專利名稱：水稻鹽脅迫相關(guān)基因sidp361及其編碼蛋白與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水稻基因，特別涉及水稻耐鹽抗性相關(guān)基因SIDP361及其編碼蛋白與
應(yīng)用。
背景技術(shù)：
農(nóng)業(yè)生產(chǎn)是在自然環(huán)境中進(jìn)行的“開放式”的大生產(chǎn)，經(jīng)常會(huì)遇到不良的環(huán)境條件，當(dāng)土壤中鹽堿成分過多時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生鹽害。鹽害是限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個(gè)重要因素。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全世界約20%的耕地受到鹽害威脅，我國約有I. 4億畝鹽堿化耕地，主要分布在東北、華北、西北內(nèi)陸地區(qū)以及長江以北的沿海地區(qū)。隨著我國人口的劇增、耕地日趨減少和淡水資源不足等原因，次生鹽堿化土壤面積還在繼續(xù)擴(kuò)大，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成重大損失。水稻是人類賴以生存的主要糧食作物之一，全世界約有50%的人口以稻米為主要食物來源，在我國更高達(dá)65%。各種脅迫中，干旱和鹽堿是影響水稻生長和產(chǎn)量的主要的環(huán)境因子。解決這一問題的一個(gè)重要途徑就是改良水稻的抗逆性，提高其對非生物逆境的適應(yīng)性，從而減少產(chǎn)量損失，擴(kuò)大水稻種植范圍。在植物中，通過增強(qiáng)或者干擾某個(gè)或某些相關(guān)基因，尤其是抗性相關(guān)基因的表達(dá)可以影響植物對逆境的抗性。超量表達(dá)某個(gè)基因在植物抗逆改良應(yīng)用的報(bào)道很多，在水稻中，超量表達(dá)受低溫和高鹽誘導(dǎo)的Os⑶PK7 (鈣離子依賴型蛋白質(zhì)激酶)基因使轉(zhuǎn)基因水稻對低溫、干旱和鹽脅迫的耐性增強(qiáng)，并且Os⑶PK7表達(dá)量越高的基因水稻對脅迫的耐性就越強(qiáng)；0s⑶PK7的超量表達(dá)還能加強(qiáng)鹽脅迫條件下salT、rabl6A等應(yīng)答基因的誘導(dǎo)(I、SaijoY, Hata S, Kyozuka J, Shimamoto K, Izui K. Overexpression ofa single Ca2+_dependent potein kinase confers both cold and salt/droughttolerance on riee plants[J]. Plant J, 2000，23:319-327 ;2、Sai jo Y, KinoshitaN, Ishiyama K,Hata S,Kyozuka J,HayakawaT, NakamuraT,Shimamoto K,YamayaT,Izui K. A Ca2+-dependent protein kinase that endows rice plants withcold-and salt-stress tolerance functions in vascular bundles [J]. Plant CellPhysiol, 2001, 42:1228-1233.)。有研究報(bào)道，分別超量表達(dá) SNAC1、SNAC2 或 NAC6 (轉(zhuǎn)錄因子)基因都能提高轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性和抗鹽性，基因芯片分析，超量表達(dá)這些轉(zhuǎn)錄因子的水稻中，許多脅迫相關(guān)基因的表達(dá)都明顯的上調(diào)(3、Honghong Hu. Overexpressinga NAM, ATAF, and CUC(NAC) transcription factor enhances droug-ht resistance andsalt tolerance in rice[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2006，103(35):12987-12992 ;
4、HonghongHu, Jun You, Yujie Fang, Xiaoyi Zhu;Zhuyun Qi,Lizhong Xiong.Characterization of transcription factor gene SNA C2conferring cold andsalt tolerance in rice[J]. Plant Molecular Biology, 2008, 67(1-2):169-181 ；
5、KazuoNakashima, Lam—Son P. Tran,Dong Van Nguyen, Miki Fujita, KyonoshinMaruyama, Daisuke Todaka, Yusuke Ito, Nagao Hayashi, Kazuo Shinozaki, KazukoYamaguchi-Shinozaki. Functional analysis of a NAC—type transcription factorOsNAC6involved in abiotic and biotic stress-responsive gene expression inrice [J], The Plant Journal, 2007, 51 (4) :617-630. ) 另有研究表明在水稻中超量表達(dá)P5CS (Λ’ - 二氫吡咯啉-5-羧酸合成酶)基因，轉(zhuǎn)基因植株中的脯氨酸含量明顯提高，而且耐鹽性也顯著增強(qiáng)(6、IGARASHI Y, Y0SHIBA Y, SANADA Y. Characterization ofthe gene forΔ1-pyrroline-5—carboxylate synthetase and correlation betweentheexpression of the gene and salt tolerance in Oryza sativa L[J]. Plant MolBiol, 1997, 33(5) :857-865.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的在于提供水稻鹽脅迫相關(guān)基因SIDP361。本發(fā)明的第二目的在于提供水稻鹽脅迫相關(guān)基因SIDP361編碼的蛋白。本發(fā)明的第三目的在于提供水稻鹽脅迫相關(guān)基因SIDP361在培育耐鹽抗性增強(qiáng)·的水稻中的應(yīng)用。所述水稻鹽脅迫相關(guān)基因SIDP361的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No 1所
/Jn ο所述水稻鹽脅迫相關(guān)基因SIDP361編碼的蛋白的氨基酸序列如序列表中的SEQ IDNo 2所示。所述水稻鹽脅迫相關(guān)基因SIDP361可用于提高水稻對鹽脅迫的抗性，培育耐鹽抗性增強(qiáng)的水稻。所述培育耐鹽抗性增強(qiáng)的水稻可采用如下方法構(gòu)建水稻鹽脅迫相關(guān)基因SIDP361的超量表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化到水稻，篩選獲得耐鹽抗性增強(qiáng)的水稻。所述表達(dá)載體可為Ti類質(zhì)粒載體；所述轉(zhuǎn)化可采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法或基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法等，優(yōu)選農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法。在鹽脅迫條件下，本發(fā)明中的水稻鹽脅迫相關(guān)基因SIDP361的超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株株系的生物量和株高平均值顯著高于對照，表明該基因的超量表達(dá)能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因水稻對鹽脅迫的抗性。本發(fā)明為培育耐鹽抗性增強(qiáng)的水稻提供了一條重要途徑。而生產(chǎn)上栽培耐鹽抗性增強(qiáng)的水稻，對有效利用鹽堿土地、增加糧食產(chǎn)量等具有重要意義。


圖I為本發(fā)明實(shí)施例中SIDP361基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株的PCR檢測電泳圖(擴(kuò)增Hyg基因1421bp片段)。在圖I中，M為DL 2000DNA Marker，編號I以野生型水稻植株DNA為模板擴(kuò)增，編號2以陽性質(zhì)粒DNA為模板擴(kuò)增，編號3 8以轉(zhuǎn)基因水稻植株DNA為模板擴(kuò)增。根據(jù)最終表達(dá)載體PH7WG2上潮霉素Hyg基因序列設(shè)計(jì)引物，用于轉(zhuǎn)基因植株的鑒定。圖2為本發(fā)明實(shí)施例中SIDP361基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株的PCR檢測電泳圖(啟動(dòng)子P35S的942bp片段)。在圖2中，M為DL 2000DNA Marker，編號I以野生型水稻植株DNA為模板擴(kuò)增，編號2以陽性質(zhì)粒DNA為模板擴(kuò)增，編號3 8以轉(zhuǎn)基因水稻植株DNA為模板擴(kuò)增。根據(jù)最終表達(dá)載體PH7WG2上P35S啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)引物，用于轉(zhuǎn)基因植株的鑒定。圖3為SIDP361基因在T1代超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株中的相對表達(dá)水平。在圖3中，橫坐標(biāo)為不同水稻植株，其中WT為野生型水稻植株，SI和S2分別為Tl代SIDP361基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株株系；縱坐標(biāo)為SIDP361基因相對表達(dá)水平，柱形圖上的豎線代表3個(gè)技術(shù)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差，“**”表示SIDP361基因在超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株與野生型植株之間表達(dá)水平存在極顯著差異(P〈0. 01)。圖4為Tl代SIDP361基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株在Ommol/L，200mmol/L NaCl處理12天后株高平均值。圖5為Tl代SIDP361基因超量表達(dá)野生型水稻植株在Ommol/L，200mmol/L NaCl處理12天后生物量平均值。在圖4和圖5中，WT為野生型水稻植株，SI和S2分別Tl代SIDP361基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株株系，柱形圖代表生物量或株高的平均值，其上豎線代表標(biāo)準(zhǔn)誤差，
表示SIDP361基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株與野生型植株之間的生物量或株高平均值存在極顯著差異(P〈0. 01)。圖6為鹽處理2天后，兩個(gè)Tl代超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株與野生型植株的脯氨酸含量對比圖。在圖6中，WT為野生型水稻植株，SI和S2為SIDP361基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株株系，柱形圖代表脯氨酸平均含量，其上豎線代表標(biāo)準(zhǔn)誤；“**”表示SIDP361基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系與野生型植株之間的脯氨酸平均含量存在極顯著差異(P〈0. 01)。圖7為Tl代SIDP361基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株和野生型水稻植株在200mmol/LNaCl處理O小時(shí)(橫坐標(biāo)中的unstressed)、3小時(shí)(橫坐標(biāo)中的salt stressed)后體內(nèi)脅迫相關(guān)基因(P5CS ( Δ ^pyrroline-S-carboxylate synthetase, Δ 卩比咯啉-5-羧酸合成酶基因))的相對表達(dá)量。圖8為Tl代SIDP361基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株和野生型水稻植株在200mmol/LNaCl處理O小時(shí)(橫坐標(biāo)中的unstressed)、3小時(shí)(橫坐標(biāo)中的salt stressed)后體內(nèi)脅迫相關(guān)基因(NCED3 (9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase, 9_順式-環(huán)氧類胡蘿
卜素雙加氧酶基因))的相對表達(dá)量。圖9為Tl代SIDP361基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株和野生型水稻植株在200mmol/LNaCl處理O小時(shí)(橫坐標(biāo)中的unstressed)、3小時(shí)(橫坐標(biāo)中的salt stressed)后體內(nèi)脅迫相關(guān)基因(DSM2 ( β-Carotene Hydroxylase gene, β胡蘿卜素輕化酶基因))的
相對表達(dá)量。圖10為Tl代SIDP361基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株和野生型水稻植株在200mmol/LNaCl處理O小時(shí)(橫坐標(biāo)中的unstressed)、3小時(shí)(橫坐標(biāo)中的salt stressed)后體內(nèi)脅迫相關(guān)基因(NAC5 (NAC transcription factor gene, NAC轉(zhuǎn)錄因子基因))的相
對表達(dá)量。圖11為Tl代SIDP361基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株和野生型水稻植株在200mmol/LNaCl處理O小時(shí)(橫坐標(biāo)中的unstressed)、3小時(shí)(橫坐標(biāo)中的salt stressed)后體內(nèi)脅迫相關(guān)基因(SNAC1 (stress-responsive NAC transcription factor lgene,脅迫響應(yīng)的NAC轉(zhuǎn)錄因子基因))的相對表達(dá)量。圖12為Tl代SIDP361基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株和野生型水稻植株在200mmol/LNaCl處理O小時(shí)(橫坐標(biāo)中的unstressed)、3小時(shí)(橫坐標(biāo)中的salt stressed)后體內(nèi)脅迫相關(guān)基因(SNAC2 (stress-responsive NAC transcription factor 2gene,脅迫響應(yīng)的NAC轉(zhuǎn)錄因子基因))的相對表達(dá)量。圖13為Tl代SIDP361基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株和野生型水稻植株在200mmol/LNaCl處理O小時(shí)(橫坐標(biāo)中的unstressed)、3小時(shí)(橫坐標(biāo)中的salt stressed)后體內(nèi)脅迫相關(guān)基因(DREBIA(dehydration responsive element binding protein IAgene,脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白IA基因))的相對表達(dá)量。圖14為Tl代SIDP361基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株和野生型水稻植株在200mmol/LNaCl處理O小時(shí)(橫坐標(biāo)中的unstressed)、3小時(shí)(橫坐標(biāo)中的salt stressed)后體內(nèi)脅迫相關(guān)基因(DREB2A(dehydration responsive element binding protein 2Agene,脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白2A基因))的相對表達(dá)量。
圖15為Tl代SIDP361基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株和野生型水稻植株在200mmol/LNaCl處理O小時(shí)(橫坐標(biāo)中的unstressed)、3小時(shí)(橫坐標(biāo)中的salt stressed)后體內(nèi)脅迫相關(guān)基因(LEA3 (late embryogenesis abundant protein gene,晚期胚胎富集蛋白基因))的相對表達(dá)量。圖16為Tl代SIDP361基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株和野生型水稻植株在200mmol/LNaCl處理O小時(shí)(橫坐標(biāo)中的unstressed)、3小時(shí)(橫坐標(biāo)中的salt stressed)后體內(nèi)脅迫相關(guān)基因(LEA3-1 (late embryogenesis abundant protein gene,晚期胚胎富集蛋白基因))的相對表達(dá)量。圖17為Tl代SIDP361基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株和野生型水稻植株在200mmol/LNaCl處理O小時(shí)(橫坐標(biāo)中的unstressed)、3小時(shí)(橫坐標(biāo)中的salt stressed)后體內(nèi)脅迫相關(guān)基因(Rabl6a(abscisic acid-responsive rice gene,脫落酸應(yīng)答基因))的相對表達(dá)量。圖18為Tl代SIDP361基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株和野生型水稻植株在200mmol/LNaCl處理O小時(shí)(橫坐標(biāo)中的unstressed)、3小時(shí)(橫坐標(biāo)中的salt stressed)后體內(nèi)脅迫相關(guān)基因(Rabl6b (abscisic acid-responsive rice gene,脫落酸應(yīng)答基因))的相對表達(dá)量。在圖7 18中，WT為野生型水稻植株，SI和S2分別Tl代SIDP361基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株株系，標(biāo)記柱形代表脅迫相關(guān)基因的平均表達(dá)量，其上豎線代表標(biāo)準(zhǔn)誤差，
表示SIDP361基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株與野生型植株之間脅迫相關(guān)基因平均表達(dá)量存在顯著差異(P〈0. 05)?！?*”表示SIDP361基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株與野生型植株之間脅迫相關(guān)基因平均表達(dá)量存在極顯著差異(P〈0. 01)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例將對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明實(shí)施例I水稻鹽脅迫相關(guān)基因SIDP361的獲得與超量表達(dá)載體的構(gòu)建通過生物信息學(xué)分析從植物中鑒定出了一類新的未知功能的基因家族DUF1644，該家族有可能作為一類新的轉(zhuǎn)錄因子，在水稻的脅迫應(yīng)答中發(fā)揮了重要的作用。但是，DUF1644家族基因與抗逆的關(guān)系目前尚未有任何報(bào)道?；騍IDP361是水稻DUF1644基因家族的成員之一。根據(jù)SIDP361基因cDNA核酸序列，合成一對引物SIDP361-S和SIDP361-A SIDP361-S :5’CACCATGCCAAAGGACAGGAGC 3’SIDP361-A :5’TCAATGTGCAGGATCACCA 3’其中正向引物SIDP361-S中引入TOPO克隆識別位點(diǎn)，以便用TOPO克隆方法將基因DNA片斷克隆于pENTR/D-TOPO載體上。用上述引物，并以水稻葉片cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以獲得SIDP361基因cDNA片斷。PCR 的擴(kuò)增條件為 95°C預(yù)變性 5min ;95°C變性 30s，63°C退火 30s，72°C 60s, 30 個(gè) 循環(huán)；72°C延伸7min。回收目標(biāo)981bp cDNA 片斷，按照 pENTR Directional TOPO Cloning Kits(購自Invitrogen，USA)試劑盒的操作說明將此DNA片斷克隆于pENTR/D-T0P0載體上，挑選陽性重組克隆進(jìn)行測序，將測序結(jié)果正確的陽性克隆命名為T0P0-GL-SIDP361 ;提取T0P0-GL-SIDP361 和超量表達(dá)載體 pH7WG2 質(zhì)粒 DNA，取 50ng 的 T0P0-GL-SIDP361 和 IOOng的 pH7WG2 質(zhì)粒 DNA,參考 Gateway LR clonase II Enzyme Mix (Invitrogen, USA)操作說明書配制反應(yīng)體系，通過Gateway LR重組反應(yīng)將SIDP361基因981bp的cDNA片斷連接于超量表達(dá)盒中。pH7WG2表達(dá)載體資料參見文獻(xiàn)(Karimi, M. , Inze, D. , Depicker, A.,Gateway vectors for Agobacterium—mediated plant transformation. Trends PlantSci. 2002May;7(5) :193-195.)。用SIDP361-S和SIDP361-A引物進(jìn)行菌落PCR鑒定篩選陽性重組克隆，并將陽性重組克隆命名為PH7WG2-SIDP361 ;取I μ g pH7WG2_SIDP361質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105 ；菌落PCR鑒定抗性平板上的農(nóng)桿菌克隆，可得到陽性農(nóng)桿菌克隆，向其菌液中加入20%甘油，保存于_80°C備用。實(shí)施例2水稻鹽脅迫相關(guān)基因SIDP361基因超量表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻及PCR檢測鑒
定農(nóng)桿菌懸浮液的配制取20 μ L含pH7WG2-SIDP361質(zhì)粒的農(nóng)桿菌甘油保存液，接種于IOmL LB (含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平)中，28°C振蕩培養(yǎng)過夜，離心收集菌體，用適當(dāng)體積AAM培養(yǎng)液重懸,使農(nóng)桿菌懸浮液OD6tltl值在0. 3 I之間,最后加入乙酰丁香酮使之最終濃度達(dá)到50mg/L。取臺北309成熟種子，脫殼后，用體積比例為1/3的次氯酸鈉溶液(活性氯約為3%)，表面消毒30min，用無菌水清洗2 5遍；在無菌濾紙上晾干后，接種于NBD的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在28°C黑暗的條件下誘導(dǎo)愈傷組織，2周后將愈傷組織在新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)。取新鮮生長旺盛的愈傷組織，浸泡在農(nóng)桿菌懸浮液中，靜置30min，倒去農(nóng)桿菌懸浮液，將愈傷組織置于無菌濾紙上晾干，然后轉(zhuǎn)移到NBD-AS共培養(yǎng)培養(yǎng)基上(加50mg/L乙酰丁香酮，并預(yù)先在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上墊一張無菌濾紙)，接著置于19 23°C黑暗條件下共培養(yǎng)3天。3天后，將共培養(yǎng)愈傷組織取出，用無菌水洗凈農(nóng)桿菌，并置于無菌濾紙上晾干，然后轉(zhuǎn)移到NBD-S篩選培養(yǎng)基(加50mg/L潮霉素和400mg/L羧芐青霉素)上，于28°C黑暗條件下培養(yǎng)若干周，期間大部分愈傷組織逐漸褐化，少部分愈傷組織可以長出淡黃色、松散的生長較旺盛的新鮮抗性愈傷組織。將此抗性愈傷組織在篩選培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)I周后，轉(zhuǎn)移至MS-R分化培養(yǎng)基上，進(jìn)行分化培養(yǎng)，抗性愈傷組織在2周左右可以開始分化出綠色的再生苗，分化的再生苗繼續(xù)在MS-HF生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待根基本長成，可移栽到營養(yǎng)土中，隨后移栽至田間。其中所述AAM培養(yǎng)液、NBD-AS共培養(yǎng)培養(yǎng)基、NBD-S篩選培養(yǎng)基、MS-R分化培養(yǎng)基和MS-HF生根培養(yǎng)基配方可參考文獻(xiàn)(Nishimura，A.，I.Aichi, et al. (2006) · 〃A protocol for Agrobacterium-mediated transformation inrice. "Nature Protocols I (6):2796-2802)。分別取上述轉(zhuǎn)化苗的葉片，提取基因組DNA，并以基因組DNA為模板，用以下2對特異引物Hyg-S/A和P35S-S/A進(jìn)行PCR檢測Hyg-S :5’TATGATAATCATCGCAAGAC 3’Hyg-A :5’ TTCAAAAGTCGCCTAAGGTC 3’·
P35S-S :5’CTCCAAATGAAATGAACTTCCT 3’P35S-A :5’AAGCTGATCTCCTTTGCCC 3’由于引物Hyg-S/A靶向潮霉素基因DNA，引物P35S-S/A靶向花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動(dòng)子DNA，因而可以用于檢測陽性轉(zhuǎn)基因植株，而在檢測野生型植株時(shí)預(yù)期結(jié)果呈陰性。在對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測鑒定后，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，編號3 8的轉(zhuǎn)基因植株檢測結(jié)果為陽性，即能分別特異擴(kuò)增到大約1421bp (潮霉素基因DNA)和942bp (花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子DNA)的目標(biāo)DNA條帶，而以野生型植株(編號I)基因組DNA為模板的PCR的檢測結(jié)果均為陰性，即不能特異擴(kuò)增到大約1421bp (潮霉素基因DNA)和942bp (花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子DNA)的目標(biāo)DNA條帶(參見圖I和圖2)。實(shí)施例3T1代SIDP361基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株中的SIDP361基因表達(dá)及其對鹽脅迫的抗性分析分別對兩個(gè)Tl代超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株株系和野生型植株的SIDP361基因表達(dá)進(jìn)行定量分析和耐鹽抗性鑒定。取Tl代SIDP361基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的種子和野生型水稻種子，分別播種后，按常規(guī)栽培方法進(jìn)行栽培，待植株長兩星期后，對野生型植株和兩個(gè)Tl代SIDP361基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的SIDP361基因表達(dá)進(jìn)行定量分析，并鑒定轉(zhuǎn)基因植株對鹽脅迫的抗性。具體操作方法如下分別從野生型植株和SIDP361基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株各取適量葉片，并從中提取總RNA，然后將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。分別以這些cDNA為模板，用基因特異引物對Actin-rq-S/Actin-rq-A 和 SIDP361-rq-S/SIDP361_rq-A 分別對樣品中 Actin 基因和SIDP361基因進(jìn)行定量分析。分析基因表達(dá)水平時(shí)，以Actin基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)基因，用相對表達(dá)量計(jì)算方法(Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification inreal-time RT-PCR[J]. Nucleic Acids Res. 2001, 29(9) :2002-2007.)分析SIDP361 基因在不同轉(zhuǎn)基因植株中的相對表達(dá)水平。在基因表達(dá)的定量分析中，每個(gè)基因至少重復(fù)2次熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。通過上述方法分析SIDP361基因在Tl代SIDP361基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株中的相對表達(dá)水平，結(jié)果顯示，SIDP361基因在兩個(gè)Tl代SIDP361基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株株系中的相對表達(dá)水平分別約為野生型植株的4. 99和6. 23倍(參見圖3)。由此可見，在Tl代SIDP361基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中，SIDP361基因的表達(dá)水平明顯提高。所用引物序列為Actin-rq-S 5’TGTATGCCAGTGGTCGTACCA 3’Actin-rq-A 5，CCAGCAAGGTCGAGACGAA 3’SIDP361-rq-S 5’GTTTCGCCGTACCCCTCC 3’SIDP361-rq-A 5，CCTCCCATTCCGCAGCCT 3，將野生型和Tl代種子播種到含Ommol/L和200mmol/L NaCI的1/2MS液體培養(yǎng)基上，生長12天后統(tǒng)計(jì)生物學(xué)產(chǎn)量株高和幼苗的生物量，鑒定這些轉(zhuǎn)基因植株對鹽脅迫 的抗性。株高和生物量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析用origin 8. O軟件附帶的統(tǒng)計(jì)程序進(jìn)行平均值差異顯著性或極顯著分析。對兩個(gè)Tl代SIDP361基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株株系和野生型植株的株高和生物量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每個(gè)株系至少測量30個(gè)植株，設(shè)置3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，200mmol/LNaCl處理12天后，兩個(gè)Tl代SIDP361基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株株系SI和S2的平均株高分別為3. 13±0. 20cm、3. 93±0. 20cm，而野生型植株株高平均長度約為O. 89±0. 03cm，極顯著(“**”，P〈0. 01)短于轉(zhuǎn)基因植株株系株高的平均長度(參見圖4);兩個(gè)Tl代SIDP361基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株株系SI和S2的生物量平均值分別為59. 46±1. 34mg、62. 81 ± I. 04mg，而野生型植株生物量平均值約為38. 99±0. 90mg，極顯著(“**”，？〈0.01)小于轉(zhuǎn)基因植株株系生物量的平均值(參見圖5)。結(jié)果表明，與野生型水稻植株相比，Tl代SIDP361基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株對高鹽脅迫的抗性顯著增強(qiáng)。實(shí)施例4SIDP361超量表達(dá)植株的游離脯氨酸含量檢測分別檢測了超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系和野生型在正常條件下和逆境條件處理后體內(nèi)游離脯氨酸含量的變化。正常條件下，兩個(gè)SIDP361超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株株系SI和S2體內(nèi)的游離脯氨酸含量分別為52. 57±4. 01 μ g · g_1Fw,49. 93±3· 06μ g · g^Fw ;野生型植株體內(nèi)的游離脯氨酸含量為50. 24±2. 79μ g · g^Fw。200mmol/L NaCl處理2天后，兩個(gè)SIDP361超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株株系SI和S2體內(nèi)的游離脯氨酸含量分別為421. 78 ±12. 43μ g · g^Fw,455. 11 ± 11. 08 μ g · g—Vw，野生型植株體內(nèi)的游離脯氨酸含量為132. 32±5. 98μ g · g—Vw。在鹽脅迫條件下，SIDP361超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)累計(jì)的游離脯氨酸含量極顯著(“**”，P〈0. 01)的高于野生型植株的游離脯氨酸含量(參見圖6)，說明鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株可以通過更快更多的合成滲透保護(hù)物質(zhì)來提高其耐鹽性。實(shí)施例5SIDP361超量表達(dá)對非生物脅迫相關(guān)基因表達(dá)的影響分別從正常培養(yǎng)條件下和200mmol/L NaCl處理3小時(shí)后的野生型植株和SIDP361基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株取適量葉片，并提取總RNA，然后將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。分別以這些cDNA為模板，用脅迫相關(guān)基因特異引物對樣品中脅迫相關(guān)基因進(jìn)行定量分析。分析基因表達(dá)水平時(shí)，以Actin基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)基因，用相對表達(dá)量計(jì)算方法(如實(shí)施例3所述)分析脅迫相關(guān)基因在不同環(huán)境下的野生型和轉(zhuǎn)基因植株中的相對表達(dá)水平。在基因表達(dá)的定量分析中，每個(gè)基因至少重復(fù)2次熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。通過上述方法分析脅迫相關(guān)基因在Tl代SIDP361基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株中的相對表達(dá)水平，結(jié)果顯示，在正常條件下或鹽脅迫后，脅迫相關(guān)基因在兩個(gè)Tl代SIDP361基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株株系中的相對表達(dá)水平均有不同程度的上調(diào)表達(dá)(參見圖T圖18)，說明SIDP361基因能通過上調(diào)脅迫相關(guān)基因的表達(dá)水平增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性。所用引物序列為SNACl-rq-S5’ATCCCTCACAACCCACAA 3’SNACl-rq-A5’GTCCCTCTCCCTCCTCAT 3’SNA C2-rq-S5’ CAAGGGCGAGAAGACCAA 3’SNAC2-rq-A5’CAGCACCCAATCATCCAAC 3’NAC5-rq-S5’AAGGGCGTCAAGACCAAC 3’NAC5-rq-A5’AACACCCAATCATCCAACC 3’ DREBIA-rq-S5’GCCTCTTTTTTCTCTCTTTTC 3’DREBIA-rq-A5’AACTTGTTCCATCACATTACC 3’DREB2A-rq-S5’GGAGGAATAGGAAGAAGGGA 3’DREB2A-rq-A5' GAGCGGGAACAAGAAAGAGA 3，NCED3-rq-S5’GGTTTGTGGCGAATGTC 3’NCED3-rq-A5’TCGTGGTGTGTTTCTG 3’DSM2-rq-S5’TGGTGGCAGCGGTGATGT 3’DSM2-rq-A5’ATGCGAGCGGGAGTTTGG 3’P5CS-rq-S5’AGCCACAGATGGAGTTAGATG 3’P5CS-rq-A5’GTCGGTGACAAGAAGTTGAGAT 3’Rabl6a-rq-S 5’GCTCAAGCTCGGTACAACA 3’Rabl6a-rq-A 5’CCTCCCATTCCATCATCCT 3’Rabl6b-rq-S 5’CATCTTACTGATAGCAACAACACT 3’Rabl6b-rq-A 5’GTCCATCCTCTCAAGCAAAT 3’LEA3-rq-S 5’GAATGATTTCCCTTTGGGTCTA 3’LEA3-rq-A 5，ACTCTGACGAAAACAACTGAAC 3’LEA3-l-rq-S 5’CGGCAGCGTCCTCCAACAG 3’LEA3-l-rq-A 5’ GCCTCGTCTTCGGTCATCC 3’。
權(quán)利要求
1.水稻鹽脅迫相關(guān)基因SIDP361，其特征在于其核苷酸序列為序列表中的SEQID No:Io
2.如權(quán)利要求I所述水稻鹽脅迫相關(guān)基因SIDP361編碼的蛋白，其特征在于其氨基酸序列為序列表中的SEQ ID No 2o
3.如權(quán)利要求I所述水稻鹽脅迫相關(guān)基因SIDP361在培育耐鹽性增強(qiáng)的水稻中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述水稻鹽脅迫相關(guān)基因SIDP361在培育耐鹽抗性增強(qiáng)的水稻中的應(yīng)用，其特征在于采用如下方法 構(gòu)建所述水稻鹽脅迫相關(guān)基因SIDP361的超量表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化到水稻，篩選獲得所述耐鹽抗性增強(qiáng)的水稻。
5.如權(quán)利要求4所述水稻鹽脅迫相關(guān)基因SIDP361在培育耐鹽抗性增強(qiáng)的水稻中的應(yīng)用，其特征在于所述表達(dá)載體為Ti類質(zhì)粒載體。
6.如權(quán)利要求4所述水稻鹽脅迫相關(guān)基因SIDP361在培育耐鹽抗性增強(qiáng)的水稻中的應(yīng)用，其特征在于所述轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法或基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法。
全文摘要
水稻鹽脅迫相關(guān)基因SIDP361及其編碼蛋白與應(yīng)用。涉及水稻基因，提供水稻鹽脅迫相關(guān)基因SIDP361及其編碼蛋白與應(yīng)用。水稻鹽脅迫相關(guān)基因SIDP361可用于提高水稻對鹽脅迫的抗性，培育高鹽抗性增強(qiáng)的水稻。水稻鹽脅迫相關(guān)基因SIDP361的超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株株系T1代在200mmol/L高鹽環(huán)境下的株高和生物量的平均值均顯著高于對照，表明超量表達(dá)該基因的轉(zhuǎn)基因植株能夠顯著提高水稻對高鹽環(huán)境的抗性。該基因?yàn)榕嘤啕}抗性增強(qiáng)的水稻提供了一條重要途徑。高鹽抗性水稻的栽培，對有效利用鹽堿土地、增加糧食產(chǎn)量等具有重要意義。
文檔編號A01H5/00GK102899332SQ20121043970
公開日2013年1月30日 申請日期2012年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月7日
發(fā)明者陳亮, 李敏, 郝國靜, 趙婷婷, 崔欣欣, 郭小玲 申請人:廈門大學(xué)