專利名稱：一種胚挽救和離體誘導(dǎo)相結(jié)合構(gòu)建異源多倍體水稻的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種野生稻與栽培稻雜交育種的方法，特別是一種野生稻與栽培稻雜交后通過(guò)胚挽救和離體誘導(dǎo)加倍相結(jié)合構(gòu)建異源多倍體水稻的品種選育方法，屬于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的作物新品種選育技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
面臨世界糧食危機(jī)的挑戰(zhàn)，急需大幅度增產(chǎn)糧食的技術(shù)和思路。然而，長(zhǎng)期以來(lái)，稻類(lèi)作物主要通過(guò)同一物種內(nèi)的不同品種間雜交來(lái)選育新品種。由于栽培物種在長(zhǎng)期進(jìn)化和人工選擇中，原本存在于野生物種的許多優(yōu)良基因被淘汰，導(dǎo)致雜交親本間遺傳基礎(chǔ)越來(lái)越窄，遺傳的多樣性越來(lái)越貧乏(孟金陵.植物生殖遺傳，1995 ;Khush GS.Disease andinsect resistance in rice.Adv Agron, 1977, 29:265-341),從而造成幾十年來(lái)水稻選育品種的相似性很高，增產(chǎn)的幅度很難超過(guò)5%。因此，開(kāi)拓育種新思路，充分利用20多個(gè)野生稻物種極為豐富的遺傳多樣性和許多寶貴的抗病蟲(chóng)、抗逆境和高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的基因，將成為超級(jí)稻育種的重要方向(湯圣祥，顏輝煌.國(guó)外對(duì)野生稻優(yōu)良性狀的利用進(jìn)展.水稻文摘，1992，11(1): 5-8)?？墒牵捎谟行噪s交原理的限制，A基因組的栽培稻很難與BB，CC,BBCC, (XDD，EE, FF, GG, HHKK, HHJJ等9個(gè)基因組的野生稻種間雜交(王愛(ài)云，陳冬玲，蔡得田.遠(yuǎn)緣雜交和異源多倍體化技術(shù)在水稻育種中的應(yīng)用.武漢植物學(xué)研究，2005，23(5): 491-495)，分布于野生稻中的有利基因很難被結(jié)合到A基因組的栽培稻中。所以，建立栽培稻與野生稻不同基因組物種間雜交獲得異源雜交種或異源多倍體雜種的技術(shù)是十分必要和具有重要意義的。本發(fā)明涉及的是一種栽培稻與野生稻雜交，構(gòu)建異源多倍體水稻的技術(shù)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立栽培稻與野生稻雜交，通過(guò)胚挽救培養(yǎng)與秋水仙素處理相結(jié)合構(gòu)建異源多倍體水稻的新品種(系)選育方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案為:a.暗處理野生稻會(huì)聚栽培稻開(kāi)花期；b.栽培稻與野生稻雜交；c.雜交后噴灑幼胚發(fā)育促進(jìn)液；d.胚挽救培養(yǎng)；e.雜交胚生長(zhǎng)出芽苗或愈傷組織；f.秋水仙素處理芽苗或愈傷組織；g.處理后芽苗或愈傷組織的恢復(fù)培養(yǎng)；h.芽苗的生根培養(yǎng)或愈傷組織的分化培養(yǎng)組培苗的移植異源雜種苗的選擇；k.異源四倍體或異源六倍體水稻的確定。
本發(fā)明的具體過(guò)程 a.暗處理野生稻使其會(huì)聚栽培稻開(kāi)花期 由于野生稻是典型的短日照植物，在亞熱帶到溫帶地區(qū)自然情況下，絕大多數(shù)野生稻物種不能在栽培稻多數(shù)品種7月 8月開(kāi)花時(shí)開(kāi)花，給雜交工作造成很大困難。為了使兩類(lèi)親本的開(kāi)花期相遇，因此，必須對(duì)野生稻進(jìn)行短日照處理，即采用紅黑雙層布將具7片葉以上的野生稻苗罩起來(lái)，使光照時(shí)期控制在8.5hr 9.0hr/日，處理時(shí)間從6月初至7月初共30天，這樣野生稻均可進(jìn)入生殖生長(zhǎng)期相繼在7月中旬 8月中旬開(kāi)花，與栽培稻品種的花期相遇。
b.栽培稻與野生稻雜交 考慮到野生稻凌晨開(kāi)花，而花粉在30分鐘內(nèi)失活的特點(diǎn)和野生稻容易落粒的特性，以栽培稻為母本，于雜交前一日的下午去雄后套袋，以野生稻為父本，于開(kāi)花當(dāng)日的凌晨5:00 8:30取野生稻的開(kāi)花穗，將花粉抖落在已去雄的栽培稻穗子上完成授粉，然后套袋注明雜交的父母本及日期。
c.雜交后噴灑幼胚發(fā)育促進(jìn)液 授粉后的第2天 12天，每天下午打開(kāi)雜交袋向稻穗噴灑10mg/l 30mg/l 2，4一D+50mg/l 100mg/lGA3的幼胚發(fā)育促進(jìn)激素溶液，促進(jìn)雜交胚的發(fā)育。
d.胚挽救培養(yǎng) 授粉后的第7天一 12天取出雜交子房，經(jīng)消毒處理后，接種在N6 + 0.5mg/l 2.0mg/I NAA + 0.5mg/l 1.0mg/l 6-BA + 5%蔗糖+ 0.75%瓊脂的胚挽救培養(yǎng)基中，置于25°C，暗條件下培養(yǎng)。
e.雜交胚生長(zhǎng)出芽苗或愈傷組織 培養(yǎng)3 4周后，雜交胚一方面長(zhǎng)出芽苗，另一方面會(huì)誘導(dǎo)出愈傷組織，此時(shí)放在光照2000 LX, 10hr-12hr/d、25°C下培養(yǎng)7 10天，讓芽苗長(zhǎng)叢芽或愈傷組織旺盛長(zhǎng)大。
f.秋水仙素處理芽苗或愈傷組織 將生長(zhǎng)旺盛的叢芽苗置于N6 + 0.5mg/l 1.0mg/1 NAA + 1.5mg/l 2.0mg/1 6-BA+3%蔗糖+ 500mg/l 750mg/l秋水仙素的芽苗加倍培養(yǎng)基中；或者將生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織置于N6 + 0.3mg/l 0.5mg/l NAA + 0.5mg/l 1.0mg/1 6-BA +1.0mg/1 1.5mg/l 2,4-D+ 5%蔗糖+ 500mg/l 750mg/l秋 水仙素的愈傷組織加倍培養(yǎng)基中，置于溫室(25°C)，每分鐘50轉(zhuǎn)-60轉(zhuǎn)搖床上處理48hr_60hr.g.處理后芽苗或愈傷組織的恢復(fù)培養(yǎng) 取出加倍處理的芽苗或愈傷組織用無(wú)菌水沖洗三次，無(wú)菌濾紙吸干表面水分后，將芽苗轉(zhuǎn)接于 N6 + 0.5mg/l 1.0mg/1 NAA + 1.5mg/l 2.0mg/1 6-BA + 3%蔗糖 + 0.75%瓊脂的芽苗恢復(fù)培養(yǎng)基中，將愈傷組織轉(zhuǎn)接于N6 + 0.3mg/l 0.5mg/l NAA + 0.5mg/l 1.0mg/1 6-BA +1.0mg/1 1.5mg/l 2,4-D+ 5%蔗糖+ 0.75%瓊脂的愈傷組織恢復(fù)培養(yǎng)基中恢復(fù)培養(yǎng)7-10天。
h.芽苗的生根培養(yǎng)或愈傷組織的分化培養(yǎng) 將恢復(fù)的芽苗接種到 1/2MS+0.3mg/l 0.5mg/l 6-BA +0.3mg/l 0.5mg/l NAA+2%sucrose+0.75% agar的生根培養(yǎng)基中生根,7天 15天芽苗分化長(zhǎng)根而成為完整的小植株；將恢復(fù)的愈傷組織接種到MS+0.3mg/l 0.5mg/l NAA +1.5mg/l 2.0mg/1 6-BA+0.5mg/l 1.0mg/1 KT +3% sucrose + 0.75% agar 的分化培養(yǎng)基中，15 天 25 天后分化出苗，再轉(zhuǎn)接到芽苗生根培養(yǎng)基中分化出根而成為小植株。
1.組培苗的移植 將組培苗的瓶塞打開(kāi)，加入IOml 15ml的無(wú)菌水，置于實(shí)驗(yàn)室(20°C 25°C)，煉苗2天后，于下午4:30后，將組培苗用清水洗凈根部后移植于整平細(xì)的小苗床的水田中，罩上遮陽(yáng)網(wǎng)，保持苗床濕潤(rùn)，并于中午向遮陽(yáng)網(wǎng)內(nèi)噴施1/10MS大量元素和微量元素溶液連續(xù)5天，使秧苗正常生長(zhǎng)后打開(kāi)遮陽(yáng)網(wǎng)。
j.異源雜種苗的選擇 比較觀察栽培稻和野生稻親本及其雜種苗，從植株形態(tài)，葉片大小，葉鞘顏色，稻穗形狀，穎殼大小，芒的有無(wú)和長(zhǎng)短等形狀差異，初步挑選出栽培稻/野生稻異源雜種苗。
k.異源四倍體或異源六倍體水稻的確定 利用根尖染色制片技術(shù)，觀察異源雜種苗的根尖染色體數(shù)目，確定雜種是異源四倍體(如栽培稻(AA)與斑點(diǎn)野生稻(BB)雜種2n=4X=AABB=48)，或異源六倍體(如栽培稻(AA)與高桿野生稻(CXDD )的雜種，2n=6X=AA(XDD=72 )，然后再用基因組原位雜交技術(shù)(GISH)或不同基因組專有的分子標(biāo)記確定雜種是否為異源多倍體。
本發(fā)明通過(guò)調(diào)整野生稻花期使其與栽培稻開(kāi)花相遇而雜交，經(jīng)過(guò)激素處理促進(jìn)雜交胚發(fā)育，并通過(guò)胚挽救培養(yǎng)促進(jìn)雜種生長(zhǎng)成芽苗或誘導(dǎo)出愈傷組織，再通過(guò)秋水仙素處理芽苗或愈傷組織而獲得染色體加倍的芽苗或愈傷組織，經(jīng)過(guò)組培苗移栽而成為水稻植株，再通過(guò)形態(tài)特征觀察、細(xì)胞染色體數(shù)檢查、基因組原位雜交(GISH)和基因組專有標(biāo)記檢測(cè)而確定為異源雜種和異源多倍體。利用本發(fā)明已獲得6個(gè)基因組間20多個(gè)物種的異源雜種和異源多倍體，為開(kāi)拓栽培稻/野生稻雜交育種新途徑和充分利用野生稻有利基因提供了技術(shù)支持。


圖1為本發(fā)明胚挽救培養(yǎng)圖片， 圖2為本發(fā)明雜交胚生長(zhǎng)出芽苗及愈傷組織圖片， 圖3為本發(fā)明秋水仙素處理愈傷組織圖片， 圖4為本發(fā)明組織培養(yǎng)得到完整植株圖片， 圖5為本發(fā)明栽培稻/斑點(diǎn)野生稻的異源雜種苗(AB)圖片， 圖6為本發(fā)明異源四倍體水稻染色體數(shù)目觀察(2n=4X=AABB=48)圖片， 圖7為本發(fā)明基因組原位雜交(異源四倍體水稻AABB)圖片， 圖8為本發(fā)明栽培稻/高桿野生稻的異源雜種苗(ACD)圖片， 圖9為本發(fā)明異源六倍體水稻根尖染色體觀察(2n=6X=AACXDD=72)圖片。
`具體實(shí)施方式
下面以實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明: 1.栽培稻/斑點(diǎn)野生稻(AABB)異源四倍體的選育 a.暗處理野生稻會(huì)聚栽培稻開(kāi)花期 斑點(diǎn)野生稻(Oryza punctata")是典型的短日照植物，在亞熱帶到溫帶地區(qū)自然情況下，不能在栽培稻品種開(kāi)花時(shí)開(kāi)花。為了使兩類(lèi)親本的開(kāi)花期相遇，對(duì)斑點(diǎn)野生稻進(jìn)行短日照處理，即采用紅黑雙層布罩將具7片葉以上的斑點(diǎn)野生稻苗罩起來(lái)，使光照時(shí)期控制在8.5hr/d，共處理30天后，斑點(diǎn)野生稻進(jìn)入生殖生長(zhǎng)期而在8月上旬開(kāi)花，與栽培稻品種Sgdts96、HN2026和日本晴的花期相遇。
b.栽培稻與野生稻雜交 考慮到斑點(diǎn)野生稻凌晨開(kāi)花、花粉在30分鐘內(nèi)失活和容易落粒的特性，以栽培稻Sgdts96、HN2026和日本晴為母本，于雜交前一日的下午去雄后套袋，以斑點(diǎn)野生稻為父本，于開(kāi)花當(dāng)日的凌晨5:00 6:30取野生稻的開(kāi)花穗，將花粉抖落在已去雄的栽培稻穗子上完成授粉，然后套袋注明雜交的父母本及日期。
c.雜交后噴灑幼胚發(fā)育促進(jìn)液 授粉后的第2天 12天，每天下午打開(kāi)雜交袋向稻穗噴灑10mg/l 30mg/l2,4-D+50mg/l 100mg/lGA3的幼胚發(fā)育促進(jìn)液,促進(jìn)雜交胚的發(fā)育。
d.胚挽救培養(yǎng) 授粉后的第7天 12天取出雜交子房,經(jīng)消毒處理后,接種到N6 + 0.5mg/l 2.0mg/I 6-BA +0.5mg/l 2.0mg/1 NAA + 5%蔗糖+ 0.75%瓊脂的胚挽救培養(yǎng)基中，置于25°C，暗條件下培養(yǎng)(圖1)。
e.雜交胚生長(zhǎng)出芽苗或愈傷組織 培養(yǎng)3 4周后，雜交胚一方面長(zhǎng)出芽苗，另一方面會(huì)誘導(dǎo)出愈傷組織。此時(shí)在光照2000 LX, 10hr-12hr/d 25°C下培養(yǎng)7 10天，讓芽苗長(zhǎng)叢芽或愈傷組織旺盛長(zhǎng)大(圖2)。
f.秋水仙素處理芽苗或愈傷組織 將生長(zhǎng)旺盛的叢芽苗置于N6 + 0.5mg/l 1.0mg/1 NAA + 1.5mg/l 2.0mg/1 6-BA+ 3%蔗糖+ 500mg/l 750mg/l秋水仙素的芽苗加倍培養(yǎng)基中；或者將生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織置于 N6 + 0.3mg/l 0.5mg/l NAA + 0.5mg/l 1.0mg/1 6-BA+1.0mg/1 1.5mg/I 2，4-D+ 5%蔗糖+ 500mg/l 750mg/l秋水仙素的愈傷組織加倍培養(yǎng)基中，置于溫室(25°C )，每分鐘50轉(zhuǎn) 60轉(zhuǎn)搖床處理48hr 60hr (圖3).g.處理后芽苗或愈傷組織的恢復(fù)培養(yǎng) 取出加倍處理的芽苗或愈傷組織用無(wú)菌水沖洗三次，無(wú)菌濾紙吸干表面水分后，將芽苗轉(zhuǎn)接于 N6 + 0.5mg/l 1.0mg/1 NAA +1.5mg/l 2.0mg/1 6-BA + 3% 蔗糖 + 0.75%瓊脂的芽苗恢復(fù)培養(yǎng)基中，將愈傷組織轉(zhuǎn)接于N6 + 0.3mg/l 0.5mg/l NAA + 0.5mg/l 1.0mg/1 6-BA +1.0mg/1 1.5mg/l 2,4-D+ 5%蔗糖+ 0.75%瓊脂的愈傷組織恢復(fù)培養(yǎng)基中恢復(fù)培養(yǎng)7 10天。
h.芽苗的生根培養(yǎng)或愈傷組織的分化培養(yǎng) 將恢復(fù)的芽苗接種到 1/2MS + 0.3mg/l 0.5mg/l 6BA +0.3mg/l 0.5mg/l NAA +2%sucrose + 0.75% agar的生根培養(yǎng)基中生根而成為完整的小植株(圖4);將恢復(fù)的愈傷組織接種到 MS + 0.3mg/l 0.5mg/l NAA +1.5mg/l 2.0mg/1 6BA + 0.5mg/l 1.0mg/I KT +3%sucrose + 0.75%agar的分化培養(yǎng)基中分化出苗，再轉(zhuǎn)接到芽苗生根培養(yǎng)基中分化出根而成為小植株。
1.組培苗的移植 將組培苗的瓶塞打開(kāi)，加入15 ml無(wú)菌水，置于實(shí)驗(yàn)室(20°C 25 V )，煉苗2天后，于下午4:30后，將組培苗用清水洗凈根部后移植于整平細(xì)的小苗床的水田中，罩上遮陽(yáng)網(wǎng)，保持苗床濕潤(rùn)，并于中午朝遮陽(yáng)網(wǎng)內(nèi)噴施1/10MS大量元素和微量元素溶液，連續(xù)5天，使秧苗正常生長(zhǎng)后打開(kāi)遮陽(yáng)網(wǎng)。
j.異源雜種苗的選擇將雜種苗與栽培稻和斑點(diǎn)野生稻親本進(jìn)行觀察比較，從植株形態(tài)，葉片大小，葉鞘顏色，稻穗形狀，穎殼大小，芒的有無(wú)和長(zhǎng)短等性狀差異中，初步挑選出栽培稻/斑點(diǎn)野生稻的異源雜種苗(圖5)。
k.異源四倍體水稻的確定 利用根尖染色體制片技術(shù)，觀察異源雜種苗的根尖染色體數(shù)目，確定雜種是四倍體，即栽培稻(AA)與斑點(diǎn)野生稻(BB)雜種2n=4X=AABB=48 (圖6)。然后再用基因組原位雜交技術(shù)(GISH)(圖7)或BB基因組專有的分子標(biāo)記進(jìn)一步確定雜種為異源四倍體。
實(shí)施例2.栽培稻/高桿野生稻W(wǎng)ia)異源六倍體水稻的選育 a.暗處理野生稻會(huì)聚栽培稻開(kāi)花期 高桿野生稻(&TM alta)是典型的短日照植物，在亞熱帶到溫帶地區(qū)自然情況下，不能在栽培稻品種開(kāi)花時(shí)開(kāi)花。為了使兩類(lèi)親本的開(kāi)花期相遇，對(duì)高桿野生稻進(jìn)行短日照處理，采用紅黑雙層布罩將具7片葉以上的高桿野生稻苗罩起來(lái)，使光照時(shí)期控制在8.5 hr/d，共處理30天后，高桿野生稻進(jìn)入生殖生長(zhǎng)期而在8月上旬開(kāi)花，與栽培稻品種Sgdts96、HN2026和日本晴的花期相遇。
b.栽培稻與野生稻雜交 考慮到高桿野生稻凌晨開(kāi)花、花粉在30分鐘內(nèi)失活和容易落粒的特性，以栽培稻Sgdts96、HN2026和日本晴為母本，于雜交前一日的下午去雄后套袋，以高桿野生稻為父本，于開(kāi)花當(dāng)日的凌晨5:00 6:30取野生稻的開(kāi)花穗，將花粉抖落在已去雄的栽培稻穗子上完成授粉，然后套袋注明雜交的父母本及日期。
c.雜交后噴灑幼胚發(fā)·育促進(jìn)液 授粉后的第2天 12天,每天下午打開(kāi)雜交袋向稻穗噴灑10mg/l 30mg/l 2，4-D +50mg/1 100mg/lGA3的幼胚發(fā)育促進(jìn)液,促進(jìn)雜交胚的發(fā)育。
d.胚挽救培養(yǎng) 授粉后的第7天 12天取出雜交子房,經(jīng)消毒處理后,接種到N6 + 0.5mg/l 2.0mg/I 6-BA +0.5mg/l 2.0mg/1 NAA + 5%蔗糖+ 0.75%瓊脂的胚挽救培養(yǎng)基中，置于25 °C，暗條件下培養(yǎng)。
e.雜交胚生長(zhǎng)出芽苗或愈傷組織 培養(yǎng)3 4周后，雜交胚一方面長(zhǎng)出芽苗，另一方面會(huì)誘導(dǎo)出愈傷組織。此時(shí)在光照2000 LX, IOhr 12hr/d 25°C下培養(yǎng)7 10天，讓芽苗長(zhǎng)叢芽或愈傷組織旺盛長(zhǎng)大。
f.秋水仙素處理芽苗或愈傷組織 將生長(zhǎng)旺盛的叢芽苗置于N6 + 0.5mg/l 1.0mg/1 NAA + 1.5mg/l 2.0mg/1 6-BA+ 3%蔗糖+ 500mg/l 750mg/l秋水仙素的芽苗加倍培養(yǎng)基中；或者將生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織置于 N6 + 0.3mg/l 0.5mg/l NAA + 0.5mg/l 1.0mg/1 6-BA+l.0mg/1 1.5mg/l 2,4-D+ 5%蔗糖+ 500mg/l 750mg/l秋水仙素的愈傷組織加倍培養(yǎng)基中，置于溫室(25°C)，每分鐘50轉(zhuǎn) 60轉(zhuǎn)搖床處理48hr 60hr.g.處理后芽苗或愈傷組織的恢復(fù)培養(yǎng) 取出加倍處理的芽苗或愈傷組織用無(wú)菌水沖洗三次，無(wú)菌濾紙吸干表面水分后，將芽苗轉(zhuǎn)接于 N6 + 0.5mg/l 1.0mg/1 NAA +1.5mg/l 2.0mg/1 6-BA + 3% 蔗糖 + 0.75%瓊脂的芽苗恢復(fù)培養(yǎng)基中，將愈傷組織轉(zhuǎn)接于N6 + 0.3mg/l 0.5mg/l NAA + 0.5mg/l 1.0mg/1 6-BA +1.0mg/1 1.5mg/l 2,4-D + 5%蔗糖+ 0.75%瓊脂的愈傷組織恢復(fù)培養(yǎng)基中恢復(fù)培養(yǎng)7 10天。
h.芽苗的生根培養(yǎng)或愈傷組織的分化培養(yǎng) 將恢復(fù)的芽苗接種到 1/2MS+0.3mg/l 0.5mg/l 6BA + 0.3mg/l 0.5mg/l NAA +2%sucrose + 0.75% agar的生根培養(yǎng)基中生根而成為完整的小植株；將恢復(fù)的愈傷組織接種到 MS + 0.3mg/l 0.5mg/l NAA + 1.5mg/l 2.0mg/1 6BA +0.5mg/l 1.0mg/1 KT+3% sucrose + 0.75% agar的分化培養(yǎng)基中分化出苗，再轉(zhuǎn)接到芽苗生根培養(yǎng)基中分化出根而成為小植株。
1.組培苗的移植 將組培苗的瓶塞打開(kāi)，加入15 ml無(wú)菌水，置于實(shí)驗(yàn)室(20°C 25°C )，煉苗2天后，于下午4:30后，將組培苗用清水洗凈根部后移植于整平細(xì)的小苗床的水田中，罩上遮陽(yáng)黑網(wǎng)，保持苗床濕潤(rùn)，并于中午朝遮陽(yáng)網(wǎng)內(nèi)噴施1/10MS大量元素和微量元素溶液，連續(xù)5天，使秧苗正常生長(zhǎng)后打開(kāi)遮陽(yáng)網(wǎng)。
j.異源雜種苗的選擇 將雜種苗與栽培稻和高桿野生稻親本進(jìn)行觀察比較，從植株形態(tài)，葉片大小，葉鞘顏色，稻穗形狀，穎殼大小，芒的有無(wú)和長(zhǎng)短等性狀差異中，初步挑選出栽培稻/野生稻的異源雜種苗(圖8)。
k.異源六倍體水稻的確定 利用根尖染色體制片技術(shù)，觀察異源雜種苗的根尖染色體數(shù)目，確定雜種是異源四倍體，即栽培稻(AA)與高桿野生稻(CXDD)雜種2n=6X=AA(XDD=72 (圖9)；,然后再用基因組原位雜交技術(shù)(GISH)或CXDD 基因組專有的分子標(biāo)記進(jìn)一步確定雜種為異源六倍體。
權(quán)利要求
1.一種胚挽救和離體誘導(dǎo)相結(jié)合構(gòu)建異源多倍體水稻的方法，其特征在于該過(guò)程為: a暗處理野生稻會(huì)聚栽培稻開(kāi)花期 由于野生稻是典型的短日照植物，在亞熱帶到溫帶地區(qū)自然情況下，絕大多數(shù)野生稻物種不能在栽培稻品種開(kāi)花時(shí)開(kāi)花； 為了使兩類(lèi)親本的開(kāi)花期相遇，對(duì)野生稻進(jìn)行短日照處理，光照時(shí)間控制在8.5hr—.9.0hr/d，共處理30天，使野生稻進(jìn)入生殖生長(zhǎng)期相繼開(kāi)花，與栽培稻品種的花期相遇； b栽培稻與野生稻雜交 考慮到野生稻凌晨開(kāi)花，而花粉在30分鐘內(nèi)失活的特點(diǎn)和野生稻容易落粒的特性，以栽培稻為母本，于雜交前一日下午去雄后套袋，以野生稻為父本，于開(kāi)花當(dāng)日的凌晨5:00-8:30取野生稻的開(kāi)花穗，將花粉抖落在已去雄的栽培稻穗子上完成授粉，然后套袋注明雜交的父母本及日期； c雜交后噴灑幼胚發(fā)育促進(jìn)液 授粉后的第2天 12天，每天下午打開(kāi)雜交袋向稻穗噴灑10mg/l 30mg/l 2，4一D+50mg/1 100mg/lGA3的幼胚發(fā)育促進(jìn)液,促進(jìn)雜交胚的發(fā)育； d.胚挽救培養(yǎng) 授粉后的第7天 12天取出雜交子房,經(jīng)消毒處理后,接種到N6 + 0.5mg/l 2.0mg/16-BA +0.5mg/l 2.0mg/l NAA + 5%蔗糖+ 0.75%瓊脂的胚挽救培養(yǎng)基中，置于25°C，暗條件下培養(yǎng)； e.雜交胚生長(zhǎng)出芽苗或愈傷組織 培養(yǎng)3 4周后，雜交胚一方面長(zhǎng)出芽苗，另一方面會(huì)誘導(dǎo)出愈傷組織，此時(shí)在光照.2000 LX, 10hr-12hr/d 25°C下培養(yǎng)7 10天，讓芽苗長(zhǎng)叢芽或愈傷組織旺盛長(zhǎng)大； f.秋水仙素處理芽苗或愈傷組織 將生長(zhǎng)旺盛的叢芽苗置于N6 + 0.5mg/l 1.0mg/1 NAA + 1.5mg/l 2.0mg/1 6-BA+ 3%蔗糖+ 500mg/l 750mg/l秋水仙素的芽苗加倍培養(yǎng)基中；或者將生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織置于N6 + 0.3mg/l 0.5mg/l NAA + 0.5mg/l 1.0mg/1 6-BA+1.0mg/1 1.5mg/l 2,4-D+ 5%蔗糖+ 500mg/l 750mg/l秋水仙素的愈傷組織加倍培養(yǎng)基中，置于溫室(25°C)，每分鐘50轉(zhuǎn)-60轉(zhuǎn)搖床處理48hr_60hr.g.處理后芽苗或愈傷組織的恢復(fù)培養(yǎng) 取出加倍處理的芽苗 或愈傷組織用無(wú)菌水沖洗三次，無(wú)菌濾紙吸干表面水分后，將芽苗轉(zhuǎn)接于 N6 + 0.5mg/l 1.0mg/1 NAA +1.5mg/l 2.0mg/1 6-BA + 3% 蔗糖 + 0.75%瓊脂的芽苗恢復(fù)培養(yǎng)基中，將愈傷組織轉(zhuǎn)接于N6 + 0.3mg/l 0.5mg/l NAA + 0.5mg/l .1.0mg/1 6-BA +1.0mg/1 1.5mg/l 2,4-D+ 5%蔗糖+ 0.75%瓊脂的愈傷組織恢復(fù)培養(yǎng)基中恢復(fù)培養(yǎng)7-10天； h.芽苗的生根培養(yǎng)或愈傷組織的分化培養(yǎng) 將恢復(fù)的芽苗接種到 1/2MS + 0.3mg/l 0.5mg/l 6BA + 0.3mg/l 0.5mg/l NAA+ 2%sucrose + 0.75% agar的生根培養(yǎng)基中生根而成為完整的小植株；將恢復(fù)的愈傷組織接種到 MS + 0.3mg/l 0.5mg/l NAA +1.5mg/l 2.0mg/1 6BA +0.5mg/l 1.0mg/1KT +3%sucrose + 0.75% agar的分化培養(yǎng)基中分化出苗，再轉(zhuǎn)接到芽苗生根培養(yǎng)基中分化出根而成為小植株；.1.組培苗的移植 將組培苗的瓶塞打開(kāi)，加入IOml 15ml無(wú)菌水，置于實(shí)驗(yàn)室(20°C 25°C )煉苗2天，于下午4:30后，用清水洗凈組培苗根部后移植于整平細(xì)的小苗床水田中，罩上遮陽(yáng)網(wǎng)，保持苗床濕潤(rùn)，并于中午朝遮陽(yáng)網(wǎng)內(nèi)噴施1/10MS大量元素和微量元素溶液，連續(xù)5天，使秧苗正常生長(zhǎng)后打開(kāi)遮陽(yáng)網(wǎng)； j.異源雜種苗的選擇 將雜種苗與栽培稻和野生稻親本進(jìn)行觀察比較，從植株形態(tài)，葉片大小，葉鞘顏色，稻穗形狀，穎殼大小，芒的有無(wú)和長(zhǎng)短等性狀差異中，初步挑選出栽培稻/野生稻的異源雜種苗； k.異源多倍體或異源六倍體水稻的確定 利用根尖染色體制片技術(shù)，觀察異源雜種苗的根尖染色體數(shù)目，確定雜種是異源四倍體(如栽培稻(AA)與斑點(diǎn)野生稻(BB)雜種2n=4X=AABB=48)，或異源六倍體(如栽培稻(AA)與高桿野生稻(CCDD)的雜種，2n=6X=AACCDD=72)，然后再用基因組原位雜交技術(shù)(GISH)或不同基因組專有的分子 標(biāo)記確定雜種是否為異源多倍體。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種“胚挽救和離體誘導(dǎo)相結(jié)合構(gòu)建異源多倍體水稻的方法”，其步驟為a.暗處理野生稻使其會(huì)聚栽培稻開(kāi)花期；b.栽培稻與野生稻雜交；c.雜交后噴灑幼胚發(fā)育促進(jìn)液；d.胚挽救培養(yǎng)；e.雜交胚生長(zhǎng)出芽苗或愈傷組織；f.秋水仙素處理芽苗或愈傷組織；g.處理后芽苗或愈傷組織的恢復(fù)培養(yǎng)；h.芽苗的生根培養(yǎng)或愈傷組織的分化培養(yǎng)；i.組培苗的移植；j.異源雜種苗選擇；k.異源四倍體或異源六倍體水稻的確定。利用本發(fā)明可以獲得多個(gè)基因組間多個(gè)物種的異源雜種和異源多倍體，為栽培稻/野生稻雜交育種和充分利用野生稻有利基因開(kāi)拓了新途徑。
文檔編號(hào)A01H1/02GK103155854SQ20121044973
公開(kāi)日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2012年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月12日
發(fā)明者蔡得田, 王愛(ài)云, 楊春花, 杜超群, 張獻(xiàn)華, 陳冬玲, 宋兆建, 王維, 何玉池, 劉育華 申請(qǐng)人:湖北大學(xué), 武漢多倍體生物科技有限公司