一種獲得十字花科蔬菜新種質的方法及其應用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種獲得十字花科蔬菜新種質及應用方法，通過對十字花科‘大白菜亞種×小白菜亞種’或‘小白菜亞種×變種’蔬菜間雜交種進行游離小孢子培養(yǎng)獲得再生植株從而創(chuàng)造新種質并應用于育種的方法，主要步驟包括：‘大白菜亞種×小白菜亞種’、‘小白菜亞種×變種’蔬菜雜交過程，游離小孢子培養(yǎng)胚狀體誘導過程，胚狀體萌發(fā)獲得再生植株過程，對小孢子培養(yǎng)獲得的再生植株倍性鑒定過程，對雙單倍體、高倍體留種過程，種植再生植株的后代進行形態(tài)鑒定、營養(yǎng)指標鑒定過程，配制雜交組合過程。該方法具有周期短、效率高的優(yōu)點，為白菜類蔬菜高效育種提供了材料，具有廣闊的應用前景。
【專利說明】一種獲得十字花科蔬菜新種質的方法及其應用方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術與單倍體育種【技術領域】，具體說，涉及一種通過游離小孢子培養(yǎng)方法快速獲得十字花科蔬菜新種質并應用于育種的方法。
【背景技術】
[0002]十字花科(2n=2x=20)蔬菜，分為小白菜亞種和大白菜亞種，小白菜亞種包括奶白菜、烏塌菜、菜心、小菘菜、油菜、矮腳黃、蕾用菜等，此亞種的特點為葉片開張、株型矮小、具明顯的葉柄，多數葉片光滑無毛，無明顯葉翼，不形成明顯葉球。大白菜亞種分化為散葉變種半結球變種、花心變種、結球變種，特點為株型較大，有明顯的葉柄和葉翼，葉面多不光滑、除散葉變種外，均可形成葉球。亞種之間和亞種內變種之間蔬菜性狀差異很大，由于染色體條數一樣，亞種之間和亞種內變種之間雜交不存在障礙，易獲得種子。通過有性雜交可以將不同亞種、變種蔬菜的優(yōu)點綜合起來，雜交后代在基因型上是高度雜和的，而優(yōu)勢雜交育種中需要的高度純和的親本，用常規(guī)方法自交、分離選擇再連續(xù)自交好幾個世代，費工、費時。隨著人們生活水平的提高，傳統(tǒng)方法用變種內、品種間雜交，難以滿足市場需要的高產、優(yōu)質、形狀新奇的蔬菜的要求，而對亞種之間和亞種內變種之間雜種進行游離小孢子培養(yǎng)則可以快速獲得雙單倍體純系，且純系之間差異很大，提供了更大的選擇范圍，解決這一問題，滿足育種工作的需要。
[0003]截止目前，在幾乎所有蕓薹屬作物上均有小孢子培養(yǎng)成功的報道，1989年，日本學者Sato等在進行大白菜游離小孢子培養(yǎng)時獲得了再生植株，1992年，曹鳴慶等首次報道小白菜游離小孢子培養(yǎng)獲得成功，1996年，李光濤獲得了紫菜薹再生植株，此外，烏塌菜等也有培養(yǎng)成功的報道。基于十字花科作物亞種之間和亞種內變種蔬菜間雜交不存在障礙和在小孢子培養(yǎng)方面取得的進展，本發(fā)明以蕓薹屬‘大白菜亞種X小白菜亞種’、‘小白菜亞種X變種’雜交種作為小孢子培養(yǎng)的供體植株，對小孢子培養(yǎng)體系進行大量的試驗，獲得了很多再生植株，配制了雜交組合。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明要解決的問題是提供一種獲得十字花科蔬菜新種質的方法及其育種方法，是將傳統(tǒng)的有性雜交技術和細胞培養(yǎng)技術結合起來，進行亞種之間和亞種內變種之間蔬菜雜交，通過游離小孢子培養(yǎng)方法對F1或經篩選的符合育種目標的F2培養(yǎng)，從而獲得再生植株，并應用于育種。
[0005]為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案是:一種獲得十字花科蔬菜新種質的方法，其包括如下步驟:
[0006](1)對蕓薹屬‘大白菜亞種X小白菜亞種’或‘小白菜亞種X變種’蔬菜進行雜交獲得種子，種植F1并自交獲得F2 ；
[0007](2)在溫室中培養(yǎng)FjP F2, FjP F2的種子經過2~4°C低溫處理20-25天，在開花期對F1和F2代中篩選出的符合育種目標的植株進行游離小孢子培養(yǎng)，接種小孢子后需33°C暗培養(yǎng)I天，再轉至25°c培養(yǎng)箱靜置暗培養(yǎng)10~15天，肉眼可見胚狀體后，將培養(yǎng)皿轉移到轉數為40~60轉/分鐘搖床上繼續(xù)暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25°C ；
[0008](3)將子葉期胚狀體轉接到MS培養(yǎng)基以獲得再生植株；
[0009](4)將再生植株接種到MS培養(yǎng)基上進行人工誘導生根，待再生植株生根后，移栽到溫室，溫室溫度白天應為20~25°C，夜間溫度應為于5~10°C ；
[0010](5)經50-70天后，再生植株開始開花，鑒定再生植株倍性，單倍體植株用秋水仙堿處理，使其加倍，雙單倍體植株、高倍體植株保留；
[0011](6)對雙單倍體植株、高倍體植株自交授粉,獲得種子，同時測定親和指數；
[0012](7)種植雙單倍體、高倍體自交種子，根據育種目標，鑒定植株株高、葉長、葉色等外觀性狀，鈣、鎂、維生素C諸營養(yǎng)指標，抗病、抗逆性。
[0013]在步驟(2)中，對F1和F2植株進行游離小孢子培養(yǎng)，選取花瓣長度與花藥長度比值為0.5~0.75的未開放花蕾，在超凈工作臺內表面滅菌后，用蒸流水沖洗3遍，倒入蔗糖濃度為130g/L的B5培養(yǎng)基，擠碎花蕾，使小孢子游離出來，含小孢子的懸浮液用400目孔徑的尼龍網過濾,收集濾液于IOmL離心管中，1000rpm離心3min ;棄去上清液，重復2次；用NLN培養(yǎng)基稀釋小孢子，接種細胞密度IX IO5~2 X IO5個.πι?Λ以每皿5mL小孢子懸浮液分裝入60mm X 15mm的無菌玻璃培養(yǎng)皿內，每皿添加100 μ L高溫濕熱滅菌后的瓊脂糖0.5g/L、活性炭10g/L混合液；NLN培養(yǎng)基為含130g/L蔗糖，無任何激素的NLN培養(yǎng)基，或在NLN培養(yǎng)基添加0.2mg/L~0.25mg/L的6-BA，或在NLN培養(yǎng)基添加0.2mg/L~0.25mg/L的6-BA與NAA。
[0014]在步驟(3)中，誘導再生植株的MS培養(yǎng)基為含蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L^7.5g/L，pH值為6.0，無任何激素的MS培養(yǎng)基；D步驟中，生根培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，含蔗糖30g/L，瓊脂 5.0g/L, NAA0.2mg/L, pH 值為` 6.0。
[0015]一種根據權利要求1所述的一種獲得十字花科蔬菜新種質的應用方法，將雙單倍體品系直接作為品種應用，或作為親本與雄性不育系配制雜交組合，或者選兩個自交不親和系配制雜交組合。
[0016]本發(fā)明具有的優(yōu)點和積極效果是:與常規(guī)方法品種內雜交相比，采用蕓薹屬‘大白菜亞種X小白菜亞種’或‘小白菜亞種X變種’雜交，可以獲得更多有利用價值的蔬菜新類型；與常規(guī)連續(xù)多代自交的方法獲得純系比較，游離小孢子培養(yǎng)的方法培育純系周期短，效率高，一代就可以獲得雙單倍體純系；游離小孢子方法獲得的純系間差異較大，提高了獲得符合育種目標純系的機率；本發(fā)明獲得的純系，具有廣闊的應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是親本烏塌菜形態(tài)照片示意圖；
[0018]圖2是親本大白菜形態(tài)照片示意圖；
[0019]圖3是‘大白菜與烏塌菜’的雜交種F1(小孢子培養(yǎng)供體材料)形態(tài)照片示意圖；
[0020]圖4是‘大白菜與烏塌菜’的雜交種F1小孢子培養(yǎng)獲得的再生植株之一形態(tài)照片示意圖；
[0021]圖5是‘大白菜與烏塌菜’的雜交種F1小孢子培養(yǎng)獲得的再生植株之二的形態(tài)照片不意圖；[0022]圖6是‘大白菜與烏塌菜’的雜交種F1小孢子培養(yǎng)獲得的再生植株之三形態(tài)照片示意圖。
【具體實施方式】
[0023]本發(fā)明提供的獲得十字花科蔬菜新種質并應用于育種的方法包括:‘大白菜亞種X小白菜亞種’、‘小白菜亞種X變種’雜交過程，游離小孢子培養(yǎng)過程，對小孢子培養(yǎng)獲得的再生植株倍性鑒定，對雙單倍體、高倍體留種過程，種植再生植株的后代進行形態(tài)鑒定、營養(yǎng)指標鑒定過程，配制雜交組合過程。
[0024]具體方法步驟如下:
[0025](1)蕓薹屬‘大白菜亞種X小白菜亞種’或‘小白菜亞種X變種’雜交過程:根據育種目標，確定親本，開花期雜交，獲得F1種子，種植F1,自交獲得& ;親本選定為:大白菜(見圖1照片)、烏塌菜(見圖2照片)、蕾用菜、矮腳黃。
[0026]游離小孢子培養(yǎng)材料分別是‘大白菜X烏塌菜’(見圖3照片)、‘烏塌菜X蕾用菜’以及‘烏塌菜X矮腳黃'F1代以及F2代植株。
[0027](2)游離小孢子培養(yǎng)過程:
[0028]從2009年9月初開始，每隔一個月分批對F1和F2種子催芽，萌動后進行2~4°C低溫處理20~25天，然后將萌動種子播于穴盤，5飛片葉時栽植于花盆在溫室中培育。在開花期進行游離小孢子培養(yǎng)，小孢子分離方法選取花瓣長度與花藥長度比值為0.5^0.75的未開放花蕾，以30個為一組，流水沖洗30min，經70%乙醇溶液表面消毒30s后，用0.1 %HgCl2溶液消毒8min，用蒸餾水沖洗3次，每次5min。消毒后的花蕾放入滅過菌的小燒杯內，加少量蔗糖含量為13(^/1的B5培養(yǎng)基，用無菌研棒碾壓花蕾，擠出小孢子。含小孢子的懸浮液用40 μ m孔徑的尼龍網過濾，除出大組織塊,收集濾液于IOmL離心管中，1000rpm下離心3min。棄去上清液,沉淀物加5mL B5洗漆培養(yǎng)基,搖勻，1000rpm下離心3min。棄去上清液，重復2次，所得沉淀物即為純凈小孢子。小孢子培養(yǎng):將純化后的小孢子用NLN培養(yǎng)基稀釋，保持細胞密度1 X 1O5~2 X 1O5個.mL-1以每皿5mL小孢子懸浮液分裝入為60mmX 15mm的無菌玻璃培養(yǎng)皿內，每皿添加100 μ L高溫濕熱滅菌后的瓊脂糖0.5g/L、活性炭10g/L混合液；用石蠟膜封口，先在33°C恒溫箱中暗培養(yǎng)1天，，再轉至25°C下靜置暗培養(yǎng)。10~15天后，肉眼可見胚狀體出現，轉移到40~60轉/分鐘搖床上繼續(xù)暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為250C。NLN培養(yǎng)基為含130g/L蔗糖，無任何激素的NLN培養(yǎng)基，或在NLN培養(yǎng)基添加0.2mg/L~0.25mg/L 的 6-BA，或在 NLN 培養(yǎng)基添加 0.2mg/l~0.25mg/L 的 6-BA 與 NAA。
[0029](3)植株再生過程
[0030]將子葉期胚狀體接種到MS培養(yǎng)基上。于25°C，16h/8h光周期下培養(yǎng)。MS培養(yǎng)基為含蔗糖30g/L，瓊脂6.5δ/1~7.5g/L，pH值為6.0,無任何激素的MS培養(yǎng)基，獲得再生植株。
[0031](4)再生植株的生根及移栽
[0032]小孢子胚狀體形成的再生植株，自然生根的根系較弱，不易成活，需要進行人工誘導生根，將其接種到MS培養(yǎng)基上，MS培養(yǎng)基含蔗糖30g/L，瓊脂5.0g/L, NAA0.2mg/L, pH值為 6.0。
[0033]根系發(fā)育較好的植株移栽到溫室。此時，溫室內溫度白天應為20~25°C，晚間溫度應為5~10°C ；
[0034](5)倍性鑒定過程
[0035]經50-70天后，再生植株開始開花，鑒定再生植株倍性，單倍體植株用秋水仙堿處理，使其加倍，雙單倍體植株、高倍體植株保留。
[0036](6)對雙單倍體植株、高倍體植株自交授粉,獲得種子，同時測定親和指數；
[0037](7)種植雙單倍體、高倍體自交種子，根據育種目標，鑒定植株株高、葉長、葉色等外觀性狀，鈣、鎂、維生素C等營養(yǎng)指標，抗病、抗逆性；
[0038]應用方法:根據市場的需要將雙單倍體品系直接作為品種應用，或作為親本與雄性不育系配制雜交組合，或者選兩個自交不親和系配制雜交組合。
[0039]試驗結果
[0040]1、同基因型雜交組合小孢子培養(yǎng)胚誘導結果
[0041]基因型是影響小孢子胚發(fā)生的重要因素，在培養(yǎng)基都是NLN時，供試材料均獲得了胚狀體，但不同親本雜交所得的F1代小孢子胚的誘導率差異很大(表1)，F2代由于各單株間胚狀體誘導率不同，未做統(tǒng)計分析。
[0042]表1不同供體材料對小孢子胚狀體誘導率的影響
[0043]
【權利要求】
1.一種獲得十字花科蔬菜新種質的方法，其特征在于包括如下步驟: (1)對蕓薹屬‘大白菜亞種X小白菜亞種’或‘小白菜亞種X變種’蔬菜進行雜交獲得種子，種植F1并自交獲得F2; (2)在溫室中培養(yǎng)F1和F2,F1和F2的種子經過2~4°C低溫處理20-25天，在開花期對F1和F2代中篩選出的符合育種目標的植株進行游離小孢子培養(yǎng)，接種小孢子后需33°C暗培養(yǎng)I天，再轉至25°C培養(yǎng)箱靜置暗培養(yǎng)10~15天，肉眼可見胚狀體后，將培養(yǎng)皿轉移到轉數為40~60轉/分鐘搖床上繼續(xù)暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25°C ； (3)將子葉期胚狀體轉接到MS培養(yǎng)基以獲得再生植株； (4)將再生植株接種到MS培養(yǎng)基上進行人工誘導生根，待再生植株生根后，移栽到溫室，溫室溫度白天應為20~25°C，夜間溫度應為于5~10°C ； (5)經50-70天后，再生植株開始開花，鑒定再生植株倍性，單倍體植株用秋水仙堿處理，使其加倍，雙單倍體植株、高倍體植株保留； (6)對雙單倍體植株、高倍體植株自交授粉，獲得種子，同時測定親和指數； (7)種植雙單倍體、高倍體自交種子,根據育種目標,鑒定植株株高、葉長、葉色等外觀性狀，鈣、鎂、維生素C諸營養(yǎng)指標，抗病、抗逆性。
2.根據權利要求1所述的一種獲得十字花科蔬菜新種質的方法，其特征在于:在步驟(2)中，對F1和F2植株進行游離小孢子培養(yǎng)，選取花瓣長度與花藥長度比值為0.5~0.75的未開放花蕾，在超凈工作臺內表面滅菌后，用蒸流水沖洗3遍，倒入蔗糖濃度為130g/L的B5培養(yǎng)基，擠碎花蕾，使小孢子游離出來，含小孢子的懸浮液用400目孔徑的尼龍網過濾，收集濾液于IOmL離心管中，10 00rpm離心3min ;棄去上清液，重復2次；用NLN培養(yǎng)基稀釋小孢子，接種細胞密度I X IO 5~2 X IO5個.πι?Λ以每皿5mL小孢子懸浮液分裝入60mmX 15mm的無菌玻璃培養(yǎng)皿內，每皿添加100 μ L高溫濕熱滅菌后的瓊脂糖0.5g/L、活性炭10g/L混合液；NLN培養(yǎng)基為含130g/L蔗糖，無任何激素的NLN培養(yǎng)基，或在NLN培養(yǎng)基添加0.2mg/1~θ.25mg/L 的 6-BA，或在 NLN 培養(yǎng)基添加 0.2mg/l~0.25mg/L 的 6-BA 與 NAA。
3.根據權利要求1所述的一種獲得十字花科蔬菜新種質的方法，其特征在于:在步驟(3)中，誘導再生植株的MS培養(yǎng)基為含蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L~7.5g/L，pH值為6.0，無任何激素的MS培養(yǎng)基；D步驟中，生根培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，含蔗糖30g/L，瓊脂5.0g/L,NAA0.2mg/L, pH 值為 6.0。
4.一種根據權利要求1所述的一種獲得十字花科蔬菜新種質的應用方法，其特征在于:將雙單倍體品系直接作為品種應用，或作為親本與雄性不育系配制雜交組合，或者選兩個自交不親和系配制雜交組合。
【文檔編號】A01H4/00GK103798125SQ201210455776
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年11月13日 優(yōu)先權日:2012年11月13日
【發(fā)明者】趙宗武 申請人:天津子豐種業(yè)有限公司