專(zhuān)利名稱(chēng)：以單倍體玉米莖尖為受體的轉(zhuǎn)基因育種方法
以單倍體玉米莖尖為受體的轉(zhuǎn)基因育種方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)育種領(lǐng)域，具體而言，涉及一種以單倍體玉米莖尖為受體的轉(zhuǎn)基因玉米育種方法。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因育種已經(jīng)成為現(xiàn)代分子育種的一種重要手段。從80年代后期科學(xué)家開(kāi)始進(jìn)行玉米轉(zhuǎn)基因研究，至今已經(jīng)取得一些重要成果。國(guó)外已經(jīng)有部分商業(yè)化種植的玉米轉(zhuǎn)基因品種，例如高賴(lài)氨酸轉(zhuǎn)基因玉米，抗玉米螟轉(zhuǎn)基因玉米，抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米等。而國(guó)內(nèi)成功的例子還相對(duì)較少，轉(zhuǎn)基因育種進(jìn)程遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家。在玉米轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域常用的遺傳轉(zhuǎn)化方法是以幼胚和幼胚誘導(dǎo)的胚性愈傷組織為受體的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。此類(lèi)方法的特點(diǎn)是受體為二倍體的玉米材料，且須經(jīng)歷幼胚脫分化和再分化等復(fù)雜的組織培養(yǎng)過(guò)程。存在以下缺點(diǎn)(I)不同基因型玉米幼胚的脫分化和再分化能力具有很大差異，很多生產(chǎn)上使用的骨干自交系由于甚至不能誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，或者再分化效率極低，而不能作為轉(zhuǎn)化受體，這限制了轉(zhuǎn)基因玉米受體基因型的選擇范圍；(2)基因轉(zhuǎn)化效率低，如果沒(méi)有龐大的受體系統(tǒng)難以獲得足夠的轉(zhuǎn)化事件，篩選出目的基因高效表達(dá)的轉(zhuǎn)化體幾率非常??；(3)目的基因遺傳不穩(wěn)定，基因沉默和基因丟失現(xiàn)象比較常見(jiàn)，難以獲得目標(biāo)性狀穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因株系；(4)以二倍體玉米作為受體材料獲得的當(dāng)代轉(zhuǎn)基因植株其目的基因在同源染色體上處于雜合狀態(tài)，必須經(jīng)過(guò)2代以上的自交才能獲得純合穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因株系，導(dǎo)致獲得轉(zhuǎn)基因純合的株系周期太長(zhǎng)。
近年來(lái)也開(kāi)展了以植物單配體為受體系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因研究。在煙草和大麥的上，以雌雄配子體及其培養(yǎng)形成的單倍體愈傷組織為受體已成功獲得了陽(yáng)性轉(zhuǎn)化事件；利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行花粉和卵細(xì)胞的單倍體培養(yǎng)，誘導(dǎo)出胚性細(xì)胞或愈傷組織，進(jìn)一步分化發(fā)育成單倍體植株，建立單倍體轉(zhuǎn)基因受體系統(tǒng)。該技術(shù)在水稻和煙草上也有成功應(yīng)用的報(bào)道。
無(wú)論以花粉、卵細(xì)胞等雌雄配子體作為受體的轉(zhuǎn)基因技術(shù)都必須經(jīng)歷愈傷組織誘導(dǎo)和分化等組培過(guò)程，而單倍體的組培系統(tǒng)尚不成熟，培養(yǎng)再生植株非常困難，直接影響了陽(yáng)性轉(zhuǎn)化事件的獲得；同時(shí)，在單倍體誘導(dǎo)愈傷組織的整個(gè)過(guò)程歷時(shí)長(zhǎng)，容易發(fā)生自然加倍現(xiàn)象，導(dǎo)致單倍體受體本身產(chǎn)生效率低；另外，此類(lèi)技術(shù)的取材時(shí)間只能局限在植物生殖生長(zhǎng)期，受到嚴(yán)重的季節(jié)限制。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)以上存在問(wèn)題，建立了單倍體玉米莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)直接分化受體系統(tǒng)，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將目的基因?qū)胧荏w，再將陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行加倍獲得轉(zhuǎn)基因二倍體玉米的方法。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明擬采用如下技術(shù)方案
本發(fā)明一方面涉及一種以單倍體玉米莖尖為受體的轉(zhuǎn)基因育種方法，包括如下步驟
(I)用單倍體誘導(dǎo)系stock6做為父本，以西南地區(qū)玉米骨干自交系18-599作為母本，進(jìn)行雜交組配并收獲Fl代雜交種，從獲得的種子中挑選胚乳頂部為紫色而胚為白色的種子，該種子大部分為單倍體；棄去胚乳頂部和胚均為紫色的二倍體種子；
(2)對(duì)獲得的單倍體種子進(jìn)行消毒，然后在培養(yǎng)箱中進(jìn)行黑暗條件下培養(yǎng)，待胚芽生長(zhǎng)到2 4cm
(3)以含目的基因的表達(dá)載體制備含目的基因表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌,篩選轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌并制備成侵染液；
(4)切單倍體莖尖在超凈工作臺(tái)上墊上提前滅過(guò)菌的濾紙，然后從培養(yǎng)基上用鑷子取出步驟(2)中待轉(zhuǎn)化的發(fā)芽植株，用手術(shù)刀先切去種子胚根，在莖節(jié)鼓起處以上I毫米左右的部分橫向微切，輕輕剝?nèi)ヅ哐壳事冻銮o尖生長(zhǎng)點(diǎn)，再?gòu)闹胁靠v向切傷莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)， 傷口深度約Imm;
(5)農(nóng)桿菌侵染莖尖擺放好莖尖的培養(yǎng)皿置于真空干燥器中，并墊上泡沫塑料使其向莖尖一邊傾斜，然后農(nóng)桿菌侵染液滴加在培養(yǎng)皿中莖尖一方，使莖尖能完全接觸菌液，完全蓋上真空干燥器蓋子，在30-70kPa壓力下侵染6-12min ；
(6)共培養(yǎng)侵染結(jié)束后，用吸管快速吸凈培養(yǎng)皿上多余的菌液，置于21 25°C繼續(xù)暗培養(yǎng)4 6天,直至長(zhǎng)出新葉,且節(jié)根長(zhǎng)至I 2cm ；
(7)共培養(yǎng)結(jié)束后，將長(zhǎng)出新葉的轉(zhuǎn)化苗用室溫下的自來(lái)水洗掉表面的培養(yǎng)基和菌體，然后將其整齊的移栽到土壤中，先置于人工氣候室避光生長(zhǎng)2 3d，然后讓植株在日溫22 28°C、夜溫15 21 °C的條件下生長(zhǎng)，直至植株3葉I心期；
(8)陽(yáng)性單倍體植株的加倍處理待步驟(7)中的陽(yáng)性單倍體植株和對(duì)照植株生長(zhǎng)至四葉一心期時(shí)，用除草劑進(jìn)行加倍，具體方法為將二甲基亞砜溶解甲基胺草磷溶液用滴管滴至單倍體植株的心葉處，每株約O. 5-1. 5ml，重復(fù)2-4次；
(9)陽(yáng)性純合轉(zhuǎn)基因二倍體種子的獲得
加倍處理后，待植株長(zhǎng)至5葉期將其移栽到溫室或大田，花期能正常散粉的均為加倍成功的陽(yáng)性植株，將它們進(jìn)行套袋自交，收獲的種子即為純合的轉(zhuǎn)基因二倍體種子。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述步驟(2)中的消毒過(guò)程包括如下步驟將篩選得到的紫頂白胚的單倍體種子，在超凈工作臺(tái)上用75%乙醇消毒8分鐘、O. 1%氯化汞水溶液滅菌6分鐘、無(wú)菌水洗滌3次；然后加I. 5倍種子體積無(wú)菌水在24 26°C浸泡6小時(shí)；再用O. I %氯化汞水溶液滅菌10分鐘、無(wú)菌水洗滌5次。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基為改良的MS培養(yǎng)基，改良的MS培養(yǎng)基配方如下表所示
權(quán)利要求
1.以單倍體玉米莖尖為受體的轉(zhuǎn)基因育種方法，包括如下步驟(1)用單倍體誘導(dǎo)系stock6做為父本，以西南地區(qū)玉米骨干自交系18-599作為母本， 進(jìn)行雜交組配并收獲Fl代雜交種，從獲得的種子中挑選胚乳頂部為紫色而胚為白色的種子，該種子大部分為單倍體；棄去胚乳頂部和胚均為紫色的二倍體種子；(2)對(duì)獲得的單倍體種子進(jìn)行消毒，然后在培養(yǎng)箱中進(jìn)行黑暗條件下培養(yǎng)，待胚芽生長(zhǎng)到2 4cm (3)以含目的基因的表達(dá)載體制備含目的基因表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，篩選轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌并制備成侵染液；(4)切單倍體莖尖在超凈工作臺(tái)上墊上提前滅過(guò)菌的濾紙，然后從培養(yǎng)基上用鑷子取出步驟(2)中待轉(zhuǎn)化的發(fā)芽植株，用手術(shù)刀先切去種子胚根，在莖節(jié)鼓起處以上I毫米左右的部分橫向微切，輕輕剝?nèi)ヅ哐壳事冻銮o尖生長(zhǎng)點(diǎn)，再?gòu)闹胁靠v向切傷莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)，傷口深度約Imm ；(5)農(nóng)桿菌侵染莖尖擺放好莖尖的培養(yǎng)皿置于真空干燥器中，并墊上泡沫塑料使其向莖尖一邊傾斜，然后農(nóng)桿菌侵染液滴加在培養(yǎng)皿中莖尖一方，使莖尖能完全接觸菌液，完全蓋上真空干燥器蓋子，在30-70kPa壓力下侵染6 12min ；(6)共培養(yǎng)侵染結(jié)束后，用吸管快速吸凈培養(yǎng)皿上多余的菌液，置于21 25°C繼續(xù)暗培養(yǎng)4 6天,直至長(zhǎng)出新葉,且節(jié)根長(zhǎng)至I 2cm ；(7)共培養(yǎng)結(jié)束后，將長(zhǎng)出新葉的轉(zhuǎn)化苗用室溫下的自來(lái)水洗掉表面的培養(yǎng)基和菌體，然后將其整齊的移栽到土壤中，先置于人工氣候室避光生長(zhǎng)2 3d，然后讓植株在日溫 22 28°C、夜溫15 21°C的條件下生長(zhǎng)，直至植株3葉I心期；任選的，包括根尖鏡檢篩選陽(yáng)性單倍體步驟；(8)陽(yáng)性單倍體植株的加倍處理待步驟(7)中的陽(yáng)性單倍體植株和對(duì)照植株生長(zhǎng)至四葉一心期時(shí)，用除草劑進(jìn)行加倍，具體方法為將二甲基亞砜溶解甲基胺草磷溶液用滴管滴至單倍體植株的心葉處，每株約O. 5-1. 5ml，重復(fù)2-4次；(9)陽(yáng)性純合轉(zhuǎn)基因二倍體種子的獲得加倍處理后，待植株長(zhǎng)至5葉期將其移栽到溫室或大田，花期能正常散粉的均為加倍成功的陽(yáng)性植株，將它們進(jìn)行套袋自交，收獲的種子即為純合的轉(zhuǎn)基因二倍體種子。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的育種方法，其特征在于所述步驟(2)中的消毒過(guò)程包括如下步驟將篩選得到的紫頂白胚的單倍體種子，在超凈工作臺(tái)上用75%乙醇消毒8分鐘、 O. I %氯化汞水溶液滅菌6分鐘、無(wú)菌水洗滌3次；然后加I. 5倍種子體積無(wú)菌水在24 26°C浸泡6小時(shí)；再用O. I %氯化汞水溶液滅菌10分 鐘、無(wú)菌水洗滌5次。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的育種方法，其特征在于培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基為改良的MS培養(yǎng)基，改良的MS培養(yǎng)基配方如下表所示
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)基因育種方法，其特征在于所述的載體為以含目的基因 Incw2 的表達(dá)載體 3300-27KD-Incw2-ba。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)基因育種方法，其特征在于所屬的侵染液的制備包括如下步驟挑取農(nóng)桿菌陽(yáng)性單克隆置于含Kan和Rif的YEP液體培養(yǎng)基中于25_30°C避光振蕩培養(yǎng)10-15h，使細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心收集菌體，將菌體用等體積的添加100 μ mo/LAS 的浸染培養(yǎng)基重懸。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了以單倍體玉米莖尖為受體的轉(zhuǎn)基因育種方法，其包括1.單倍體材料的獲得及前處理；2.單倍體材料的培養(yǎng)；3.目的基因轉(zhuǎn)化單倍體莖尖；4.轉(zhuǎn)化苗的移栽和加倍處理。本發(fā)明的方法避免了玉米組織培養(yǎng)及再生過(guò)程，適用于大多數(shù)基因型玉米的遺傳轉(zhuǎn)化；以單倍體玉米莖尖為轉(zhuǎn)基因受體的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是簡(jiǎn)易高效、省時(shí)省力、廣泛適用的一種快速獲得轉(zhuǎn)基因玉米純合體的新方法。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102934607SQ20121044814
公開(kāi)日2013年2月20日 申請(qǐng)日期2012年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月12日
發(fā)明者沈亞歐, 潘光堂, 江舟, 楊珊, 林海建, 彭煥偉, 張志明, 羅旭, 馬浪浪, 李婉蓉, 張兵 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)