專利名稱：黃麻鏈霉菌nf0919菌株代謝產(chǎn)物在防治黃瓜病害上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物及用途,更具體地說涉及一種黃麻鏈霉菌iStreptomycescorchorusii)Wm\9菌株代謝產(chǎn)物及其在防治黃瓜病害防治上的應(yīng)用，屬于生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
黃瓜白粉^Uhysiphe cichoracearum) > 黃瓜霜霉 ^iFseucloperonosporacubensi5 )、黃瓜灰霉病 iBo trytis cinerea )和黃瓜枯萎病 iFusarium oxysporum )是黃瓜上主要的真菌和卵菌病害。黃瓜病害的防治當前主要通過化學(xué)防治來防控，常用的化學(xué)藥 劑有三唑酮、速克靈煙劑、惡霜靈、嘧菌酯、醚菌酯、苯醚甲環(huán)唑、烯肟菌酯、啶酰菌胺和吡唑醚菌酯等。長期以來，由于多頻次、多劑量施用化學(xué)藥劑，造成黃瓜病原菌對常用化學(xué)藥劑都產(chǎn)生了不同程度的抗(耐)藥性，生產(chǎn)上屢屢出現(xiàn)防治失敗的事例。目前成功用于防治黃瓜病害的生物農(nóng)藥專用制劑較少。文獻已報道生物防治控制病害的生防菌屬(種)主要有木霉菌屬真菌spp.)中的綠色木霉(Trichoderma viride )和哈茨木霉(Trichoderma harzianum)；芽抱桿菌屬細菌 iBaciIlusspp.)中的枯草芽抱桿菌多粘芽抱桿菌Cfeci77w5·和巨大芽孢桿菌(ifeciJrJrW1S megaterium');假單胞菌屬細菌spp.)中的突光假單胞細菌fluorescens、等。農(nóng)用抗菌素主要有農(nóng)抗120、春雷霉素和武夷菌素
坐寸ο本發(fā)明提供的可同時兼治黃瓜真菌和卵菌病害的頡頏細菌黃麻鏈霉菌NF0919菌株，在現(xiàn)有技術(shù)中沒有提及和公開。

發(fā)明內(nèi)容
提供黃麻鏈霉菌iStreptomyces corchorusii) NF0919菌株發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物的提取方法，及提取物在防治黃瓜白粉病、黃瓜霜霉病、黃瓜灰霉病和黃瓜枯萎病上的應(yīng)用。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的
本發(fā)明中提供用的黃麻鏈霉菌NF0919菌株的菌株特征，見專利ZL 201010236886. I。黃麻鏈霉菌(拉丁文學(xué)名為Streptomyces corchorusii) NF0919菌株，已于2010年7月8日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為=CGMCC No. 3968。本發(fā)明的黃麻鏈霉菌NF0919菌株發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物的提取方法，包括以下步驟
(A)菌株的活化與一級種子培養(yǎng)液的培養(yǎng)
將保存的NF0919菌株的斜面在高氏一號培養(yǎng)基上活化，30°C培養(yǎng)10 d，挑取I cm2大小的菌塊接種于50 mL—級種子培養(yǎng)液中(250 mL三角瓶裝培養(yǎng)液50 mL)，置于170 rpm搖床上30°C振蕩培養(yǎng)44 48 h，其中所述的50 mL—級種子培養(yǎng)液的成分為可溶性淀粉3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨l%，NaCl 0. 5%, K2HPO4 0. 2%，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl和K2HPO4含量的單位比例為W/V;
(B)二級種子培養(yǎng)液的培養(yǎng)
將步驟(A)所得一級種子培養(yǎng)液按5% (V/V)的接種量接入50 mL 二級種子培養(yǎng)液中(250 mL三角瓶裝培養(yǎng)液50 mL),170 rpm,30 °C搖床上培養(yǎng)48 - 52 h，其中所述的5%的單位比例為V/V ;所述的50 mL 二級種子培養(yǎng)液的成分(W/V):馬鈴薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白2. 2%, CaCO3 O. 1%，K2HPO4 O. 05%, MgSO4 O. 05%,淀粉酶 O. 01%,馬鈴薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO3、K2HPO4^MgSO4和淀粉酶含量的單位比例為W/V ；
(C)發(fā)酵培養(yǎng)液的培養(yǎng)
將步驟(B)所得二級種子培養(yǎng)液按5% (V/V)的接種量接種于裝有160 L發(fā)酵培養(yǎng)液的 容積為200 L的發(fā)酵罐中，其中所述的5%的單位比例為V/V，設(shè)置發(fā)酵參數(shù)為溶氧100%，消泡劑I. 6 L，攪拌速度為360 rpm,發(fā)酵溫度為36 °C，發(fā)酵時間為72 h，pH 6. 8 7. 2，所述的發(fā)酵培養(yǎng)液的成分為(W/V):馬鈴薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白2. 6%，K2HPO4 O. 05%, NaClO. 2%, MgSO4 O. 05%, CaCO3 O. 1%，ρΗ7· 2-7. 4，馬鈴薯淀粉、棉籽蛋白、K2HPO4、NaCl、MgSO4和CaCO3含量的單位比例為W/V ;所述的消泡劑為XP-100F系列發(fā)酵用有機硅消泡劑；
(D)NF0919菌株發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物分離方法
把步驟(C)所得發(fā)酵液在10000 rpm離心5 min得上清液，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至2. 0，出現(xiàn)沉淀，再次離心，收集沉淀物，用乙酸乙酯萃取3次，35°C真空干燥得提取物。本發(fā)明的有益效果是
本發(fā)明提供黃麻鏈霉菌NF0919菌株發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物的提取方法，并證明其提取物可同時防治黃瓜多種病害。大田防治結(jié)果表明，該菌株代謝產(chǎn)物對黃瓜白粉病、黃瓜霜霉病、黃瓜灰霉病和黃瓜枯萎病均有很好的防治效果。
具體實施方式
實施例本發(fā)明中提供用的黃麻鏈霉菌NF0919菌株的菌株特征，見專利ZL201010236886. I。本發(fā)明黃麻鏈霉菌NF0919菌株發(fā)酵液中產(chǎn)物的提取方法，包括以下步驟
(A)菌株的活化與一級種子培養(yǎng)液的培養(yǎng)
將保存的NF0919菌株的斜面在高氏一號培養(yǎng)基上活化，30°C培養(yǎng)10 d，挑取I cm2大小的菌塊接種于50 mL—級種子培養(yǎng)液中(250 mL三角瓶裝培養(yǎng)液50 mL)，置于170 rpm搖床上30°C振蕩培養(yǎng)44 48 h，其中所述的50 mL—級種子培養(yǎng)液的成分為可溶性淀粉3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨l%，NaCl O. 5%, K2HPO4 O. 2%，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl和K2HPO4含量的單位比例為W/V;
(B)二級種子培養(yǎng)液的培養(yǎng)
將步驟(A)所得一級種子培養(yǎng)液按5% (V/V)的接種量接入50 mL 二級種子培養(yǎng)液中(250 mL三角瓶裝培養(yǎng)液50 mL),170 rpm,30 °C搖床上培養(yǎng)48 - 52 h，其中所述的5%的單位比例為V/V ;所述的50 mL 二級種子培養(yǎng)液的成分(W/V):馬鈴薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白
2.2%, CaCO3 O. 1%，K2HPO4 O. 05%, MgSO4 O. 05%,淀粉酶 O. 01%,馬鈴薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO3、K2HPO4^MgSO4和淀粉酶含量的單位比例為W/V ；
(C)發(fā)酵培養(yǎng)液的培養(yǎng)
將步驟(B)所得二級種子培養(yǎng)液按5% (V/V)的接種量接種于裝有160 L發(fā)酵培養(yǎng)液的容積為200 L的發(fā)酵罐中，其中所述的5%的單位比例為V/V，設(shè)置發(fā)酵參數(shù)為溶氧100%，消泡劑I. 6 L，攪拌速度為360 rpm,發(fā)酵溫度為36 °C，發(fā)酵時間為72 h，pH 6. 8 7. 2，所述的發(fā)酵培養(yǎng)液的成分為(W/V):馬鈴薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白2. 6%，K2HPO4 O. 05%, NaClO. 2%, MgSO4 O. 05%, CaCO3 O. 1%，ρΗ7· 2-7. 4，馬鈴薯淀粉、棉籽蛋白、K2HPO4、NaCl、MgSO4和CaCO3含量的單位比例為W/V ;所述的消泡劑為XP-100F系列發(fā)酵用有機硅消泡劑；
(D)NF0919菌株發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物的提取方法
把步驟(C)所得發(fā)酵液在10000 rpm離心5 min得上清液，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至2. 0，出現(xiàn)沉淀，再次離心，收集沉淀物，用乙酸乙酯萃取3次，35°C真空干燥得提取物。本實施例的實施效果
NF0919菌株發(fā)酵液的提取物對黃瓜白粉病、黃瓜霜霉病、黃瓜灰霉病和黃瓜枯萎病的田間防效試驗。實驗在江蘇省句容市白兔鎮(zhèn)溫室大棚，黃瓜品種為津優(yōu)二號。試驗處理方案如下
(A)黃瓜白粉病的防治
藥劑處理方法NF0919菌株發(fā)酵液提取物3000倍液，對照藥劑為50%醚菌酯水分散粒劑(江蘇省綠盾植保農(nóng)藥實驗有限公司銷售)3000倍液，空白對照為不防治，小區(qū)面積40 m2,隨機區(qū)組排列，4次重復(fù)。處理時間為2011年4月，防治間隔期10天，連續(xù)細噴霧防治3次，用水量為50kg/667m2。第一次施藥前調(diào)查并計算出病情基數(shù)，最后一次防治后10天調(diào)查病情指數(shù)；
(B)黃瓜霜霉病的防治
藥劑處理方法NF0919菌株發(fā)酵液提取物3000倍液，對照藥劑為50%醚菌酯水分散粒劑(江蘇省綠盾植保農(nóng)藥實驗有限公司銷售)3000倍液，空白對照為不防治，小區(qū)面積40 m2,隨機區(qū)組排列，4次重復(fù)。處理時間為2011年5月，防治間隔期10天，連續(xù)細噴霧防治3次，用水量為50kg/667m2。第一次施藥前調(diào)查并計算出病情基數(shù)，最后一次防治后10天調(diào)查病情指數(shù)；
(C)黃瓜灰霉病的防治
藥劑處理方法NF0919菌株發(fā)酵液提取物3000倍液，對照藥劑為50%醚菌酯水分散粒劑(江蘇省綠盾植保農(nóng)藥實驗有限公司銷售)3000倍液，空白對照為不防治，小區(qū)面積40 m2,隨機區(qū)組排列，4次重復(fù)。處理時間為2011年4月，防治間隔期10天，連續(xù)細噴霧防治3次，用水量為50kg/667m2。第一次施藥前調(diào)查并計算出病情基數(shù)，最后一次防治后10天調(diào)查病情指數(shù)；
(D)黃瓜枯萎病的防治
藥劑處理方法NF0919菌株發(fā)酵液提取物3000倍液，對照藥劑為50%醚菌酯水分散粒劑(江蘇省綠盾植保農(nóng)藥實驗有限公司銷售)3000倍液，在黃瓜移栽時每棵移栽黃瓜苗灌200ml藥液，空白對照灌清水，40棵苗每小區(qū)，隨機區(qū)組排列，4次重復(fù)。灌根時間在2011年2月，60天后調(diào)查病情指數(shù)。田間防治結(jié)果NF0919菌株發(fā)酵液提取物3000倍液黃瓜白粉病、黃瓜霜霉病、黃瓜灰霉病和黃瓜枯萎病的防治效果分別為97. 18%,96. 68%,92. 00%和80. 23% (表1)，而對照藥劑50%醚菌酯水分散粒劑3000倍液對黃瓜白粉病、黃瓜霜霉病、黃瓜灰霉病和黃瓜枯萎病的防治效果分別為90. 63%,86. 29%,73. 15%和33. 07% (表I)。以上結(jié)果表明，NF0919菌株發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物提取物的田間防治效果顯著高于對照藥劑，NF0919菌株發(fā)酵液提取物對黃瓜多種病害的兼治作用顯著。試驗中所有處理均未發(fā)生藥害現(xiàn)象，表明NF0919菌株發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物使用安全。表I NF0919菌株發(fā)酵液的提取物對黃瓜病害的田間防治試驗結(jié)果
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…霄瓜…_白_粉^
a m 4553 56.32 4724 39,62 4T18 -m________
JJIUai 5_ 58.28 3912 48.64 49—37 -
對照I1fw------
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IB
JiR.枯萎 942 1042 12.45 838 10.22 - m ItlilI
注不同大寫字母表示P < O. 01。
權(quán)利要求
1.黃麻鏈霉菌iStreptomycescorchorusii ) NF0919菌株(該菌種特性見專利ZL201010236886. I)發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物的提取方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的黃麻鏈霉菌NF0919菌株發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物的提取物，在防治黃瓜白粉病、黃瓜霜霉病、黃瓜灰霉病和黃瓜枯萎病上的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求I所述的黃麻鏈霉菌NF0919菌株發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物的提取方法，其特征在于包括以下步驟 (A)菌株的活化與一級種子培養(yǎng)液的培養(yǎng) 將保存的NF0919菌株的斜面在高氏一號培養(yǎng)基上活化，30°C培養(yǎng)10 d，挑取I cm2大小的菌塊接種于50 mL 一級種子培養(yǎng)液中，置于170 rpm搖床上30°C振蕩培養(yǎng)44 48 h,其中所述的50 mL—級種子培養(yǎng)液的成分為可溶性淀粉3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，K2HPO4 O. 2%，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl和K2HPO4含量的單位比例為W/V ； (B)二級種子培養(yǎng)液的培養(yǎng) 將步驟(A)所得一級種子培養(yǎng)液按5%的接種量接入50 mL 二級種子培養(yǎng)液中，170rpm,30 °C搖床上培養(yǎng)48 - 52 h，其中所述的5%的單位比例為V/V ;所述的50 mL 二級種子培養(yǎng)液的成分:馬鈴薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白2. 2%, CaCO3 O. 1%, K2HPO4 O. 05%，MgSO4 O. 05%,淀粉酶O. 01%,馬鈴薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO3、K2HPO4, MgSO4和淀粉酶含量的單位比例為VV； (C)發(fā)酵培養(yǎng)液的培養(yǎng) 將步驟(B)所得二級種子培養(yǎng)液按5%的接種量接種于裝有160 L發(fā)酵培養(yǎng)液的容積為200 L的發(fā)酵罐中，其中所述的5%的單位比例為V/V，設(shè)置發(fā)酵參數(shù)為溶氧100%，消泡齊IJ(XP-100F系列發(fā)酵用有機硅消泡劑)1.6 L，攪拌速度為360 rpm,發(fā)酵溫度為36 V，發(fā)酵時間為72 h，pH 6. 8 7. 2，所述的發(fā)酵培養(yǎng)液的成分為馬鈴薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白.2.6%, K2HPO4 O. 05%, NaCl O. 2%, MgSO4 O. 05%, CaCO3 O. 1%，ρΗ7· 2-7. 4，馬鈴薯淀粉、棉籽蛋白、K2HPO4 ,NaCl、MgSO4和CaCO3含量的單位比例為W/V; (D)NF0919菌株發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物提取方法 把步驟(C)所得發(fā)酵液在10000 rpm離心5 min得上清液，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至2. 0，出現(xiàn)沉淀，再次離心，收集沉淀物，用乙酸乙酯萃取3次，35°C真空干燥得提取物。
全文摘要
本發(fā)明為黃麻鏈霉菌NF0919菌株(其在CGMCC的保藏編號為CGMCCNo.3968，菌種專利號為ZL201010236886.1)發(fā)酵液中活性代謝產(chǎn)物的提取方法。代謝產(chǎn)物能有效防治黃瓜白粉病(Erysiphecichoracearum)、黃瓜霜霉病(Pseudoperonosporacubensis)、黃瓜灰霉病(Botrytiscinerea)和黃瓜枯萎病(Fusariumoxysporum)。
文檔編號A01N63/02GK102870821SQ20121035463
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月23日
發(fā)明者楊敬輝, 陳宏州, 張文文, 莊義慶 申請人:江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所