專利名稱：水稻黑條矮縮病毒室內(nèi)活體保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種水稻黑條矮縮病毒室內(nèi)活體保存方法及其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用，屬于農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
水稻黑條矮縮病毒(Rice black-streaked dwarf virus, RBSDV)屬于呼腸孤病毒科(Reovirdae)斐濟病毒屬(Fi jivirus),是一種由灰飛風(fēng)以持久性不 經(jīng)卵方式傳播的病毒，主要侵染玉米引發(fā)玉米粗縮病和侵染水稻引發(fā)水稻黑條矮縮病，感病植株表現(xiàn)為植株生長受嚴(yán)重抑制矮縮，葉色濃綠，葉片、葉鞘及莖桿上可出現(xiàn)蠟滴狀突起，水稻上后期可形成黑條斑，玉米葉背面有明顯的粗糙感，重病株不抽穗或散粉不良，嚴(yán)重影響玉米、水稻產(chǎn)量。目前RBSDV主要分布于中國、朝鮮、韓國和日本等東亞國家及地區(qū)，我國玉米上1954年在新疆南部和甘肅西部首次發(fā)現(xiàn)、水稻上1963年在浙江省余姚縣首次發(fā)生，后長期在華北、西北、華中、華東等地的玉米上、上世紀(jì)90年代主要在浙江中南部的秈稻上常年發(fā)生危害，并間斷性爆發(fā)。水稻上2007年以來在江蘇、山東各地呈暴發(fā)流行態(tài)勢，目前該病在安徽、江西以及福建北部在內(nèi)的長江流域中東部均有分布，對水稻生產(chǎn)造成了巨大經(jīng)濟損失。據(jù)江蘇省植保站數(shù)據(jù)統(tǒng)計，2007年RBSDV引起的水稻黑條矮縮病在江蘇鹽城、連云港、泰州、淮安、揚州和徐州等地嚴(yán)重發(fā)生，當(dāng)年發(fā)生危害的面積達(dá)2. 05萬hm2，2008年發(fā)展到2. 67萬hm2，絕收田塊達(dá)2000hm2，2009年持續(xù)增長至33. 3萬hm2，嚴(yán)重影響了江蘇等地水稻的安全生產(chǎn)。玉米上2005年以來在河北、山東、山西、江蘇等省的夏玉米區(qū)特別是套播或晚春播、早夏播玉米發(fā)生危害嚴(yán)重。據(jù)統(tǒng)計，2008年山東省發(fā)生面積達(dá)73. 3萬hm2，絕產(chǎn)1.67Rhm2 ;大連市大面積發(fā)生，重病田塊發(fā)病率達(dá)60% -80%，玉米粗縮病成為該區(qū)玉米上的重要病害。病毒病的防治最為理想的方法是選育和利用抗病品種，這一工作的開展需要建立科學(xué)的抗性鑒定方法。由于RBSDV等由昆蟲作為媒介的特殊傳播方式，不能使用病汁液摩擦進(jìn)行直接接種。研究者多采用在病株上飼喂方式獲得攜帶RBSDV的灰飛虱進(jìn)行病毒的接種，而罹病植株往往長勢較差或受環(huán)境影響較大難以長期保存，病株在采集后需盡快飼毒，極大地限制了研究時間。另有報道可使灰飛虱從冷凍病株中獲得RBSDV，但其獲取帶毒灰飛虱的效率與可操作性以及短期內(nèi)獲得大量帶毒灰飛虱的可行性還有待進(jìn)一步檢驗，且每次均需病株作為毒源。以上所述種種因素給圍繞RBSDV開展的抗病品種選育工作和需要RBSDV活體材料進(jìn)行各方面研究的工作帶來了很大的難度。為解決這一技術(shù)瓶頸，發(fā)明人從田間小麥易感染RBSDV而普遍發(fā)生水稻黑條矮縮病的現(xiàn)象中得到啟發(fā)，研究了一種在實驗室內(nèi)可長期活體保存RBSDV的方法，通過多次驗證及連續(xù)循環(huán)試驗證明這一方法可常年不間斷獲得大量高帶毒率灰飛虱，可為水稻抗黑條矮縮病和玉米抗粗縮病的品種選育、病毒提純和血清制備、病毒致病性及其分子機理研究等提供基本的材料和技術(shù)手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種水稻黑條矮縮病毒室內(nèi)活體保存方法。本發(fā)明的原理是以小麥作為毒源寄主，讓攜帶水稻黑條矮縮病毒的灰飛虱成蟲在小麥幼苗上傳毒、后代灰飛虱若蟲從小麥上獲毒，從而可以在室內(nèi)飼養(yǎng)條件下短期內(nèi)獲得大量帶毒灰飛風(fēng)。在上述方法中“攜帶水稻黑條矮縮病毒的灰飛虱成蟲”初次是通過以下手段獲得的。從田間采集的具有植株顯著矮縮、平行于葉脈的短條狀葉片皺折和白色蠟滴狀突起等水稻黑條矮縮病或小麥綠矮病癥狀的新鮮植株，應(yīng)用分子方法檢測其攜帶水稻黑條矮縮病毒而不攜帶水稻條紋病毒，利用剛孵化的無毒灰飛虱若蟲飼喂48h后移入健康水稻苗上過循回期，待灰飛虱長至4-5齡時，取出50頭灰飛虱應(yīng)用免疫學(xué)方法檢測其攜帶水稻黑條矮縮病毒的帶毒率。后期此帶毒灰飛虱成蟲可用本試驗方法獲得。在上述方法中，帶毒灰飛虱的有效接種蟲量為4-6頭/株。 所述用于接種灰飛虱的麥苗需用清水浸種24h，催芽48h，待麥種出現(xiàn)白色芽后播于IOOOml燒杯中，每杯播15粒有效麥種，待麥苗長至2-4葉期時可用于接種。所述孵化的灰飛虱在麥苗上的時間為15-20天，可根據(jù)麥苗實際生長狀況，按常規(guī)方式管理盡量控制其不低于15天，待麥苗長勢較弱時將灰飛虱移入健康水稻苗上過循回期。所述為增加麥苗上孵化灰飛虱的數(shù)量，在接完有毒灰飛虱后以5頭琳的蟲量接入剛羽化無毒灰飛虱雌蟲用于產(chǎn)卵，產(chǎn)卵時間為36h-48h。所述獲得可應(yīng)用于接種鑒定試驗攜帶RBSDV的灰飛虱需通過以下兩種方法確認(rèn)一是從過循回期后的灰飛虱群體中隨機抽取50頭灰飛虱，采用免疫學(xué)方法檢測其是否攜帶RBSDV，若全部或部分?jǐn)y帶RBSDV，則可確認(rèn)其已從麥苗上獲得該病毒。二是從循回期過后的灰飛虱群體中隨機抽取一定數(shù)量的灰飛虱，采用人工接種的方法接種健康小麥，若接種后的麥苗表現(xiàn)出水稻黑條矮縮病癥狀并通過分子手段證實其含有該病毒，則確認(rèn)此灰飛風(fēng)已獲毒。本發(fā)明提供了一種水稻黑條矮縮病毒室內(nèi)活體保存方法，利用其建立的水稻黑條矮縮病和玉米粗縮病的品種抗性鑒定方法有效地克服了灰飛虱從患病植株獲毒其植株難以長期保存的技術(shù)瓶頸，拓寬了品種抗性鑒定時間。同時獲得了進(jìn)行RBSDV研究的動植物材料帶毒灰飛虱和小麥病株，解決了水稻黑條矮縮病毒在室內(nèi)難以持續(xù)活體保存的技術(shù)難題，為該病毒研究提供了可靠材料。這一方法可應(yīng)用于水稻和玉米等品種資源的發(fā)掘鑒定、抗病品種選育和病毒致病性、血清學(xué)鑒定和分子生物學(xué)研究等眾多領(lǐng)域。


圖I為攜帶RBSDV的灰飛虱成蟲接種麥苗示意圖。圖2為麥苗上孵化灰飛虱示意圖。圖3為接種小麥發(fā)病癥狀示意圖(A為感染RBSDV植株，B為健康植株)。圖4為接種RBSDV后小麥的RT-PCR檢測示意圖(MSMarker III;CK+為感染RBSDV植株；CK-為健康植株；1_10為接種小麥植株)。圖5為麥苗上掃出灰飛虱循回期后Dot-ELISA檢測示意圖(+為攜帶RBSDV灰飛SI ；-為健康灰飛風(fēng))
具體實施方法實施例I，水稻黑條矮縮病毒室內(nèi)活體保存方法①攜帶水稻黑條矮縮病毒的新鮮植株獲得。2010年9月于江蘇贛榆縣重病區(qū)采集具有典型“綠矮”癥狀的水稻。參照Trizol (Reagent)說明書方法提取水稻總RNA。根據(jù)已發(fā)表的RBSDV-S5-0RF2序列設(shè)計引物(引物由上海英俊生物技術(shù)公司合成)F 5/ -TAATCAGCGCGATGTCTAC-3'R 5/ -CCCCCGCATCTAAGGAG-3'。米用RT-PCR檢測確定病株是否攜帶水稻黑條矮縮病毒。反轉(zhuǎn)錄按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega)說明書進(jìn)行。PCR擴增體系為cDNA模板3. O μ L，Taq plus酶0.5 μ L，dNTP (每份 IOmmol. L-1)0. 5μ L，10XPCR 緩沖液(含 Mg2+) 2· 5 μ L，5’ 端引物(lOpmol.·L-l)1.0yL，3，端引物(lOpmol. L-l) I. O μ L, ddH20 16. 5 μ L，合計 25 μ L。反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性5min ;94°C變性Imin ;50°C退火Imin ;72°C延伸Imin ；35個循環(huán)；最后72。。延伸10min，4°C保存，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增的目的條帶(800bp)(圖4)。同時采用斑點免疫結(jié)合法(Dot-ELISA)確定病株不攜帶水稻條紋病毒(RSV)。挑選出3株僅含有水稻黑條矮縮病毒的水稻植株飼毒。②無毒灰飛虱的獲得2010年4-5月從江蘇農(nóng)科院小麥田中采集灰飛虱若蟲，在武育粳3號上飼養(yǎng)至成蟲后，將灰飛虱雌蟲單頭置于飼養(yǎng)容器中產(chǎn)卵，取出雌蟲進(jìn)行水稻條紋病毒(RSV)帶毒情況的鑒定，留取無毒蟲的后代再同上法純化一次，所獲后代單雌系或混合群體即為無毒灰飛虱群體。后續(xù)飼養(yǎng)中每代次隨機抽取群體中10%的灰飛虱采用Dot-ELISA法檢測RSV，確保其不帶RSV。為避免傳毒介體污染，每次使用無毒蟲前取60頭Dot-ELISA法檢測RSV和RBSDV (圖5)，確定其為無毒蟲。③初始攜帶RBSDV灰飛虱成蟲的獲得利用剛孵化的無毒灰飛虱若蟲飼喂①述新鮮水稻或小麥病株，48h后移入健康水稻苗上過循回期，待灰飛虱長至5齡或成蟲，取50頭灰飛虱應(yīng)用Dot-ELISA法檢測其RBSDV
帶毒率。④接種麥苗的獲得選用生產(chǎn)上常規(guī)使用的小麥品種均可，推薦品種有揚麥158、揚麥13、揚麥15、鄭麥9023等。清水浸種24h，催芽48h，待麥種露白后播于IOOOml燒杯中，每杯播15粒有效麥種，待麥苗長至2-4葉期時可用于接種。⑤最佳有效接種蟲量的確定設(shè)不接蟲空白對照CK，接無毒蟲(4頭/株)0、1、2、3、4、5、6、7、8頭有效帶毒蟲/株的接種量共十個處理，每個處理4個重復(fù)。將③述灰飛虱成蟲接于④述小麥苗上(圖I)，48h后移走灰飛虱，然后按5頭/株的接蟲量接入②述剛羽化無毒灰飛虱雌蟲，48h后移走。灰飛虱在麥苗上孵化并飼養(yǎng)至2齡左右(視麥苗生長情況決定，從卵出現(xiàn)時算起盡量在麥苗上待15天以上)(圖2)。卵孵化后5-7天每日觀察，根據(jù)觀察結(jié)果決定將灰飛虱移至健康水稻苗上繼續(xù)飼養(yǎng)過循回期。移到水稻苗上之前數(shù)一下總蟲數(shù)，5齡或成蟲時取蟲檢測灰飛虱帶毒率時再數(shù)一下蟲數(shù)計算存活率。灰飛虱移至水稻苗上之后收集麥苗用①述RT-PCR法檢測麥苗病株率(圖3)，剩下苗連根移至盆缽或-20°C保存研究RBSDV備用。由表I可見在有效接種蟲量為4-6頭/株時，灰飛虱的帶毒率在60%以上，其存活率也在80%以上，所以確定最佳有效接種蟲量為4-6頭/株。表I (4個重復(fù)平均值)
權(quán)利要求
1.一種水稻黑條矮縮病毒室內(nèi)活體保存方法，其特征在于將攜帶水稻黑條矮縮病毒的灰飛虱，移到長至一定程度麥苗上48h，移出前述灰飛虱接入剛羽化的無毒灰飛虱雌蟲若干頭，48h后移出接入灰飛虱，待麥苗上孵化的灰飛虱長至2齡左右移至健康水稻苗上常規(guī)飼養(yǎng)至5齡或成蟲，即獲得攜帶水稻黑條矮縮病毒的灰飛虱。將獲得的帶毒灰飛虱重復(fù)上述步驟即可連續(xù)獲得灰飛虱帶毒蟲，實現(xiàn)水稻黑條矮縮病毒室內(nèi)連續(xù)活體保存。
2.I中所述室內(nèi)活體保存方法，其關(guān)鍵在于 1)毒源保存程序中，麥苗為毒源寄主。
2)接入麥苗灰飛虱對RBSDV的帶毒率不低于25%。
3)初始接入灰飛虱時麥苗苗齡為2-4葉期。
4)接入麥苗的對RBSDV帶毒的灰飛虱蟲量為4-6頭/株。
5)麥苗上接入帶毒灰飛虱時間長度為36-48h。
6)無毒灰飛虱雌蟲接入麥苗時間長度為36-48h。
7)灰飛虱飼養(yǎng)溫度為23-27°C。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)室內(nèi)活體保存方法。本發(fā)明原理以小麥作為毒源寄主，讓攜帶RBSDV的灰飛虱成蟲在小麥幼苗上傳毒、后代灰飛虱若蟲從小麥上獲毒，從而在室內(nèi)飼養(yǎng)條件下短期內(nèi)獲得大量帶毒灰飛虱。本方法有效克服了RBSDV室內(nèi)長期大量活體保存的技術(shù)瓶頸，解決了RBSDV毒源難以連續(xù)活體保存、毒源常規(guī)獲取周期長、飼毒植株難以長期提供、飼毒若蟲蟲齡最小化難以操作等一系列技術(shù)難題。獲得的帶毒灰飛虱可隨時支持水稻和玉米品種抗性鑒定，亦可作為RBSDV純化和血清制備材料，解決了常規(guī)提純時材料獲取難、病毒含量低等難題。該發(fā)明應(yīng)用將大大加快RBSDV的研究、開發(fā)與利用。
文檔編號A01G7/00GK102870743SQ201210385208
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月12日
發(fā)明者任春梅, 程兆榜, 周益軍 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院