，淀粉水解試驗(yàn)陽(yáng)性，吲哚試驗(yàn)陰性，檸檬酸鹽利用試驗(yàn)陰性，運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)陽(yáng)性，葡萄糖產(chǎn)酸，果糖產(chǎn)酸，蔗糖產(chǎn)酸，甘露醇產(chǎn)酸。多粘類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa) YC0136菌株的培養(yǎng)條件為菌株活化采用LB培養(yǎng)基，即蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，蒸餾水1000ml。搖瓶發(fā)酵采用豆芽汁培養(yǎng)基黃豆芽200g，蔗糖20g，蒸餾水1000mL。30°C、170r/min搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)3d。多粘類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)YC0136菌株可以用于制備微生物菌齊U。應(yīng)用時(shí)，培養(yǎng)菌種，得菌懸液，作為液態(tài)肥料，菌懸液的濃度優(yōu)選為I. OX IO8CfuAil。溫室盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，煙草根際接種多粘類(lèi)芽孢桿菌(Paenibocilluspolymyxa) YC0136顯著降低了黑胚病病情指數(shù)，定植35d后溫室相對(duì)防效達(dá)到95. 9%，防治效果好于甲霜靈錳鋅，同時(shí)能夠促進(jìn)煙草的生長(zhǎng)發(fā)育。對(duì)煙草根系發(fā)育的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)接種拮抗菌能夠促進(jìn)煙草的根部生長(zhǎng)，根系活力高于對(duì)照。接種YC0136后在不同時(shí)期測(cè)定了煙草葉片中SOD、POD、CAT、PPO和PAL的活性和葉綠素、電解質(zhì)相對(duì)滲透率等生理指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)拮抗細(xì)菌YC0136誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性好于化學(xué)誘導(dǎo)因子(甲霜靈錳鋅)，葉片中幾 種防御酶活性和葉綠素含量均顯著高于對(duì)照，電解質(zhì)相對(duì)滲透率比對(duì)照有所降低，同時(shí)溫室試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)接種拮抗菌的煙草花葉病發(fā)病率比對(duì)照有所降低，最高幅度可達(dá)33. 33%，以上結(jié)果證明生防細(xì)菌可誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，增強(qiáng)煙草對(duì)病害的抵抗力。煙草定植60d時(shí)，生防細(xì)菌誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性作用最為顯著，此時(shí)也是煙草田間病害的高發(fā)期，誘導(dǎo)作用在煙草生長(zhǎng)后期仍有一定體現(xiàn)。結(jié)果表明拮抗菌YC0136能有效防治煙草黑脛病、促進(jìn)煙株生長(zhǎng)，具有良好的應(yīng)用潛力。保藏信息一株多粘類(lèi)芽抱桿菌YC0136 (Paenibacilluspolymyxa),于 2012 年 8月27日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號(hào)=CGMCCNO. 6475。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步的說(shuō)明。實(shí)施例I菌株的特性及其鑒定(I)菌株的分離篩選土壤樣品來(lái)自貴州煙田根際土壌。供試病原菌為煙草寄生疫霉(Phytophthoranicotianaevar. nicotianae)和煙草青枯病病原菌爺科雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)。分離用培養(yǎng)基為馬鈴薯鹿糖培養(yǎng)基(PDA)和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA)。拮抗菌的分離采用樣品梯度稀釋法得到分離物。采用平板對(duì)峙法篩選拮抗菌將馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基倒平板，用接種鋤將活化好的病原真菌切成黃豆粒般大小的塊狀，置于平板中央，于28°C培養(yǎng)2cT3d，待病原真菌長(zhǎng)到直徑為2cm時(shí)，用接種環(huán)挑取分離物，從靠近病原真菌的一側(cè)沿與其生長(zhǎng)方向相交的方向劃線(xiàn)接種，每個(gè)培養(yǎng)皿接種6-8個(gè)試驗(yàn)菌，于28°C培養(yǎng)24tT48h，根據(jù)有無(wú)抑菌帶及抑菌帶的大小判斷其拮抗效果。篩選得到ー株煙草根際拮抗菌，其分類(lèi)命名為多粘類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)YCO136,已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。(2)多粘類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)YC0136菌株的菌落和菌體特征在LB平板上30°C培養(yǎng)24h后呈圓形不透明，微黃，表面干燥；產(chǎn)芽孢，卵圓形，芽孢囊膨大，G+，細(xì)胞桿狀。(3)多粘類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)YC0136菌株的生理生化特征接觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性，氧化酶實(shí)驗(yàn)陰性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽(yáng)性，淀粉水解試驗(yàn)陽(yáng)性，吲哚試驗(yàn)陰性，檸檬酸鹽利用試驗(yàn)陰性，運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)陽(yáng)性，葡萄糖產(chǎn)酸，果糖產(chǎn)酸，蔗糖產(chǎn)酸，甘露醇產(chǎn)酸。(4) 16S rDNA 序列分析 PCR 擴(kuò)增 16S rDNA 序列采用常規(guī)方法提取細(xì)菌總DNA，以細(xì)菌總DNA為模板，27F和1495R作引物擴(kuò)增YCO136 的 16S rDNA 序列。PCR 反應(yīng)條件為95°C 5min，94°C lmin，56°C lmin，72°C I. 5min,30個(gè)循環(huán)，72 °C延伸lOmin。用3S柱離心式瓊脂糖DNA小量快速純化試劑盒(3S SpinAgaroseGel DNA purification kit)純化 PCR 產(chǎn)物。16S rDNA序列測(cè)定及分析測(cè)序由上海博尚生物技術(shù)有限公司完成。測(cè)序結(jié)果用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST進(jìn)行相似性分析。16S rDNA基因序列提交GenBank，其登錄號(hào)為EU430119. I。將所測(cè)16SrDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列比對(duì)，結(jié)果表明YC0136的16S rDNA序列與PaenibacilluspolymyxaDSM 8320的16S rDNA序列相似性達(dá)99%。結(jié)合菌落形態(tài)，生理生化特征和16S rDNA序列分析,將其鑒定為多粘類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa),保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏。實(shí)施例2制備菌劑多粘類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa) YC0136菌株的最適培養(yǎng)條件為菌株活化采用LB培養(yǎng)基，即蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，蒸餾水1000ml。搖瓶發(fā)酵采用豆芽汁培養(yǎng)基黃豆芽200g，蔗糖20g，蒸餾水lOOOmL。30°C、170r/min搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)3d。多粘類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)YC0136菌株可以用于制備微生物菌齊U。在LB培養(yǎng)基上劃線(xiàn)接種于30°C溫箱培養(yǎng)過(guò)夜，然后取菌種接種至三角瓶液體豆芽汁培養(yǎng)基，30°C搖床轉(zhuǎn)速為170r/min搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)3d，得菌懸液，作為液態(tài)肥料，使用時(shí)進(jìn)行稀釋至菌懸液的濃度為I. OX 108CfU/ml最佳，最高稀釋倍數(shù)可以達(dá)到200倍，稀釋菌液作為液態(tài)肥料可以浸根、灌根或噴施。實(shí)施例3盆栽試驗(yàn)將煙草盆栽試驗(yàn)在日光溫室內(nèi)進(jìn)行，設(shè)置三個(gè)處理，其中A處理接種多粘類(lèi)芽孢桿菌(PaenibaCilluSpOlymyXa)YC0136菌液；B處理為施加甲霜靈錳鋅作為藥劑對(duì)照；C處理為發(fā)病對(duì)照。每處理五次重復(fù)，每重復(fù)三棵煙苗。選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的5-6片真葉期的煙苗，移栽前將煙草幼苗在I X 108CFU/mL濃度的YC0136菌液中浸根30min，然后將煙苗移栽至盆中，藥劑對(duì)照和發(fā)病對(duì)照采用培養(yǎng)基浸根。緩苗3天后用移液槍頭將相應(yīng)的YC0136菌懸液(I X 108CFU/mL)灌入煙株根際，每株煙4mL菌液，同時(shí)取ImL菌液淋于莖基部，發(fā)病對(duì)照接入等量培養(yǎng)基，藥劑對(duì)照采用58%甲霜靈錳鋅可濕性粉劑500倍稀釋液澆灌處理，每盆150mL。Id后將配制好的黑脛病游動(dòng)孢子菌懸液(IO4個(gè)/mL)灌接于各處理煙苗根部，接種量為5mL/株。其余按照溫室常規(guī)管理，澆水保濕以利于發(fā)病。(I)拮抗菌多粘類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)YC0136對(duì)煙草病害的防治效果表I拮抗菌對(duì)煙草黑脛病溫室防效
權(quán)利要求
1.一株保藏編號(hào)為CGMCC NO. 6475的根際拮抗細(xì)菌多粘類(lèi)芽孢桿菌YC0136(Paenibacilluspolymyxa),其特征在于已于2012年8月27日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，其核苷酸序列如SEQ ID NO I所示。
2.如權(quán)利要求I所述的根際拮抗細(xì)菌多粘類(lèi)芽孢桿菌YC0136在煙草中的應(yīng)用，可防治煙草黑脛病、促進(jìn)煙草根系的發(fā)育，提高煙草的根系活力，促進(jìn)煙株生長(zhǎng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株根際拮抗細(xì)菌多粘類(lèi)芽孢桿菌YC0136及其應(yīng)用，目的是研究煙草黑脛病拮抗菌多粘類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)YC0136的防病和促生效果，并且通過(guò)測(cè)定煙草抗性相關(guān)生理指標(biāo)來(lái)探討其對(duì)煙株系統(tǒng)抗性的誘導(dǎo)作用，為拮抗菌在煙草田間的應(yīng)用提供理論依據(jù)；本發(fā)明分離得到的菌株能有效防治煙草黑脛病、促進(jìn)煙株生長(zhǎng)，具有良好的應(yīng)用潛力。
文檔編號(hào)C05F11/08GK102851250SQ20121034806
公開(kāi)日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月18日
發(fā)明者丁延芹, 姚良同, 杜秉海 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 德州創(chuàng)迪微生物資源有限公司