專利名稱：一種海藻生物飼料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種海藻發(fā)酵生物飼料的制備方法，尤其涉及一種利用復(fù)合菌種為原料制備海藻發(fā)酵生物飼料的方法。
背景技術(shù)：
海藻是一種生活在海洋里的含葉綠素或其他輔助色素的低等自養(yǎng)植物，能進(jìn)行光合作用，把海洋中的無(wú)機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化為有機(jī)質(zhì)。海藻類植物資源豐富，種類繁多。目前發(fā)現(xiàn)的海藻類植物約有I萬(wàn)多種，可分為綠藻門、褐藻門、藍(lán)藻門和紅藻門等10個(gè)門類，按形態(tài)分為大型海藻和微藻兩類，其中，大型海藻有褐藻中的海帶、裙帶菜、巨藻，綠藻中的苔條、石藥以及紅藻中的紫菜、石花菜等，微藻是形態(tài)最小的單細(xì)胞海藻，其直徑只有幾微米，但貯量巨大。海藻經(jīng)過(guò)加工可制成海藻粉。海藻粉中淀粉含量達(dá)25%，蛋白質(zhì)含量12 50%，并含有各種常量和微量元素，特別富含維生素A、B1、B2、B6、B12、C、煙酸、葉酸和胡蘿卜素。海藻所含的微量元素和各種維生素的量遠(yuǎn)超過(guò)陸地植物，海藻具有極高的營(yíng)養(yǎng)又和保健功效。同時(shí)，海藻中含有海藻多糖、甘露醇、丙稀酸、核苷類、萜類、大環(huán)內(nèi)酯和生物堿等生物活性物質(zhì)。近年來(lái)，對(duì)大型海藻的生物活性物質(zhì)的研究已引起廣泛的興趣，并已開發(fā)出紫菜多糖、褐藻淀粉硫酸脂、藻酸雙脂鈉(PSS)、腎?？档榷喾N海藻藥物。海藻中的抗病、抗應(yīng)激因子如丙烯酸、萜烯類、溴化酚類和某些含硫化合物等，對(duì)許多病原菌(如金黃色葡萄菌、大腸桿菌等)均有抑制作用，對(duì)提高水產(chǎn)動(dòng)物的免疫力及對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力、耐低氧能力有很大幫助。分布較廣的多節(jié)泡葉藻(Ascophyllum nodosum)含有酹類物質(zhì),具有廣譜強(qiáng)抗微生物作用。從漂浮馬尾藻(Sargassumnatans)中萃取分離出的馬尾藻素復(fù)合物能抑制金色葡萄球菌、大腸桿菌、普通變形菌的生長(zhǎng)。石藥(Ul-valinza)、車網(wǎng)藻(cystophyllumhakodatense)、鈍形凹頂藻(Iaurenciaobtusa)因含有溴酹化合物、職烯類等,具有抗生素的特性。海藻中的抗菌物質(zhì)不 會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性，對(duì)環(huán)境不會(huì)造成不良的影響，在生產(chǎn)上有一定的應(yīng)用價(jià)值。從海藻中可分離出硫酸多糖。硫酸多糖能夠與病毒結(jié)合形成非感染性的多糖一病毒復(fù)合物，干擾病毒的吸附和透入過(guò)程(Ehresmann假說(shuō))。Venkateswaran等用海藻多糖進(jìn)行抗原HBsA和抗體ant1-HBs結(jié)合的抑制試驗(yàn)。試驗(yàn)表明在濃度O. 5%時(shí)，鹿角菜屬(Pelvetia fastigiata)多糖的抑制率為 91% ( ±2. 2%);墨角藻(Fucus disticus)硫酸酯多聚糖的抑制率為92. 9% ;卡拉膠(λ、Κ、τ )為6±2%。在組織培養(yǎng)中，硫酸多糖這類天然聚陰離子性物質(zhì)均不利于如小核糖核酸病毒、粘病毒、皰疹病毒等多種動(dòng)物病毒的生長(zhǎng)。李凡等從海帶中提取褐藻糖膠，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這種多糖混合物可抗RNA病毒和DNA病毒。在石花菜屬和皺波角叉菜屬的海藻中都發(fā)現(xiàn)有抗病毒活性的硫酸多糖存在。我國(guó)的海藻粉生產(chǎn)及應(yīng)用還處于起步階段?，F(xiàn)在技術(shù)中，海藻飼料的制備方法都還存在著不足，如生產(chǎn)成本高、周期長(zhǎng)、養(yǎng)殖效果作用不明顯等問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種利用多種菌種發(fā)酵海藻、提高海藻發(fā)酵生物飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的、生產(chǎn)成本低、周期短的海藻發(fā)酵生物飼料的制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案為一種海藻發(fā)酵生物飼料的制備方法，包括以下步驟步驟一、使用按重量計(jì)15 25份放線菌、15 25份酵母菌、30 45份枯草芽孢桿菌、20 35份干酪乳桿菌和20 35份乳酸菌中的兩種或兩種以上制備復(fù)合菌劑；步驟二、使用所述步驟一制備的復(fù)合菌劑發(fā)酵海藻。優(yōu)選的是，所述的海藻發(fā)酵生物飼料的制備方法中，所述復(fù)合菌劑的制備過(guò)程包括以下步驟(I)按照所述步驟一的重量比分別稱取所選擇的菌種，并對(duì)各菌種單獨(dú)進(jìn)行培養(yǎng)；(2)按照與所述步驟(I)的比例，將單獨(dú)培養(yǎng)得到的各菌液混合。優(yōu)選的是，所述的海藻發(fā)酵生物飼料的制備方法中，所述步驟二中，使用所述步驟一制備的復(fù)合菌劑發(fā)酵海藻，通過(guò)以下過(guò)程實(shí)現(xiàn)將海藻制備成海藻固體發(fā)酵培養(yǎng)基，將復(fù)合菌劑按1:25 30的比例接種于海藻固體發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵溫度為30 35°C，發(fā)酵時(shí)間為8 10天。 優(yōu)選的是，所述的海藻發(fā)酵生物飼料的制備方法中，將復(fù)合菌劑接種于海藻固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，還向海藻固體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加O. 05% O. 2%的植酸質(zhì)。優(yōu)選的是，所述的海藻發(fā)酵生物飼料的制備方法中，復(fù)合菌劑發(fā)酵海藻固體發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物的PH值為4. 5^6. 0，水分的質(zhì)量含量為40%。優(yōu)選的是，所述的海藻發(fā)酵生物飼料的制備方法，還包括步驟三、將所述步驟二的發(fā)酵產(chǎn)物干燥，干燥溫度為4(T45°C，干燥時(shí)間為14 16h，干燥完成后發(fā)酵產(chǎn)物的水分在12%以下。優(yōu)選的是，所述的海藻發(fā)酵生物飼料的制備方法中，所述步驟(I)中，放線菌的培養(yǎng)方法為將放線菌的菌種培養(yǎng)成種子液，將種子液接種于放線菌發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行第一次發(fā)酵，第一次發(fā)酵條件為在25 30°C下振蕩培養(yǎng)5天，將第一次發(fā)酵的發(fā)酵液再接種于放線菌發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行第二次發(fā)酵。優(yōu)選的是，所述的海藻發(fā)酵生物飼料的制備方法中，所述步驟(I)中，枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)方法為將枯草芽孢桿菌的菌種接種于枯草芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，其中，枯草芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加有產(chǎn)物促進(jìn)劑，干酪乳桿菌的培養(yǎng)方法為將干酪乳桿菌的菌種接種于干酪乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，其中，干酪乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加有產(chǎn)物促進(jìn)劑。優(yōu)選的是，所述的海藻發(fā)酵生物飼料的制備方法中，所述步驟(I)中，乳酸菌的培養(yǎng)方法為將乳酸菌的菌種接種于乳酸菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，當(dāng)檢測(cè)到乳酸菌的發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)的活菌總數(shù)達(dá)到20億/ml，且乳酸菌的發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)的液體的pH值達(dá)到3 4時(shí)停止發(fā)酵。本發(fā)明具有以下有益效果(I)本發(fā)明采用放線菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌和乳酸菌制備復(fù)合菌齊U，對(duì)海藻進(jìn)行發(fā)酵，利用多種菌種之間的協(xié)同作用，在產(chǎn)生大量的纖維素酶類降解纖維的同時(shí)，充分利用無(wú)機(jī)氮源和有機(jī)氮源以及纖維分解產(chǎn)生的糖類合成菌體蛋白，本發(fā)明的海藻發(fā)酵生物飼料比海藻具有含量更高的必需氨基酸，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高，動(dòng)物吸收快，日增重可提高47%，免疫力增強(qiáng)，血清堿性磷酸酶活性提高15%，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性提高6%，養(yǎng)殖效果作用更明顯。(2)本發(fā)明中復(fù)合菌劑的制備過(guò)程為對(duì)放線菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌和乳酸菌進(jìn)行單獨(dú)的液體培養(yǎng)，再將培養(yǎng)完成的菌液混合后用于海藻的固體發(fā)酵，上述過(guò)程保證了菌種的高速生長(zhǎng)，有效控制生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本，固體發(fā)酵過(guò)程則使得代謝廣物完成保留。(3)本發(fā)明的海藻發(fā)酵生物飼料所含的高濃度乳酸能顯著提高水產(chǎn)動(dòng)物的消化吸收功能，同時(shí)肽聚糖增加了水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)病原體的免疫能力。(4)枯草芽孢桿菌和乳酸菌發(fā)酵海藻，在產(chǎn)生多肽與氨基酸的同時(shí)，能夠提高纖維素的分解，提高了養(yǎng)殖動(dòng)物對(duì)海藻發(fā)酵生物飼料的吸收和利用，為養(yǎng)殖動(dòng)物提供最佳的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)條件。(5)在復(fù)合菌劑發(fā)酵海藻的過(guò)程中，向海藻固體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加植酸質(zhì)作為產(chǎn)物促進(jìn)劑，大大提高發(fā)酵過(guò)程中酶活和產(chǎn)物的數(shù)量。(6)利用混合菌種發(fā)酵海藻制備海藻發(fā)酵生物飼料，提高了海藻的利用率，降低了生產(chǎn)成本，同時(shí)使用常用的發(fā)酵及生產(chǎn)設(shè)備，易于在動(dòng)物養(yǎng)殖中推廣。(7)本發(fā)明采用農(nóng)業(yè)部658公告允許添加的微生物菌種，在養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)無(wú)有害殘留，同時(shí)減少了抗生素在養(yǎng)殖中的使用量，提供了一種安全、綠色的生物飼料，本發(fā)明的海藻發(fā)酵生物飼料適用于禽畜、寵物與水產(chǎn)動(dòng)物等的養(yǎng)殖。


圖1為本發(fā)明的海藻發(fā)酵生物飼料的制備方法的工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式如圖1所示，本發(fā)明提供一種海藻發(fā)酵生物飼料的制備方法，包括以下步驟步驟一、使用按重量計(jì)15 25份放線菌、15 25份酵母菌、30 45份枯草芽孢桿菌、20 35份干酪乳桿菌和20 35份乳酸菌中的兩種或兩種以上制備復(fù)合菌劑；步驟二、使用所述步驟一制備的復(fù)合菌劑發(fā)酵海藻。所述的海藻發(fā)酵生物飼料的制備方法中，所述復(fù)合菌劑的制備過(guò)程包括以下步驟(1)按照所述步驟一的重量比分別稱取所選擇的菌種，并對(duì)各菌種單獨(dú)進(jìn)行培養(yǎng)；(2)按照與所述步驟(I)的比例，將單獨(dú)培養(yǎng)得到的各菌液混合。所述的海藻發(fā)酵生物飼料的制備方法中，所述步驟二中，使用所述步驟一制備的復(fù)合菌劑發(fā)酵海藻，通過(guò)以下過(guò)程實(shí)現(xiàn)將海藻制備成海藻固體發(fā)酵培養(yǎng)基，將復(fù)合菌劑按1:25 30的比例接種于海藻固體發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵溫度為3(T35°C，發(fā)酵時(shí)間為8 10天。所述的海藻發(fā)酵生物飼料的制備方法中，將復(fù)合菌劑接種于海藻固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，還向海藻固體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加O. 05% O. 2%的植酸質(zhì)。所述的海藻發(fā)酵生物飼料的制備方法中，復(fù)合菌劑發(fā)酵海藻固體發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物的pH值為4. 5^6. O，水分的質(zhì)量含量為40%。所述的海藻發(fā)酵生物飼料的制備方法，還包括步驟三、將所述步驟二的發(fā)酵產(chǎn)物干燥，干燥溫度為4(T45°C，干燥時(shí)間為14 16h，干燥完成后發(fā)酵產(chǎn)物的水分在12%以下。所述的海藻發(fā)酵生物飼料的制備方法中，所述步驟(I)中，放線菌的培養(yǎng)方法為將放線菌的菌種培養(yǎng)成種子液，將種子液接種于放線菌發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行第一次發(fā)酵，第一次發(fā)酵條件為在25 30°C下振蕩培養(yǎng)5天，將第一次發(fā)酵的發(fā)酵液再接種于放線菌發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行第二次發(fā)酵。所述的海藻發(fā)酵生物飼料的制備方法中，所述步驟(I)中，枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)方法為將枯草芽孢桿菌的菌種接種于枯草芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，其中，枯草芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加有產(chǎn)物促進(jìn)劑，干酪乳桿菌的培養(yǎng)方法為將干酪乳桿菌的菌種接種于干酪乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，其中，干酪乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加有產(chǎn)物促進(jìn)劑。所述的海藻發(fā)酵生物飼料的制備方法中，所述步驟(I)中，乳酸菌的培養(yǎng)方法為將乳酸菌的菌種接種于乳酸菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，當(dāng)檢測(cè)到乳酸菌的發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)的活菌總數(shù)達(dá)到20億/ml，且乳酸菌的發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)的液體的pH值達(dá)到3 4時(shí)停止發(fā)酵。我國(guó)微生物資源豐富，用于工業(yè)發(fā)酵的微生物主要包括細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌。飼料工業(yè)常用的細(xì)菌包括枯草芽孢桿菌、乳酸桿菌、醋酸桿菌、地衣芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌等，其適宜生長(zhǎng) 溫度是30 37°C，適宜pH為7. O 7. 2 ;常用的放線菌適宜生長(zhǎng)溫度是25 30°C，適宜pH為7. O 7. 2 ;常用的酵母菌包括啤酒酵母、假絲酵母和紅酵母，適宜的生長(zhǎng)溫度是24 32°C，適宜pH為3. O 6. O ;常用的霉菌包括黑曲霉、米曲霉、白地霉和木霉，其適宜的生長(zhǎng)溫度是25 30°C，適宜pH為3. O 6. O。酵母或細(xì)菌等單細(xì)胞菌類能夠產(chǎn)生單細(xì)胞蛋白(SPC)，多細(xì)胞的絲狀真菌類能夠產(chǎn)生菌體蛋白(MBP)。本發(fā)明所使用的菌種均為通常認(rèn)為是安全的可直接飼用的微生物菌種，包括酵母菌、放線菌、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、乳酸菌。本發(fā)明中采用由江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院營(yíng)養(yǎng)飼料研究所保存的放線菌(Actinomycetes,簡(jiǎn)寫為Am-1 )、酵母菌(Saccharomyces,簡(jiǎn)寫為SC-2)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis,簡(jiǎn)寫為BS-2)、干釀乳桿菌(Lactobacillus casei LC-15)、乳酸菌(Lactobacillus,簡(jiǎn)寫為 LB-1 )。放線菌是一類具有線狀結(jié)構(gòu)的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，在放線菌的生活周期中，基生菌絲逐步發(fā)育成氣生菌絲，并在氣生菌絲上形成分生胞子。放線菌是一種能產(chǎn)生多種有益代謝產(chǎn)物且具有很高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的菌種，如放線菌是產(chǎn)生抗生素活性物質(zhì)最大的一類原核微生物。到目前為止從放線菌的代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的具有生物活性的物質(zhì)大約有12000種，大約占整個(gè)天然生物活性物質(zhì)的50%左右。放線菌群具有較強(qiáng)的分解復(fù)雜含氮和不含氮有機(jī)物的能力，對(duì)自然界物質(zhì)轉(zhuǎn)化和土壤改良起著重要作用。飼用芽抱桿菌是一類好氧菌，能在一定條件下產(chǎn)生芽抱，具有耐高溫，耐酸堿和耐壓等特點(diǎn)。目前所用的芽孢桿菌主要包括枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌以及東洋芽孢桿菌等有益的種類。它們的特點(diǎn)是可以產(chǎn)生大量的胞外酶(蛋白酶、淀粉酶和半纖維素水解酶等)，這些酶類可以促進(jìn)飼料的消化和吸收，提高飼料的利用率，從而促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)?？莶菅挎邨U菌生長(zhǎng)環(huán)境多樣，可利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)種類十分豐富，這決定了其自身含有豐富的產(chǎn)酶系統(tǒng)，具備生產(chǎn)多種酶的應(yīng)用潛力。研究資料表明，枯草芽孢桿菌能夠產(chǎn)生蛋白酶、α 淀粉酶、纖維素酶、β 葡聚糖酶、植酸酶、果膠酶和木聚糖酶等十幾種酶。乳酸菌是一類可以分解糖類產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌的總稱，通常為厭氧或兼性厭氧生長(zhǎng)，缺點(diǎn)是大部分乳酸菌不耐高溫，經(jīng)80°C處理5分鐘，死亡率在70% 80%，所以在顆粒飼料制備過(guò)程中損失率較大。但這類菌能耐酸，在PH值為3到4. 5時(shí)仍能生長(zhǎng)，對(duì)胃的酸性環(huán)境有一定的耐受性，在動(dòng)物體內(nèi)可以通過(guò)生物拮抗、降低PH值來(lái)阻止和抑制致病菌的進(jìn)入和定植，減少亞硝氨、氨、糞臭素等有害物質(zhì)的產(chǎn)生，維持腸道中正常的生態(tài)平衡。乳酸菌在動(dòng)物腸道內(nèi)繁殖可以產(chǎn)生多種抑制性化合物，包括細(xì)菌素、類細(xì)菌素類物質(zhì)以及各種對(duì)抗性物質(zhì)，如過(guò)氧化氫和某些有機(jī)酸等。保加利亞乳桿菌和干酪乳桿菌，均為乳桿菌屬，厭氧和兼性厭氧，耐酸，最適PH通常是5. 5 5. 8或更低些。干酪乳桿菌發(fā)酵核糖成乳酸和乙酸，不產(chǎn)生C02。典型的酵母菌是單細(xì)胞真菌，具有氧化和發(fā)酵兩種代謝方式，能特征性發(fā)酵一系列碳水化合物，以出芽方式進(jìn)行無(wú)性 繁殖。酵母指以碳水化合物(淀粉、糖蜜，以及味精、造紙、酒精等高濃度有機(jī)廢液)為主要原料，經(jīng)液態(tài)通風(fēng)培養(yǎng)酵母菌，并從其發(fā)酵醪中分離酵母菌體(不添加其它物質(zhì))，酵母菌體經(jīng)干燥后制得的產(chǎn)品。酵母所含有的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)極為豐富。其中，蛋白質(zhì)含量可高達(dá)40% 80%，比大豆高10% 20%，比肉、魚、奶酪高20%以上；氨基酸的組成較為齊全，含有人體必需的8種氨基酸，尤其是谷物中含量較少的賴氨酸。由于枯草芽孢桿菌是產(chǎn)芽孢菌，后期發(fā)酵液體呈堿性，而兩種乳酸菌是典型的酸性培養(yǎng)細(xì)菌，所以直接復(fù)合培養(yǎng)有很大的難度，因此本發(fā)明對(duì)各菌種進(jìn)行單獨(dú)的液體培養(yǎng)，然后再將培養(yǎng)后的菌種混合后進(jìn)行海藻固體發(fā)酵培養(yǎng)基的固體發(fā)酵，既保證了各菌種活菌數(shù)量，保證各菌種具有高速的生產(chǎn)速度，又在固體發(fā)酵過(guò)程中最大程度的保留代謝產(chǎn)物，保證了海藻發(fā)酵生物飼料的應(yīng)用效果。實(shí)施例一步驟一生產(chǎn)菌種的制作將篩選的放線菌、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、乳酸菌分別轉(zhuǎn)接入裝有營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的茄子瓶中，將酵母菌轉(zhuǎn)接入酵母膏麥芽汁瓊脂作培養(yǎng)基的茄子瓶中，在35°C溫度下培養(yǎng)45小時(shí)，待茄子瓶表面菌苔布滿，并白中帶黃時(shí)即可取出，然后放入2 6°C的冰箱中進(jìn)行保存；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基牛肉膏3g、蛋白胨10g, NaCl 5g，瓊脂15 20g、水1000ml, PH7. O 7. 2。121。。滅菌 20min。淀粉培養(yǎng)基蛋白胨10g、NaC15g、牛肉膏5g、可溶性淀粉2g、蒸餾水、瓊脂15 20g, 121°C滅菌 20min。有益菌株的液體培養(yǎng)(I)按以下重量百分比例稱取各菌種放線菌15g、酵母菌15g、枯草芽孢桿菌30g、干酪乳桿菌20g、乳酸菌20g。( 2 )放線菌的液體培養(yǎng)挑取活化的放線菌的菌種接種于裝有30ml種子培養(yǎng)基的IOOml三角瓶中，28°C，180r/min下培養(yǎng)24h作為活化的種子液。再進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，進(jìn)行第一次發(fā)酵，取Iml種子液接入裝有50ml放線菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，28°C，180r/min條件下振蕩培養(yǎng)5天。將放線菌的發(fā)酵培養(yǎng)基在8000r/min下離心15min,取上清液備用，上清液即發(fā)酵液。將第一次發(fā)酵的發(fā)酵液按放線菌發(fā)酵培養(yǎng)基的5%接種到放線菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，混合均勻，壓實(shí)、密封發(fā)酵，時(shí)間3d。放線菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為可溶性淀粉2g、硝酸鉀O. lg、磷酸氫二鉀O. 05g、氯化鈉O. 05g、硫酸鎂O. 05g、硫酸亞鐵O. OOlg、瓊脂2g以及水1000ml。放線菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的制備過(guò)程為把淀粉放在燒杯里，用5ml水調(diào)成糊狀后，倒入95mL水，攪勻后加入其他物質(zhì)，使其他物質(zhì)溶解。在燒杯外做好記號(hào)，加熱到煮沸時(shí)加入瓊脂，不停攪拌，待瓊脂完全溶解后，補(bǔ)足失水。調(diào)整PH值到7. 2 7. 4，分裝后滅菌，備用。(3)酵母菌的液體培養(yǎng)將酵母菌的菌種接種于酵母菌發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵。酵母菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為蔗糖3g、NaNO3O. 3g、K2HPO4O. lg、KC10. 05g、MgSO4 · 7H20 0. 05g、FeSO4O. OOlg、瓊脂1. 5 2g 以及蒸餾水 100ml, ρΗ7· 0 7· 2，滅菌20mino(4)枯草芽孢桿菌的液體培養(yǎng)將稱取的枯草芽孢桿菌的菌種按重量比1:25的比例接種于12rC、30min高溫滅菌的枯草芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵時(shí)通氣量維持在1:1，發(fā)酵時(shí)間28h，待PH值上升到7. 5時(shí)停止發(fā)酵?？莶菅挎邨U菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為豆柏粉2g、大豆粉1. 5g、硫酸銨0. 5g、玉米淀粉3g、糖蜜10g、磷酸二氫鉀0. 2g、磷酸二氫鈉0. 3g、磷酸鎂0.1g以及無(wú)菌水82. 4g，其中還添加0. 05% 0. 2%的植酸質(zhì)作為產(chǎn)物促進(jìn)劑。(5)干酪乳桿菌的液 體培養(yǎng)將稱取的干酪乳桿菌按重量比1:30比例接種于123°C、45min高溫滅菌的干酪乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵時(shí)通氣量維持在1:1，發(fā)酵時(shí)間28小時(shí)，待PH值上升到7. 5時(shí)
停止發(fā)酵。干酪乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為牛肉膏5g、蛋白胨10g、乳糖5g、吐溫80(Tween 80) lg、L_ 半胱氨酸 0. lg、H20 1000ml,pH 7，121°C,滅菌 15min。其中，在干酪乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0. 05% 0. 2%的植酸質(zhì)作為產(chǎn)物促進(jìn)劑。(6)乳酸菌的液體培養(yǎng)本實(shí)施例中選擇植物乳桿菌和干酪乳桿菌進(jìn)行乳酸菌的液體培養(yǎng)。將稱取的植物乳桿菌和干酪乳桿菌混合在一起進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)。將混合菌苔按重量比1:25的比例接種于12rC、30min高溫滅菌的乳酸菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種后液體在發(fā)酵罐中攪拌30min，發(fā)酵罐的轉(zhuǎn)速為220r/min，攪拌均勻后放入消毒后的塑料桶中靜置5 7天，靜置過(guò)程中每天測(cè)定發(fā)酵罐內(nèi)的液體的PH值并釋放產(chǎn)出的氣體。發(fā)酵過(guò)程中抽樣3次，顯微鏡下檢測(cè)菌體生長(zhǎng)情況，當(dāng)活菌總數(shù)達(dá)到20億/ml的濃度和PH值達(dá)到3. O 4. O時(shí)停止發(fā)酵。乳酸菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為豆柏粉3g、大豆粉lg、硫酸按0. 3g、玉米淀粉2g、糖蜜log、磷酸二氫鉀0. 2g、磷酸二氫鈉0. 3g、磷酸鎂0. 2g以及水83g。(7)將上述放線菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌和乳酸菌的菌液仍按放線菌15g、酵母菌15g、枯草芽孢桿菌30g、干酪乳桿菌20g、乳酸菌20g的比例混合，得到復(fù)合菌液。
步驟二海藻發(fā)酵生物飼料的制備海藻固體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備海藻粉碎，過(guò)20 60目篩，滅菌，冷卻待用。(I)將復(fù)合菌液按重量比1:25的比例接入121°C、30min高溫滅菌的海藻固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在海藻固體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加植酸質(zhì)O. 2%為產(chǎn)物促進(jìn)劑，攪拌35min至均勻，倒入50 70kg消毒雙層飼料袋中密封發(fā)酵，溫度30 35°C，時(shí)間8天。(2)發(fā)酵過(guò)程中取樣三次，測(cè)定水分和PH值，發(fā)酵結(jié)束后取樣，測(cè)定水分為35 40%、PH 值為 4. 5 6. O ;步驟三干燥、粉碎和包裝(I)干燥將步驟二的發(fā)酵產(chǎn)物放入培養(yǎng)箱干燥，溫度控制在40°C，時(shí)間15小時(shí)，干燥完成的物料水份控制在12% ；(2)粉碎轉(zhuǎn)入粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎·，物料溫度控制在45°C以下，粉碎后的物料過(guò)50目篩網(wǎng)，篩后粗料重新粉碎；(3)篩后裝入帶有內(nèi)袋的桶或袋中，扎緊袋口，系好標(biāo)識(shí)牌，轉(zhuǎn)入成品庫(kù)有序堆放取樣檢測(cè)，主要參數(shù)水份12%、活菌數(shù)20 30億/g、總蛋白量16% ;物理性狀淺綠色粉末狀固體。(4)計(jì)量打包①選用塑料模密閉包裝；②每包重量為25kg。實(shí)施例二步驟一生產(chǎn)菌種的制作將篩選的放線菌、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、乳酸菌分別轉(zhuǎn)接入裝有營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的茄子瓶中，在35°C溫度下培養(yǎng)45小時(shí)，待茄子瓶表面菌苔布滿，并白中帶黃時(shí)即可取出，然后放入2 6°C的冰箱中進(jìn)行保存；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基牛肉膏3g、蛋白胨10g, NaCl 5g，瓊脂15 20g、水1000ml, PH7. O 7. 2。121。。滅菌 20min。淀粉培養(yǎng)基蛋白胨10g、NaC15g、牛肉膏5g、可溶性淀粉2g、蒸餾水、瓊脂15 20g, 121°C滅菌 20min。有益菌株的液體培養(yǎng)(I)按以下重量百分比稱取各菌種放線菌15g、枯草芽孢桿菌45g、干酪乳桿菌20g、乳酸菌20g。( 2 )放線菌的液體培養(yǎng)同實(shí)施例一(3)枯草芽孢桿菌的液體培養(yǎng)將稱取的枯草芽孢桿菌的菌種按重量比1:30的比例接種于123°C、45min高溫滅菌的液體培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)通氣量維持在1:1，發(fā)酵時(shí)間28h，待PH值上升到7. 5時(shí)停止發(fā)酵。枯草芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為豆柏粉2g、大豆粉3g、硫酸銨O. 7g、玉米淀粉5g、糖蜜148，磷酸二氫鉀0.88，磷酸二氫鈉28、硫酸鎂^、無(wú)菌水67.58。其中，枯草芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入O. 2%吐溫為產(chǎn)物促進(jìn)劑。(4)干酪乳桿菌的液體培養(yǎng)同實(shí)施例一(5)乳酸菌的液體培養(yǎng)
本實(shí)施例中選擇植物乳桿菌和干酪乳桿菌進(jìn)行乳酸菌的液體培養(yǎng)。將稱取的植物乳桿菌和干酪乳桿菌混合在一起進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)。將混合菌苔按重量比按1:30的比例接種于123°C、45min高溫滅菌的乳酸菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種后液體在發(fā)酵罐中攪拌30min，發(fā)酵罐的轉(zhuǎn)速為220r/min，攪拌均勻后放入消毒后的塑料桶中靜置5 7天，靜置過(guò)程中每天測(cè)定發(fā)酵罐內(nèi)的液體的PH值并釋放產(chǎn)出的氣體。發(fā)酵過(guò)程中抽樣3次，顯微鏡下檢測(cè)菌體生長(zhǎng)情況，當(dāng)活菌總數(shù)達(dá)到20億/ml的濃度和PH值達(dá)到3. O 4. O時(shí)停止發(fā)酵。乳酸菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為豆柏粉6g、大豆粉3g、硫酸錢O. Sg、玉米淀粉5g、糖蜜15g、磷酸二氫鉀Ig,磷酸二氫鈉1. 8g、硫酸鎂Ig以及無(wú)菌水66. 4g。(7)將上述放線菌、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌和乳酸菌的菌液仍按放線菌15g、枯草芽孢桿菌45g、干酪乳桿菌20g、乳酸菌20g的比例混合，得到復(fù)合菌液。步驟二海藻固體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備海藻粉碎，過(guò)20 60目篩，滅菌，冷卻待用。(I)將復(fù)合菌液按重量比1:30的比例接入123°C、45min高溫滅菌的海藻固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在海藻固體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加植酸質(zhì)O. 2%為產(chǎn)物促進(jìn)劑，攪拌35min至均勻，倒入50 70kg消毒雙層飼料袋中密封發(fā)酵，溫度30 35°C，時(shí)間8天；(2)同實(shí)施例一；步驟三干燥、粉碎和包裝(I)干燥將步驟4發(fā)酵完全的產(chǎn)品按時(shí)間先后放入培養(yǎng)箱干燥，溫度控制在40°C，時(shí)間15小時(shí)，干燥完成的物料水份控制在12% ；(2)粉碎轉(zhuǎn)入粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，物料溫度控制在45°C以下，粉碎后的物料過(guò)50目篩網(wǎng)，篩后粗料重新粉碎；(3)篩后裝入帶有內(nèi)袋的桶或袋中，扎緊袋口，系好標(biāo)識(shí)牌，轉(zhuǎn)入成品庫(kù)有序堆放取樣檢測(cè)，主要參數(shù)水份12%、活菌數(shù)20 30億/g、總蛋白量16% :物理性狀淺綠色粉末狀固體。(5)計(jì)量打包①選用塑料模密閉包裝；②每包重量為25kg。本發(fā)明采用正交試驗(yàn)確定了放線菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、乳酸菌等菌的復(fù)合菌液發(fā)酵海藻的最優(yōu)培養(yǎng)基，通過(guò)單因素試驗(yàn)優(yōu)化了多菌種混合發(fā)酵海藻的培養(yǎng)條件與固態(tài)發(fā)酵方法。上述實(shí)施例一和實(shí)施例二分別對(duì)應(yīng)發(fā)酵I號(hào)和發(fā)酵2號(hào)。發(fā)酵I號(hào)所采用的菌種為放線菌15g、酵母菌15g、枯草芽孢桿菌30g、干酪乳桿菌20g、乳酸菌20g ;發(fā)酵2號(hào)所采用的菌種為放線菌15g、枯草芽孢桿菌45g、干酪乳桿菌20g、乳酸菌20g。試驗(yàn)結(jié)果表明，海藻發(fā)酵后，氨基酸成分分析結(jié)果表明發(fā)酵I號(hào)與發(fā)酵2號(hào)的發(fā)酵產(chǎn)物比發(fā)酵前的海藻的蛋氨酸(Met)含量分別提高了 12. 21%與5. 11% ;亮氨酸(Leu)分別提高了 7. 67%與3. 75% ；谷氨酸(Glu)含量分別提高了 12. 21%和1. 112%;其次脯氨酸(Pro)、絲氨酸(Ser)、亮氨酸(Leu)、天冬氨酸(Asp)、纈氨酸(Val)、蘇氨酸(Thr)等均有所提高，改善了海藻的品質(zhì)。實(shí)施例三本實(shí)施例研究櫻桃谷肉鴨日糧中添加不同水平的海藻發(fā)酵生物飼料對(duì)其生長(zhǎng)性能的影響。選取360只I日齡健康櫻桃谷肉公鴨，共設(shè)6個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20只鴨，試驗(yàn)分為前期(I 21d)和后期(22 42d)兩個(gè)階段。6個(gè)處理分別對(duì)應(yīng)6個(gè)組，第I組為對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)日糧，第I1、m、iv、V、νι組為試驗(yàn)組，其添加水平分別為2%、4%、6%、8%、10%。自由采食和飲水。當(dāng)肉鴨日糧中添加劑量為4%和6%時(shí)，全期(I 42日齡)日增重顯著高于對(duì)照組和其他試驗(yàn)組(P〈0. 05)，料肉比顯著低于對(duì)照組(P〈0. 05)。海藻發(fā)酵生物飼料對(duì)櫻桃谷肉鴨具有促生長(zhǎng)作用，在日糧中的適宜添加劑量為4% 6%。本實(shí)施例中的海藻發(fā)酵生物飼料選擇上述實(shí)施例一制備的海藻發(fā)酵生物飼料。本實(shí)施例實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，海藻經(jīng)過(guò)發(fā)酵后，其所含有的膠質(zhì)包被破壞，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更易吸收，而且纖維素含量降低也有利于肉鴨消化吸收。在全期(I 42日齡)，飼料中添加海藻發(fā)酵生物飼料的為4% 6%時(shí)，效果最明顯，體重增加、日增重顯著高于對(duì)照組及其他試驗(yàn)組(P〈0. 05)，采食量也高于對(duì)照組及其他試驗(yàn)組，料肉比則低于對(duì)照組及其他試驗(yàn)組。這與之前的在肉雞、蛋雞、肉豬上的應(yīng)用研究結(jié)果基本吻合。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，日增重和采食量在I 22日齡時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著(P〈0. 05)，而在22 42日齡時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異不顯著(P>0. 05)，這說(shuō)明海藻發(fā)酵生物飼料對(duì)鴨的促生長(zhǎng)作用主要表現(xiàn)生長(zhǎng)前期，在后期的影響有限。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，海藻發(fā)酵生物飼料在日糧中的適宜添加劑量為4 6%ο實(shí)施例四本實(shí)施例選用三元雜交(杜X長(zhǎng)X大)生長(zhǎng)育肥豬180頭，隨機(jī)分成4個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15頭豬。4個(gè)處理為對(duì)照組、抗生素組、試驗(yàn)I組和試驗(yàn)II組，分別飼喂玉米一豆柏型日糧不含抗生素、玉米一豆柏型日糧添加抗生素、海藻發(fā)酵生物飼料不發(fā)酵組、海藻發(fā)酵生物飼料24h組。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)前腔靜脈采血，測(cè)定血清生化指標(biāo)，試驗(yàn)期28d。試驗(yàn)結(jié)果表明①在生長(zhǎng)性能方面，試驗(yàn)II組與對(duì)照組和試驗(yàn)I組相比，平均日增重分別提高了 47. 50%和37. 21%,料肉比分別降低了 21. 38%和16. 88% (Ρ〈0· 05)。②試驗(yàn)II組分別與對(duì)照組、抗生素組和試驗(yàn)I組相比，血清堿性磷酸酶活性分別提高了 15. 88%、12. 48%和9. 16% (Ρ〈0· 05)，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性分別提高了 6. 45%,5. 25%和5. 96%。本實(shí)施例中的海藻發(fā)酵生物飼料選擇上 述實(shí)施例二制備的海藻發(fā)酵生物飼料。盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說(shuō)明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對(duì)于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的圖例。
權(quán)利要求
1.一種海藻發(fā)酵生物飼料的制備方法，其特征在于，包括以下步驟步驟一、使用按重量計(jì)15 25份放線菌、15 25份酵母菌、30 45份枯草芽孢桿菌、20 35份干酪乳桿菌和20 35份乳酸菌中的兩種或兩種以上制備復(fù)合菌劑；步驟二、使用所述步驟一制備的復(fù)合菌劑發(fā)酵海藻。
2.如權(quán)利要求1所述的海藻發(fā)酵生物飼料的制備方法，其特征在于，所述復(fù)合菌劑的制備過(guò)程包括以下步驟(1)按照所述步驟一的重量比分別稱取所選擇的菌種，并對(duì)各菌種單獨(dú)進(jìn)行培養(yǎng)；(2)按照與所述步驟(I)的比例，將單獨(dú)培養(yǎng)得到的各菌液混合。
3.如權(quán)利要求2所述的海藻發(fā)酵生物飼料的制備方法，其特征在于，所述步驟二中，使用所述步驟一制備的復(fù)合菌劑發(fā)酵海藻，通過(guò)以下過(guò)程實(shí)現(xiàn)將海藻制備成海藻固體發(fā)酵培養(yǎng)基，將復(fù)合菌劑按1:25 30的比例接種于海藻固體發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵溫度為30 35°C，發(fā)酵時(shí)間為8 10天。
4.如權(quán)利要求3所述的海藻發(fā)酵生物飼料的制備方法，其特征在于，將復(fù)合菌劑接種于海藻固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，還向海藻固體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加O. 05% O. 2%的植酸質(zhì)。
5.如權(quán)利要求3所述的海藻發(fā)酵生物飼料的制備方法，其特征在于，復(fù)合菌劑發(fā)酵海藻固體發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物的pH值為4. 5^6. O,水分的質(zhì)量含量為40%。
6.如權(quán)利要求5所述的海藻發(fā)酵生物飼料的制備方法，其特征在于，還包括步驟三、將所述步驟二的發(fā)酵產(chǎn)物干燥，干燥溫度為4(T45°C，干燥時(shí)間為14 16h，干燥完成后發(fā)酵產(chǎn)物的水分在12%以下。
7.如權(quán)利要求2所述的海藻發(fā)酵生物飼料的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中，放線菌的培養(yǎng)方法為將放線菌的菌種培養(yǎng)成種子液，將種子液接種于放線菌發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行第一次發(fā)酵，第一次發(fā)酵條件為在25 30°C下振蕩培養(yǎng)5天，將第一次發(fā)酵的發(fā)酵液再接種于放線菌發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行第二次發(fā)酵。
8.如權(quán)利要求2所述的海藻發(fā)酵生物飼料的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中，枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)方法為將枯草芽孢桿菌的菌種接種于枯草芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，其中，枯草芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加有產(chǎn)物促進(jìn)劑，干酪乳桿菌的培養(yǎng)方法為將干酪乳桿菌的菌種接種于干酪乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，其中，干酪乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加有產(chǎn)物促進(jìn)劑。
9.如權(quán)利要求2所述的海藻發(fā)酵生物飼料的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中，乳酸菌的培養(yǎng)方法為將乳酸菌的菌種接種于乳酸菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，當(dāng)檢測(cè)到乳酸菌的發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)的活菌總數(shù)達(dá)到20億/ml，且乳酸菌的發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)的液體的pH值達(dá)到3^4時(shí)停止發(fā)酵。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種海藻發(fā)酵生物飼料制備方法。本發(fā)明采用放線菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌和乳酸菌制備復(fù)合菌劑，對(duì)海藻進(jìn)行發(fā)酵，利用多種菌種之間的協(xié)同作用，在產(chǎn)生大量的纖維素酶類降解纖維的同時(shí)，充分利用無(wú)機(jī)氮源和有機(jī)氮源以及纖維分解產(chǎn)生的糖類合成菌體蛋白，本發(fā)明的海藻發(fā)酵生物飼料比海藻具有含量更高的必需氨基酸，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高，動(dòng)物吸收快，日增重可提高47%，免疫力增強(qiáng)，血清堿性磷酸酶活性提高15%，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性提高6%，養(yǎng)殖效果作用更明顯。且本發(fā)明的制備方法相比現(xiàn)有技術(shù)還具有生產(chǎn)成本低、周期短的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)A23K1/14GK103039696SQ20121044086
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月7日
發(fā)明者方希修, 王權(quán), 王冬梅, 方圓 申請(qǐng)人:方希修