專利名稱：刺參體內(nèi)寄生性后口蟲液體培養(yǎng)基制備及培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于海水養(yǎng)殖動物疾病防控領(lǐng)域，具體地涉及一種刺參體內(nèi)寄生性后口蟲液體培養(yǎng)基制備及培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
刺參(Apostichopus japonicus)是我國海參中經(jīng)濟價值最高的品種,其地理分布為我國遼東半島和山東半島、俄羅斯東部、日本和韓國沿海。2010年全國海參增養(yǎng)殖面積約15萬公頃，產(chǎn)量13萬噸，產(chǎn)值超過200億元，成為我國海水養(yǎng)殖單品種產(chǎn)值最高的種類之一，在沿海漁業(yè)經(jīng)濟中的地位舉足輕重。然而，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，刺參病害發(fā)生頻繁，每年造成30多億元的經(jīng)濟損失，病害問題已經(jīng)直接影響到養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。已經(jīng)報道的刺參主要疾病有細(xì)菌病、病毒·病和寄生蟲病三大類。在寄生性疾病中，一種寄生在刺參體內(nèi)呼吸樹上的后口蟲能夠引起刺參的排臟反應(yīng)，嚴(yán)重感染的刺參排臟后喪失攝食能力，參體消瘦，活力減弱，容易由其它病原引起繼發(fā)性感染，該病被稱為刺參后口蟲病。研究該后口蟲的體外活體培養(yǎng)方法是篩選防治藥物的前提。由于該蟲在動物呼吸器官寄生的獨特習(xí)性，采用常規(guī)的動物組織粉碎制備培養(yǎng)基方法難以實現(xiàn)蟲體的體外長期活體培養(yǎng)。在本發(fā)明形成之前，國內(nèi)外關(guān)于刺參纖毛蟲病的報道主要集中在流行病學(xué)、病原分類學(xué)和組織病理學(xué)等方面的研究上，但未檢索到刺參體內(nèi)寄生性后口蟲體外液體培養(yǎng)基制備及培養(yǎng)方法的詳細(xì)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種刺參體內(nèi)寄生性后口蟲液體培養(yǎng)基制備及培養(yǎng)方法，從而解決其體外存活時間短，難于研究其生活史和篩選防治藥物的技術(shù)難題。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種刺參體內(nèi)寄生性后口蟲液體培養(yǎng)基制備方法，具體步驟如下在海水中加入乙二胺四乙酸(EDTA)，EDTA的終濃度為10_7 10_5mOl/L，再將添加過EDTA的海水煮沸滅菌15 30min，冷卻至3°C 10°C后加入新鮮的刺參體腔液，體腔液和滅菌海水按體積配比為I :50(Tl 1000ο配置好的培養(yǎng)基可以在4°C條件下保存2天。一種刺參體內(nèi)寄生性后口蟲培養(yǎng)方法，具體步驟如下(I)用冷卻至3°C 10°c的滅菌海水沖洗帶有刺參后口蟲的組織至滅菌的玻璃培養(yǎng)皿中；(2)在倒置顯微鏡下吸取5(Γ100只后口蟲蟲體至裝有2(T50ml上述方法制備的刺參體內(nèi)寄生性后口蟲液體培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)皿中，然后加入新鮮刺參呼吸樹組織塊，保持玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)液體培養(yǎng)基的溫度在3°C 10°C，日溫度變化小于等于5°C，鹽度25 30 ；pH8 9 ;光照強度彡20 μ mol/(m2/s);溶解氧彡4mg/L ；
(3)每隔24h從上述培養(yǎng)寄生性后口蟲的玻璃培養(yǎng)皿中吸出l(T25ml上述加入的刺參體內(nèi)寄生性后口蟲液體培養(yǎng)基和上述加入的呼吸樹組織塊，吸出后的液體培養(yǎng)基和組織在倒置顯微鏡下觀察是否有后口蟲被吸出，如有則用吸管反吸回原培養(yǎng)皿中，然后加入l(T25ml新的刺參體內(nèi)寄生性后口蟲液體培養(yǎng)基和新鮮的刺參呼吸樹組織塊。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果I、確定了適合刺參后口蟲體外培養(yǎng)的條件,大大提高了后口蟲體外的成活率和存活時間。2、培養(yǎng)基的制備方法簡單，成本低廉。3、后口蟲的體外培養(yǎng)時間可以達到60天，顯著超過其他盾纖毛蟲的30天體外培養(yǎng)時間的報道。4、本培養(yǎng)基還可以擴展應(yīng)用于刺參其他寄生性纖毛蟲的培養(yǎng)。
具體實施例方式下面通過實施實例詳細(xì)敘述本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，但本發(fā)明的保護范圍不受實施例任何形式上的限制。實施例I :一種刺參體內(nèi)寄生性后口蟲液體培養(yǎng)基制備，具體步驟如下在海水中加入乙二胺四乙酸(EDTA)，EDTA的終濃度為I(TmoI/L，再將添加過EDTA的海水煮沸滅菌15min，冷卻至TC后加入新鮮的刺參體腔液，體腔液和滅菌海水按體積配比為1 :500。配置好的培養(yǎng)基可以在4°C條件下保存2天備用。2010年11月，山東膠南某刺參養(yǎng)殖場的刺參發(fā)生后口蟲病，將患病的刺參放置于加冰的泡沫箱中運回中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所(青島)進行蟲體的體外培養(yǎng)。用冷卻至4°C的滅菌海水沖洗帶有刺參后口蟲的呼吸樹組織至滅菌的玻璃培養(yǎng)皿中；在倒置顯微鏡下(20X物鏡鏡頭，IOX g鏡鏡頭)吸取50只后口蟲蟲體至裝有20ml上述方法制備的后口蟲液體培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)皿中，然后加入長度為12cm的新鮮刺參呼吸樹組織塊，保持鹽度30 ；pH8 ;光照強度彡20 μ mol/(m2/s);溶解氧彡4mg/L ;每隔24h吸出IOml上述加入的后口蟲液體培養(yǎng)基和上述添加的呼吸樹組織塊，在倒置顯微鏡下觀察吸出后的液體培養(yǎng)基和組織塊是否有后口蟲被吸出，如有則用吸管反吸回原培養(yǎng)皿中，然后加入IOml新的后口蟲液體培養(yǎng)基和長度為12cm新鮮的呼吸樹組織塊，每隔15天在倒置顯微鏡下計數(shù)一次，共進行了 60天，計數(shù)結(jié)果見表I。表I刺參后口蟲的培養(yǎng)計數(shù)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種刺參體內(nèi)寄生性后口蟲液體培養(yǎng)基制備方法，其特征在于具體步驟如下在海水中加入EDTA，EDTA的終濃度為10_7 10_5mOl/L，再將添加過EDTA的海水煮沸滅菌15 30min，冷卻至3°C 10°C后加入新鮮的刺參體腔液，體腔液和滅菌海水按體積配比為I :500 1 1000o
2.一種刺參體內(nèi)寄生性后口蟲培養(yǎng)方法，其特征在于具體步驟如下 (1)用冷卻至3°C 10°C的滅菌海水沖洗帶有刺參后口蟲的組織至滅菌的玻璃培養(yǎng)皿中； (2)在倒置顯微鏡下吸取5(Γ100只后口蟲蟲體至裝有2(T50ml權(quán)利要求I所述方法制備的刺參體內(nèi)寄生性后口蟲液體培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)皿中，然后加入新鮮刺參呼吸樹組織塊，保持玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)液體培養(yǎng)基的溫度在3°C 10°C，日溫度變化小于等于5°C，鹽度25 30 ;pH8 9 ;光照強度彡20 μ mol/(m2/s);溶解氧彡4mg/L ； (3)每隔24h從上述培養(yǎng)寄生性后口蟲的玻璃培養(yǎng)皿中吸出l(T25ml上述加入的刺參體內(nèi)寄生性后口蟲液體培養(yǎng)基和上述加入的呼吸樹組織塊，在倒置顯微鏡下觀察吸出后的液體培養(yǎng)基和組織塊是否有后口蟲被吸出，如有則用吸管反吸回原培養(yǎng)皿中，然后加入l(T25ml新的刺參體內(nèi)寄生性后口蟲液體培養(yǎng)基和新鮮的刺參呼吸樹組織塊。
全文摘要
一種刺參體內(nèi)寄生性后口蟲液體培養(yǎng)基制備，屬于海水養(yǎng)殖動物疾病防控領(lǐng)域，具體步驟如下在海水中加入乙二胺四乙酸(EDTA)，EDTA的終濃度為10-7～10-5mol/L，再將添加過EDTA的海水煮沸滅菌15～30min，冷卻至3℃～10℃后加入新鮮的刺參體腔液，體腔液和滅菌海水按體積配比為1500～11000。利用本發(fā)明的培養(yǎng)基對刺參體內(nèi)寄生性后口蟲進行體外培養(yǎng)時間可以達到60天，解決了后口蟲體外存活時間短，難于研究其生活史和篩選防治藥物的技術(shù)難題。
文檔編號A01K67/033GK102907377SQ201210411330
公開日2013年2月6日 申請日期2012年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月25日
發(fā)明者榮小軍, 李彬, 廖梅杰, 王印庚, 王嵐 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所