專利名稱：一種秈稻高效再生及遺傳轉(zhuǎn)化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種秈稻高效再生及遺傳轉(zhuǎn)化的方法。本發(fā)明適用于秈稻成熟胚或幼胚的愈傷組織誘導(dǎo)與再生，以及通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)化。
背景技術(shù)：
水稻是全球最重要的糧食作物之一，秈稻是我國(guó)主要的栽培類型。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，穩(wěn)定性好，且載體容納的外源DNA片段較大，成為水稻轉(zhuǎn)基因的最優(yōu)選擇。該方法通過(guò)將目的基因片段插入農(nóng)桿菌質(zhì)粒上，然后讓愈傷組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，從而由載體將目的基因轉(zhuǎn)移并整合到水稻基因組中。其基本程序包括構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體，建立受體再生體系，導(dǎo)入目的基因，篩選抗性愈傷組織及獲得分化的再生轉(zhuǎn)基因植株等。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良水稻品種已有二十多年的歷史，但轉(zhuǎn)化成功的報(bào)道主要集中在粳稻上，秈稻的再生及遺傳轉(zhuǎn)化難度相對(duì)較大。在最新的相關(guān)研究中(Lin YJ, Zhang Q等，Optimizing the tissue culture conditions for high efficiency transformationof indica rice,PlantCell Rep.，2005，23:540 547 ；Sivakumar P.等,High frequencyplant regeneration frommature seed of elite, recalcitrant Malaysian Indicarice (Oryza sativa L.)CV. MR219, ActaBiological Hungarica, 2010，61(3):313 321 ;Wani S. H.等，An efficient and reproduciblemethod for regeneration of wholeplants from mature seeds of a high yielding Indica rice(Oryza sativa L. ) varietyPAU201, New Biotechnol.，2011，28(4) :418 422)，秈稻遺傳轉(zhuǎn)化仍然存在轉(zhuǎn)化頻率低和基因型限制的技術(shù)瓶頸。目前，有關(guān)秈稻的轉(zhuǎn)基因研究中，只有部分秈稻品種能夠成功獲得轉(zhuǎn)基因植株。大部分秈稻較難分化，其轉(zhuǎn)化周期較長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化效率較低，甚至有些秈稻品種無(wú)法轉(zhuǎn)化成功。其原因主要是缺乏秈稻通用的高效再生體系與遺傳轉(zhuǎn)化方法。針對(duì)秈稻再生及遺傳轉(zhuǎn)化的現(xiàn)狀，我們?cè)敿?xì)研究了培養(yǎng)基的有機(jī)物成分、培養(yǎng)溫度、激素配比、抑菌抗生素的種類與濃度等對(duì)秈稻愈傷組織誘導(dǎo)、繼代增殖和外源基因轉(zhuǎn)化的影響，通過(guò)轉(zhuǎn)化方法的改進(jìn)獲得本發(fā)明，建立了一種秈稻高效再生及遺傳轉(zhuǎn)化的新方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)秈稻現(xiàn)有遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的不足，是在于提供了一種秈稻高效再生及遺傳轉(zhuǎn)化的方法，建立了秈稻再生與轉(zhuǎn)化的操作流程，篩選簡(jiǎn)便，效率較高。提高了秈稻遺傳轉(zhuǎn)化的效率，對(duì)3個(gè)秈稻代表性品種如9311、M5274 (秈型兩系恢復(fù)系)、E09-2076 (秈型三系保持系)進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率均在25%以上。轉(zhuǎn)化過(guò)程中的培養(yǎng)條件除了共培養(yǎng)、第一次篩選階段為26°C外，其余均為32 34°C高溫條件。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)—種秈稻高效再生及遺傳轉(zhuǎn)化的方法，它包括以下步驟
( I)愈傷組織的誘導(dǎo)以秈稻成熟胚或幼胚為外植體，先用75%體積比的酒精浸泡lmin，再用O. 1%質(zhì)量比的氯化汞浸泡10 12min，無(wú)菌水洗滌4 5次，最后將滅過(guò)菌的外植體接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在32-34°C下暗培養(yǎng)20-30天，誘導(dǎo)愈傷組織；(2)愈傷組織的繼代增殖從上述得到的愈傷組織中挑選生長(zhǎng)旺盛的淡黃色顆粒狀愈傷組織轉(zhuǎn)入繼代增殖培養(yǎng)基，置于32 34°C暗培養(yǎng)條件下，繼代培養(yǎng)10 15天；(3)愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)將生長(zhǎng)旺盛、顆粒直徑2 3_的淡黃色愈傷組織塊接種于秈稻愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上，32 34°C暗培養(yǎng)3 5天；(4)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的胚性愈傷轉(zhuǎn)化將YEB平板上生長(zhǎng)的農(nóng)桿菌刮到含有乙酰丁香酮的懸菌培養(yǎng)基里，在菌液吸光度為0D_=0. I O. 5的范圍內(nèi)進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的胚性愈傷轉(zhuǎn)化，將預(yù)培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌工作菌液中，室溫(20 - 25°C，下同)浸泡10 20min ；(5)愈傷組織與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)將侵染后的愈傷組織浙干農(nóng)桿菌菌液，轉(zhuǎn)入無(wú)菌濾紙上，在超凈臺(tái)上晾干30 60min，然后將愈傷組織顆粒挑到秈稻愈傷組織與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，26°C下暗培養(yǎng)2 3天；(6)抗性愈傷組織的篩選將共培養(yǎng)后的愈傷組織用無(wú)菌水洗凈，加入含300 500mg/L特美汀的無(wú)菌水溶液浸泡10 20min，用無(wú)菌濾紙吸干后接入篩選培養(yǎng)基上篩選2次；第一次篩選為26°C下暗培養(yǎng)10 15天；第二次篩選為32 34°C下暗培養(yǎng)15 20天，直到長(zhǎng)出所需的抗性愈傷組織；( 7)抗性愈傷組織的分化將篩選后得到的抗性愈傷組織接入分化培養(yǎng)基，于32 34°C下2000LUX光照培養(yǎng)15 30天，再生綠苗；(8)再生苗的生根將4cm以上的再生苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，32 34°C，2000Lux光照培養(yǎng)15 30天，獲得完整的生根轉(zhuǎn)基因植株。在本發(fā)明中，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基組分為以MS為基本培養(yǎng)基，添加2. 5mg/L 2，4-D, 800mg/L水解酪蛋白，500mg/L谷氨酰胺,500mg/L脯氨酸,30g/L鹿糖,2. 5g/L植物凝膠，PH 為 5. 8 6. O。所述的愈傷繼代增殖培養(yǎng)基的組分如下以MS為基本培養(yǎng)基，添加2. O 3. 5mg/L 2,4-D, O. 05 O. 30mg/L KT，500 800mg/L水解酪蛋白，300 500mg/L谷氨酰胺，300 500mg/L脯氨酸，30g/L蔗糖，2. 5g/L植物凝膠，PH為5. 8 6. O。所述的秈稻愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基的組分如下以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加
2.O 3. 5mg/L 2,4-D, O. 05 O. 30mg/L KT，500 800mg/L 水解酪蛋白，300 500mg/L谷氨酰胺，300 500mg/L脯氨酸,20g/L鹿糖，10g/L葡萄糖,3. 5g/L植物凝膠，100 200uM的乙酰丁香酮，PH為5. 6。
所述的農(nóng)桿菌的懸菌培養(yǎng)基的組分如下以1/2MS為基本培養(yǎng)基,添加2. O
3.5mg/L2，4-D，O. 05 O. 30mg/L KT, 20g/L 蔗糖，10g/L 葡萄糖，100 200uM 的乙酰丁香酮，PH 為 5. 6。所述的秈稻愈傷組織與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)培養(yǎng)基的組分如下以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加 2. O 3. 5mg/L 2,4-D, O. 05 O. 30mg/L KT，500 800mg/L 水解酪蛋白，300 500mg/L谷氨酰胺,300 500mg/L脯氨酸,20g/L鹿糖，10g/L葡萄糖,3. 5g/L植物凝膠，100 200uM的乙酰丁香酮，PH為5. 6。所述的篩選培養(yǎng)基的組分如下以MS為基本培養(yǎng)基，添加2. O 3. 5mg/L 2,4-D,O. 05 O. 30mg/L KT, 500 800mg/L 水解酪蛋白，300 500mg/L 谷氨酰胺，300 500mg/L脯氨酸，30g/L蔗糖，3. Og/L植物凝膠，25 60mg/L潮霉素，300 500mg/L特美汀，PH為
5.8 6. O ;第一次篩選培養(yǎng)基的潮霉素濃度為25 40mg/L,第二次篩選培養(yǎng)基的潮霉素濃度為40 60mg/L。所述的分化培養(yǎng)基的組分如下以MS為基本培養(yǎng)基，添加I. 5 2. 5mg/L BA，O. 5 I. 5mg/L KT, O. 3 O. 8mg/L NAA, 500 800mg/L 水解酪蛋白，300 500mg/L 谷氨酰胺，30g/L蔗糖，2. 5g/L植物凝膠，PH5. 8-6. O。所述的再生苗的生根培養(yǎng)基的組分如下以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加I. Omg/LNAA，O. 2mg/L IBA，30g/L 蔗糖，O. 2g/L 活性炭，6. Og/L 瓊脂，ρΗ6· O。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明具用具有廣泛代表性，對(duì)3個(gè)秈稻代表性品種如9311、Μ5274 (秈型兩系恢復(fù)系)、Ε09-2076 (秈型三系保持系)進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，效率較高，均在25%以上。轉(zhuǎn)化過(guò)程中的培養(yǎng)條件除了共培養(yǎng)、第一次篩選階段為26°C外，其余均為32 34°C高溫條件，愈傷組織生長(zhǎng)速度快，轉(zhuǎn)化周期短(見(jiàn)表I)。以特美汀作為抑菌劑，抑菌效果好，避免了共培養(yǎng)過(guò)程中農(nóng)桿菌的過(guò)度生長(zhǎng)對(duì)愈傷組織的負(fù)面影響(見(jiàn)表2)。優(yōu)化后的激素配比利于愈傷組織的分化成苗，提高了轉(zhuǎn)化效率(見(jiàn)表3)。本發(fā)明方法在秈稻轉(zhuǎn)基因研究和分子育種中具有較好的實(shí)用性和高效性。表I不同培養(yǎng)溫度對(duì)秈稻M5274愈傷繼代的影響
權(quán)利要求
1.一種秈稻高效再生及遺傳轉(zhuǎn)化的方法，其步驟是(O愈傷組織的誘導(dǎo)以秈稻成熟胚或幼胚為外植體，先用75%體積比的酒精浸泡，再用O. 1%質(zhì)量比的氯化萊浸泡10 12min,無(wú)菌水洗漆4 5次,最后將滅過(guò)菌的外植體接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基,在32 34°C下暗培養(yǎng)20 30天，誘導(dǎo)愈傷組織；2)愈傷組織的繼代增殖從上述得到的愈傷組織中挑選生長(zhǎng)旺盛的淡黃色顆粒狀愈傷組織轉(zhuǎn)入繼代增殖培養(yǎng)基，置于32 34°C暗培養(yǎng)條件下，繼代培養(yǎng)10 15天；(3)愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)將生長(zhǎng)旺盛、顆粒直徑2 3_的淡黃色愈傷組織塊接種于秈稻愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上，32 34°C暗培養(yǎng)3 5天；(4)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的胚性愈傷轉(zhuǎn)化將YEB平板上生長(zhǎng)的農(nóng)桿菌刮到含有乙酰丁香酮的農(nóng)桿菌的懸浮培養(yǎng)基里，在菌液吸光度為0D600 = O. I O. 5的范圍內(nèi)進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的胚性愈傷轉(zhuǎn)化，將預(yù)培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌工作菌液中，室溫浸泡10 20min ；(5)愈傷組織與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)將侵染后的愈傷組織浙干農(nóng)桿菌菌液，轉(zhuǎn)入無(wú)菌濾紙上，在超凈臺(tái)上晾干30 60min，然后將愈傷組織顆粒挑到秈稻愈傷組織與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，26°C下暗培養(yǎng)2 3天;(6)抗性愈傷組織的篩選將共培養(yǎng)后的愈傷組織用無(wú)菌水洗凈，加入含300 500mg/L特美汀的無(wú)菌水溶液浸泡10 20min，用無(wú)菌濾紙吸干后接入篩選培養(yǎng)基上篩選2次；第一次篩選為26°C下暗培養(yǎng)10 15天；第二次篩選為32 34°C下暗培養(yǎng)15 20天，直到長(zhǎng)出的抗性愈傷組織；(7)抗性愈傷組織的分化將篩選后得到的抗性愈傷組織接入分化培養(yǎng)基，于32 34°C下2000LUX光照培養(yǎng).15 30天，再生綠苗；(8)再生苗的生根將4cm以上的再生苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，32 34°C，2000Lux光照培養(yǎng)15 30天，獲得完整的生根轉(zhuǎn)基因植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種秈稻高效再生及遺傳轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基組分為=MS +2. 5mg/L 2，4_D+800mg/L水解酪蛋白+500mg/L谷氨酰胺+500mg/L脯氨酸+30g/L蔗糖+2. 5g/L植物凝膠、PH為5. 8 6. O。
3.根據(jù)權(quán)利要求I的一種秈稻高效再生及遺傳轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于所述的繼代增殖培養(yǎng)基的組分如下以MS為基本培養(yǎng)基，添加2. O 3. 5mg/L 2，4-D，O. 05 O. 30mg/L KT, 500 800mg/L水解酪蛋白，300 500mg/L谷氨酰胺，300 500mg/L脯氨酸，30g/L蔗糖，2. 5g/L植物凝膠，PH為5. 8 6. O。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種秈稻高效再生及遺傳轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于所述的秈稻愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基的組分如下以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，添加2. O 3. 5mg/L.2,4- ,Ο. 05 O. 30mg/L KT, 500 800mg/L 水解酪蛋白，300 500mg/L 谷氨酰胺，300 500mg/L脯氨酸,20g/L鹿糖，10g/L葡萄糖,3. 5g/L植物凝膠，100 200uM的乙酰丁香酮，PH 為 5. 6。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種秈稻高效再生及遺傳轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于所述的農(nóng)桿菌的懸菌培養(yǎng)基的組分如下以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，添加2. O 3. 5mg/L 2，4_D，.O. 05 O. 30mg/L KT, 20g/L 蔗糖，10g/L 葡萄糖，100 200uM 的乙酰丁香酮，PH 為 5. 6。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種秈稻高效再生及遺傳轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于所述的秈稻愈傷組織與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)培養(yǎng)基的組分如下以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，添加2. O .3.5mg/L 2,4- ,Ο. 05 O. 30mg/L KT, 500 800mg/L 水解酪蛋白，300 500mg/L 谷氨酰胺,300 500mg/L月甫氨酸，20g/L鹿糖，10g/L葡萄糖，3. 5g/L植物凝膠，100 200uM的乙酰丁香酮，PH為5. 6。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種秈稻高效再生及遺傳轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于所述的篩選培養(yǎng)基的組分如下以MS為培養(yǎng)基，添加2. O 3. 5mg/L 2，4-D，O. 05 O. 30mg/L KT, 500 800mg/L水解酪蛋白，300 500mg/L谷氨酰胺，300 500mg/L脯氨酸，30g/L蔗糖，3. Og/L植物凝膠，25 60mg/L潮霉素，300 500mg/L特美汀，PH為5. 8 6. O ;第一次篩選培養(yǎng)基的潮霉素濃度為25 40mg/L,第二次篩選培養(yǎng)基的潮霉素濃度為40 60mg/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種秈稻高效再生及遺傳轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于所述的分化培養(yǎng)基的組分如下以MS為培養(yǎng)基，添加I. 5 2. 5mg/L BA, O. 5 I. 5 mg/L KT,.O. 3 O. 8 mg/L NAA，500 800mg/L水解酪蛋白，300 500mg/L谷氨酰胺，30g/L蔗糖，.2.5g/L 植物凝膠，PH5. 8-6. O。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種秈稻高效再生及遺傳轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于所述的生根培養(yǎng)基的組分如下:以1/2 MS為培養(yǎng)基，添加1.0mg/L NAA, 0. 2mg/L IBA，30g/L蔗糖，.0. 2g/L 活性炭，6. 0g/L 瓊脂，ρΗ6· O。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種秈稻高效再生及遺傳轉(zhuǎn)化的方法，步驟:(1)愈傷組織的誘導(dǎo)以秈稻成熟胚或幼胚為外植體；(2)愈傷組織的繼代增殖挑選淡黃色顆粒狀愈傷組織轉(zhuǎn)入繼代增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)；(3)愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)；(4)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的胚性愈傷轉(zhuǎn)化將預(yù)培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌工作菌液中，室溫浸泡；(5)愈傷組織與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)；(6)抗性愈傷組織的篩選將共培養(yǎng)后的愈傷組織進(jìn)行篩選，長(zhǎng)出新的抗性愈傷組織；(7)抗性愈傷組織的分化將篩選后的抗性愈傷組織接入分化培養(yǎng)基；(8)再生苗的生根獲得生根轉(zhuǎn)基因植株。篩選簡(jiǎn)便，效率高。提高了秈稻遺傳轉(zhuǎn)化的效率，對(duì)3個(gè)秈稻代表性品種進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率均在25%以上。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102943090SQ201210403168
公開(kāi)日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2012年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月19日
發(fā)明者向發(fā)云, 李三和, 游艾青, 顧玉成, 韓光明, 陳志軍, 周雷, 劉凱, 楊國(guó)才 申請(qǐng)人:湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院