專利名稱:人參PgPDR3基因及其編碼蛋白在調(diào)控人參皂苷轉運與積累中的應用的制作方法
技術領域:
本發(fā)明屬于生物基因工程技術領域,涉及改良植物性狀,具體是促人參皂苷生物合成、轉運與積累的相關基因及其蛋白和應用。本發(fā)明在提高人參等植物中人參皂苷含量方面有著重要的應用價值。
背景技術:
人參(P. ginseng C. A. Meyer)為五加科人參屬多年生草本植物,是名貴中藥材。人參中含有多種藥用成分,其中人參皂苷是人參最主要的活性成分。目前已從人參根中分離出50余種人參皂苷,現(xiàn)代醫(yī)學研究證明各皂苷單體具有重要的藥用價值,且已廣泛應用于臨床。但是其中一些具有抗腫瘤、抗衰老、抑制細胞凋亡和增強免疫力等活性強的皂苷含量極低。近年來,國內(nèi)外對利用人參細胞培養(yǎng)等技術生產(chǎn)人參皂苷進行了廣泛和深入的研究,但其含量仍較低,遠不能滿足市場的需求。在植物次生代謝調(diào)控中,可以通過導入關鍵酶等基因調(diào)控合成途徑中的多步限速反應,并促進次生代謝產(chǎn)物的合成;或通過誘導跨膜轉運蛋白將合成的代謝產(chǎn)物轉運到細胞外或細胞器中得以積累,利用轉運系統(tǒng)使合成代謝向積累方向轉變,從而提高次生代謝產(chǎn)物含量。通過人參皂苷的轉運機制,進而促進人參皂苷合成與積累,有望成為人參皂苷高產(chǎn)調(diào)控的新策略。植物ABC (ATP-binding cassette transporter)轉運蛋白是目前已知最大,功能最廣泛的蛋白家族,ABC轉運蛋白屬于跨膜運輸?shù)鞍祝盟釧TP釋放的能量轉運有機酸、生物堿、細胞代謝產(chǎn)物和藥物等。參與細菌耐藥性、次生代謝產(chǎn)物積累、脅迫反應和腫瘤抗藥性等。ABC轉運蛋白家族包括多向耐藥性蛋白(pleiotropic drug resistance,PDR),多藥耐藥性蛋白(multidrug resistance, MDR)等。PDR是其中最大的亞族,是植物和真菌中特有的一種ABC轉運蛋白。但目前對植物PDR基因相關研究甚少,離體細胞培養(yǎng)中,香紫蘇醇可誘導NpTORl基因上調(diào)表達,在細胞內(nèi)NpTORl蛋白累積增強了細胞向胞外轉運香紫蘇醇以及其類似物的能力。擬南芥(A. thaliana)細胞內(nèi)香紫蘇醇的累積亦能誘導AtH)R12基因上調(diào)表達,同時在細胞外檢測到AtH)R12蛋白向胞外轉運的香紫蘇醇,推測萜類物質(zhì)可能是AtH)R12基因表達的上游調(diào)控物質(zhì)。因此,PDR蛋白可能通過轉運內(nèi)源性抗真菌二萜類物質(zhì)參與植物防御反應。此外,尚無植物PDR蛋白轉運更復雜萜類分子的報道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種能夠調(diào)控人參皂苷轉運與積累相關的基因、由該基因編碼的蛋白及其應用,為今后開發(fā)基因工程產(chǎn)品奠定基礎。為了達到上述目的,本發(fā)明提供的技術方案為本發(fā)明提供了一種人參PgPDR3基因,基因序列如SEQ ID NO. I所示。本發(fā)明還提供了一種用于擴增PgPDR3基因的簡并引物對,所述引物對如SEQ IDNO. 5 和 SEQ ID NO. 6 所示。本發(fā)明還提供了含有PgPDR3基因重組載體,具體包括植物表達載體PBI121,gp,將PgPDR3基因克隆到空載體PBI121中,獲得重組載體pBI121_PgPDR3 ;原核表達載體pET28a,即,將PgPDR3基因克隆到空載體pET28a中,獲得重組載體pET28a-PgPDR3。PgPDR3基因亦可克隆到其他空載體中,或制備成轉基因細胞及重組菌。本發(fā)明還提供了 PgPDR3基因在調(diào)控人參皂苷轉運與積累中的應用;PgPDR3基因在人參育種中的應用。本發(fā)明還提供了一種由SEQ ID NO. I所不PgPDR3基因編碼的蛋白,該蛋白的序列如 SEQ IDN0. 2 所示。
本發(fā)明還提供了 SEQ ID NO. 2所示蛋白在調(diào)控人參皂苷轉運與積累中的應用,以及該蛋白在人參育種中的應用。本發(fā)明利用現(xiàn)有的植物基因工程技術,利用植物PDR基因同源性設計簡并引物,利用cDNA-AFLP及RACE技術,分離與鑒定人參皂苷轉運與積累相關的基因序列,并通過根癌農(nóng)桿菌介導法將基因轉入煙草,經(jīng)過異源表達鑒定證明PgPDR3基因對人參皂苷的轉運功能。本發(fā)明人參ABC轉運蛋白基因PgPDR3序列如SEQ ID NO. I所示,其編碼的蛋白序列如SEQ ID NO. 2所示。研究發(fā)現(xiàn)PgPDR3基因表達具有組織特異性且與人參皂苷的積累有關。初步表明所述PgPDR3基因具有促進人參皂苷合成、轉運和積累方面的功能??梢酝ㄟ^該基因或其衍生物篩選或改良人參甚至其它植物,獲得人參皂苷含量高的優(yōu)良植物品種。亦可以采用人參組織培養(yǎng)或轉基因植物生產(chǎn)Rb、Re和Rg等人參皂苷單體。
圖I是本發(fā)明的PCR擴增PgPDR3基因圖示;圖中,I表示簡并引物PCR擴增產(chǎn)物,M 表不 Marker ;圖2是本發(fā)明的PgPDR3蛋白跨膜結構域預測圖;圖3是本發(fā)明的PgPDR3基因編碼氨基酸序列及其與其它植物PDR基因同源性比較圖;圖4是本發(fā)明的PgPDR3基因編碼氨基酸序列進化樹分析圖;圖5是本發(fā)明的PgPDR3基因在人參不同組織中的表達水平圖;圖6是本發(fā)明的PgPDR3基因在ΙΟΟμΜ MeJA誘導條件下的人參細胞中表達水平圖。
具體實施例方式實施實例I PgPDR3基因的獲得I、人參懸浮細胞培養(yǎng)(I)取吉林長白山人參產(chǎn)區(qū)四年生人參根,自來水浸泡45min后沖洗2次,先用75%乙醇浸泡30秒(sec),無菌水沖洗2次,無菌室超凈工作臺上用O. l%HgCl2消毒,不斷攪動,無菌蒸餾水沖洗4-5次。(2)在無菌條件下,將消毒過的外植體接種到含有2,4_D (2. Omg/L)和KT (O. 5mg/L)的MS培養(yǎng)基中。經(jīng)3次繼代培養(yǎng)后外植體完全脫分化,待完全形成愈傷組織后,每IOOml三角瓶接種6個外植體,培養(yǎng)條件如前述,培養(yǎng)45天(d)后將愈傷組織行繼代培養(yǎng),以補充培養(yǎng)物所需的營養(yǎng)物質(zhì)和其它要求。接種30d后進行第一次繼代培養(yǎng),以后每3-4周繼代一次。(3)當?shù)玫接鷤M織后,將其轉入到MS液體培養(yǎng)基中。愈傷組織塊直徑應小于3mm。若組織塊較大可用無菌解剖刀將其分割成小塊。液體培養(yǎng)基分裝在50ml的錐形瓶內(nèi),每IOml液體培養(yǎng)基接種I. 5-2. Og愈傷組織,接種后震蕩培養(yǎng),120rpm, 24°C,暗培養(yǎng)。每隔
4-7d繼代一次。2、細胞處理及其RNA提取(I)細胞處理
I)取460 μ L茉莉酸甲酯(Me JA )溶于4540 μ L乙醇,加5ml雙蒸水至IOml,配成IOml 200mM的MeJA母液,用O. 22 μ m的濾器過濾除菌,處理組每IOml液體培養(yǎng)基加入10 μ L母液至終濃度為200 μ M ;取4540 μ L乙醇加入雙蒸水中定容至IOml做為對照,用
O.22 μ m的濾器過濾除菌后,對照組每IOml液體培養(yǎng)基加入10 μ L。2)在懸浮細胞繼代的48h后按以上方法處理處理組與對照組的細胞,120rpm,24°C,振蕩暗培養(yǎng),培養(yǎng)24h后分別提取處理組的對照組的人參細胞的總RNA。(2)人參懸浮細胞總RNA提?、?000 Xg離心5min收集的懸浮細胞,在研缽內(nèi)用液氮充分研磨成粉末。每40mg研磨的粉末置于1.5ml離心管中,加入Iml TRIzoI試劑,40 μ L β-巰基乙醇,用移液器吸頭重懸細胞沉淀,室溫孵育5-10min。②加入O. 2ml氯仿,振搖15sec,室溫孵育10_15min。③4°C、12000Xg離心15min,收集上層無色水相于I. 5ml離心管中,勿吸動中間
層,棄沉淀。④加入0.4ml 3mol/L醋酸銨(ρΗ5· 2),O. 6ml異丙醇,輕柔振蕩混勻,室溫孵育
5-10min(RNA 沉淀)。4°C、12000 X g 離心 IOmin,棄上清。⑤加入Iml 75%乙醇并振蕩;4°C,7500Xg離心5min,棄上清,重復該步驟。⑥空氣中干燥lOmin,加入20 μ L DEPC水溶解RNA。⑦RNA的非變性瓊脂糖凝膠電泳在O. 5XTBE中進行,瓊脂糖濃度為1%(每IOOml凝膠中加入2. 5 μ L的10mg/ml EB), 4 μ L上樣量,8v/cm恒壓40min,然后在紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察所提取RNA的完整性。(3)mRNA 的純化①取人參懸浮細胞總RNA200 μ g,用DEPC水補至500 μ L,65°C水浴IOmin后,加入3μ L生物素酰化的oligo (dT)探針與13 μ L20 X SSC溶解并孵育至室溫,使生物素酰化的oligo(dT)探針與mRNA分子poly(A)尾充分雜交。②懸浮于管中的鏈親和順磁珠(Stroptavidin-ParamagneticParticles,SA-PMPs)用0. 5 X SSC溶液洗滌3次,0. 3ml/次,然后重懸于0. Iml 0.5 X SSC中。③將上述經(jīng)處理的RNA溶液與SA-PMPs混合,室溫孵育lOmin,每12min混勻一次,用磁力架收集含有RNA的SA-PMPs,棄上清。④用0. IXSSC溶液重復洗滌SA-PMPs 4次,其中0. 3ml/次,用磁力架收集SA-PMPs并棄上清。⑤加入100 μ L DEPC水重懸SA-PMPs,磁力架收集SA-PMPs,吸取水相。再加入150 μ L DEPC水重懸SA-PMPs,磁力架收集SA-PMPs,吸取水相。
⑥收集合并以上兩次的水相,加入1/10體積3M NaAc和等體積異丙醇,震蕩混勻,-20°C靜置Ih0⑦4°C, 12000 X g 離心 20min,棄上清。⑧用75%乙醇8000\區(qū),5111;[11,洗漆沉淀兩次,Iml/次。⑨mRNA空氣中自然干燥lOmin,用20 μ LDEPC水溶解。3、cDNA 合成純化mRNA后,以oligo (dT)為引物,M-MuLV反轉錄酶反轉錄總mRNA。(I)反應體系如下
Template mRNA (200 η g/μ L) IO μ _.
5x1 strand synthesis buffer4 μΕ
dNTP mixture (.10 mM)I μL
RNase InhibitorI pL
oligo(dT) (50 μΜ)2 μ ,
M~MLV(200U/^iL)I μ
RNase-free H2OI μ L
Total volume20 μ (2)輕柔攪拌混勻;室溫放置IOmin后,移至恒溫水浴箱;42°C,Ih ;結束后,冰上冷去P 2min。4、cDNA-AFLP(I) cDNA第二鏈的合成以及末端平滑化①在第一條cDNA合成后的離心管中按下列順序配制合成cDNA第二條鏈的反應液
合成cDNA第一條鏈的反應液 20 μ ,
5>-2 strand synthesis buffer30 μL
dNTP (IOmM )3 μL
RNase-free Η089 μL
I:, coIi DNA polymerase I2 μL
lixoli RNase HI μΕ
E.coli DNA ligaseI μΕ②16°C 反應 2h。③70°C加熱 IOmin。④加入4 μ L 的 T4DNA Ploymerase,輕輕攬拌。⑤37O 反應 IOmin。⑥加入15 μ L的0. 25Μ EDTA (ρΗ8. 0)以及15 μ L的10%SDS溶液,終止反應。(2 )合成的cDNA的精制
①在上述反應液中加入等量(180 μ L)的苯酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)溶液。②劇烈振蕩混勻。③在室溫條件下12000Xg離心5min,液體分為三層。小心取出水相(上層),移至另外一個新的I. 5ml離心管中。④向水相中加入等量的氯仿/異戊醇(24 :1)溶液,劇烈振蕩混勻。⑤在室溫下12000 Xg離心5min,液體分為二層。小心取出水相移至另外一個新的
I.5ml離心管中。
⑥加入150 μ L的4M醋酸銨,2. 5體積的乙醇,充分混勻,室溫下放置lOmin。⑦在4°C下14000父8離心2011^11,去上清。⑧用Iml 70%乙醇8000 Xg離心5min,重復2次。⑨用適量的TE緩沖液溶解。(3)cDNA 酶切消化①將上一實驗步驟合成的cDNA與以下試劑混合于I. 5ml的反應管中
5 xTeaction buffer5 μL
cDNA(250 ng)I I liL
1\coR MMse I2 μL
ddH207 pL②輕柔混勻后短暫離心,370C,水浴2h。③70°C,水浴15min結束酶切反應。(4)接頭連接①在上一步的反應管中加入24 μ L adapter ligation solution和 I μ L 的 T4DNAligase。②輕柔混勻后短暫離心,20°C左右水浴2h。③將10 μ L反應液轉移至I. 5ml的離心管中,加入90 μ L的TE緩沖液,使連接反應液稀釋10倍,輕柔混勻后短暫離心。④連接反應液于_20°C保存。(5 ) cDNA-AFLP預擴增、選擇性擴增和電泳分析將連接接頭的產(chǎn)物稀釋10倍,進行預擴增。預擴增引物為EcoRI引物5,-GACTGCGTACCAATTCA-3’ (SEQ ID NO. 3), Mse I 引物5,-GATGAGTCCTGAGTAAC-3,(SEQ ID NO. 4);預擴增反應條件為94°C,30s,56°C,lmin,72°C,lmin,20 個循環(huán)。將預擴增產(chǎn)物稀釋20倍,再選用8條選擇性擴增E引物和8條M引物進行選擇性擴增。其中8條E引物與預擴增的EcoR I引物匹配,8條M引物與Mse I引物匹配;每條選擇性EcoR I引物(E引物)分別與選擇性Mse I引物(M引物)進行組合,共有64個引物對組合。用于選擇性擴增的引物如下E 引物為 5’ -GACTGCGTACCAATTCA-3’ 序列的 3’ 端分別加 AC、AG、CA、CT、CC、CG、GC 和 GG) ;M 引物 5’ -GATGAGTCCTGAGTAAC-3,序列的 3,分別加 AA、AC、AG、AT、TA、TC、TG
和 TT)。cDNA-AFLP 選擇性擴增米用 “touchdown”PCR,條件為94°C,lmin ;94°C, 30sec,65°C,lmin,72°C,90sec;每循環(huán)一次,退火溫度降低1°C,至56°C后循環(huán)23次。對照組和MeJA處理組的各引物組合均重復3次選擇性擴增反應。然后將三次重復反應產(chǎn)物合并,力口入1/10體積的3M NaAc,再加入3倍體積預冷的無水乙醇沉淀;70%乙醇洗2次,沉淀重懸于20 μ L雙蒸水,2%瓊脂糖凝膠電泳分析。
(6)差異表達條帶二次擴增和克隆從瓊脂糖凝膠中切出明顯差異的條帶,采用膠回收試劑盒回收差異表達片段,以回收片段為模板進行二次PCR擴增,PCR反應體系及程序與選擇性擴增相同。PCR產(chǎn)物經(jīng)
2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,膠回收并與pGEM-T Easy載體連接,轉化大腸桿菌DH5 α,提取單菌落質(zhì)粒。對質(zhì)粒進行雙酶切鑒定和PCR檢測,檢測無誤后送上海英駿公司測序。測序后獲得序列長度為439bp,測序結果經(jīng)Blast比對,與其他植物PDR基因高度同源。5、cDNA全長擴增根據(jù)cDNA-AFLP擴增獲得的439bp PDR基因序列設計5 ’端和3 ’端擴增引物,5,-RACE 引物(GSP5-1)和 3,-RACE 引物(GSP3-1)分別為GSP5-1 :5,-TGCCCGCCTGAGATACCCCTTACCA-3,,(SEQ ID NO. 5)GSP3-1 :5’ -CAGGCGGGCAAATGAAGCGTGTTAC-3’。(SEQ ID NO. 6)①RNA提取及其反轉錄RNA提取采用上述方法進行,反轉錄采用SMART RACE cDNA AmplificationKit中反轉錄酶和引物。②5’端擴增反應體系
PCR-Grade WaterM、
μ
IOxAdvantage 2 PCR Buffer5.0 μL
dNTP Mix (10 mM)1.0 liL
50χAdvantage 2 Polymerase Mix1.0 μL
5’ -RACE-Ready cDNA2.5
pL
UPM ( ΙΟχ)5.0 liL
GSP5-1 (ΙΟμΜ)LO
μL③5’端擴增反應條件94°C 2min,I cycles:94°C 30sec, 72°C Imin 30sec,5 cycles;94°C 30sec, 70°C 30sec, 72°C Imin 30sec,5 cycles;94°C 30sec, 68°C 30sec, 72°C Imin 30sec,20 cycles④3’端擴增體系PCR-Grade Water34.5
pL
10>-Advantage 2 PCR Buffer5.0 μL
dNTP Mix (IOmM)1.0 μ
50χAdvantage 2 Polymerase Mix1.0 μL 3,-RACE-Ready cDNA2.5 μL
UPM(IO )5.0 μΕ
GSP3-1 (ΙΟμΜ)1.0 μΕ⑤3 ’端擴增反應條件94°C 2min,Icycles:94°C 30 sec, 72°C 4 min,5 cycles;94°C 30 sec, 70°C 30 sec, 72°C 4 min,5 cycles;94°C 30 sec, 68°C 30 sec, 72°C 4 min,20 cycles⑥電泳及其測序PCR產(chǎn)物經(jīng)I. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,膠回收并與pGEM-T Easy載體連接,轉化大腸桿菌DH5a,提取單菌落質(zhì)粒。對質(zhì)粒進行雙酶切鑒定和PCR檢測,檢測無誤后送上海英駿公司測序。測序后獲得5’端cDNA長度為1043bp,3’端cDNA長度為3482bp,經(jīng)拼接后得到包含完整編碼框的全長為4515bp的序列(PgPDR3),提交到Genbank,登錄號為KC013238。6、序列分析經(jīng)過測序成功獲得了長度為4515bp的cDNA序列,利用NCBI中在線分析工具BLAST 和 ORFFinder (http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi 和 http://www. ncbi.nlm. nih. gov/gorf/orfig. cgi)進行比較和ORF查找發(fā)現(xiàn)該序列中⑶S序列長度為4137bp,對其編碼的氨基酸序列采用CLUSTALX軟件分析比較,與其他植物I3DR基因如大豆(GmPDRl,XM003546171)、煙草(NpPDRl,AJ404328 ;NtPDRl,AB109388. I 和 NpPDR2,BAD07484. I)、水稻(OsPDRl, AJ535054 ;0sPDR2, AJ535053 和 0sPDR3,AJ535052)有較高的同源性。利用 TMHMM(http://www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM-2. 0/)在線分析軟件分析跨膜結構域,結果顯示該蛋白為跨膜蛋白。并使用MEGA4軟件以鄰接法(Neighbor-J0ining,NJ)構建系統(tǒng)發(fā)生樹。系統(tǒng)樹中分支的置信水平用自引導值(Bootstrap test)估計,重復1000次,結果顯示該基因與大豆的PDR基因親緣性最近,其次是煙草和水稻。7、表達分析取新鮮的人參的根、不定根、芽、種子和發(fā)根,分別提取RNA ;再以10(^麗6從分別誘導人參根0、1、3、6、12和24h,提取各時間點人參根總RNA。以oligod(T)18為引物,AMV反轉錄酶合成cDNA,并以β -actin為內(nèi)參,利用real-time PCR擴增PgPDR3基因,PgPDR3和β-actin擴增引物分別為PgPDR3 F :5,-GTGGGGCTGGGAAGACCACTCT-3’ ;(SEQID NO. 7)R:5’ -GCTCCCAGTATCCTGCTATGCGA-3’ ;(SEQ ID NO. 8)
β actin F :5’ -CGTGATCTTACAGATAGCTTCATGA-3’ ;(SEQID NO. 9)R:5’ -AGAGAAGCTAAGATTGATCCTCC-3’。(SEQ ID NO. 10)
反應體系為
2 X S Y B R #l Premix Ex Taq II 25 μL 引物 I (ΙΟμΜ)IpL
弓丨物 2 (ΙΟμΜ)I
cDNAI IiL CidH2O22 ,uL采用兩步法PCR擴增標準程序95°C 30sec ;95°C 40sec,60°C 30sec共40個循環(huán);95°C 15sec,60°C lmin,95°C 15sec。每個樣品三次重復。反應結束后確認擴增曲線和溶解曲線,采用2_“ct方法計算PgPDR3基因在不同組織和MeJA誘導下不同時間表達水平的差異。結果顯示其在發(fā)根中表達最高,其次是根、不定根和種子,芽中表達最低。MeJA可以顯著誘導人參皂苷的合成,MeJA誘導24h,PgPDR3基因表達迅速增加至10倍以上,PgPDR3表達與人參皂苷的合成密切相關。實施實例2表達載體的構建及轉化I、植物過表達載體的構建及轉基因植株篩選(I)分別用 BamH I 和 Sac I 雙酶切 pBI12 I 和 PgPDR3,回收 pBI12 I 載體和 PgPDR3基因片段。將兩片段連接并轉化DH5a,篩選出重組子,重組質(zhì)粒命名為pBI-PgPDR3。其中擴增PgPDR3基因的上下游引物分別為PgPDR 3 :F1:5’ -CGGGATCCCGCACCATGGCATTAAAAAGTAGCAG-3,;(SEQ ID NO. 11)Rl: 5’ -CGCGAGCTCGGCCATTTTGTTATCTCTTTTGG-3’。(SEQ ID NO. 12)其中劃線部分為BamH I和Sac I酶切位點。(2)根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備①在含有100 μ g/ml利福霉素的YEB平板上劃線培養(yǎng)農(nóng)桿菌LBA4404,28°C暗培養(yǎng)2d。②挑取單菌落接種到含有100 μ g/ml利福霉素的YEB培養(yǎng)基中,28°C振蕩培養(yǎng)過夜。③將過夜活化的農(nóng)桿菌按1:50的比例稀釋到50ml含有100 μ g/ml的卡那霉索的YEB培養(yǎng)基中,28°C振蕩培養(yǎng)至0D600約為O. 4-0. 6,冰浴30min。④于4°C, 5000rpm離心lOmin,棄上清液,用IOmlO. 15mMNaCl懸浮菌體。⑤于4°C, 5000rpm離心lOmin,棄上清液,用2ml20mMCaCl2懸浮菌體。⑥每管200 μ L分裝,液氮速凍,_70°C保存。(3)根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的轉化①將根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞置于冰上,緩慢解凍。②加入O. 5 μ gpBI121-PgPDR3 質(zhì)粒 DNA,輕輕混勻,冰浴 30min。③置液氮中冷凍2min,迅速移入37°C水浴中熱激5min,再迅速冰浴2min,之后加入800 μ LYEB液體培養(yǎng)基,于28 °C振蕩培養(yǎng)3_4h。
④5000rpm離心5min沉淀菌體,棄掉800 μ L上清后重新懸浮菌體,均勻涂布于含有100 μ g/ml利福霉素和50 μ g/ml卡那霉素的YEB培養(yǎng)基上,28°C培養(yǎng)2_3d。(4)根癌農(nóng)桿菌質(zhì)粒提取和鑒定①PCR鑒定挑取轉化的農(nóng)桿菌單菌落接種于I. 5ml含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C振蕩培養(yǎng),用PgPDR3基因特異性引物F:5,-GTGGGGCTGGGAAGACCACTCT-3,;(SEQ ID NO. 7)R:5’ -GCTCCCAGTATCCTGCTATGCGA-3’ ;(SEQ ID NO. 8)進行PCR擴增后,瓊脂糖凝膠電泳檢測是否含有預期片段。PCR反應程序如下940C 30sec,55°C 45sec,72°C 30sec,35 個循環(huán);72°C 2min。②酶切鑒定挑取農(nóng)桿菌單菌落接種于含有100 μ g/ml的利福霉素和50 μ g/ml的卡那霉素的YEB培養(yǎng)基中,28°C培養(yǎng)過夜培養(yǎng),提取重組質(zhì)粒pBI121-PgPDR3,采用上述方法以BamH I和Sac I酶切提取的質(zhì)粒。(5)含pBI121_PgPDR3質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)28°C劃線培養(yǎng)含有pBI121_PgPDR3質(zhì)粒的農(nóng)桿菌約2d。挑取單菌落接種于含有100mg/L利福霉素和50mg/L卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基中,28°C振蕩培養(yǎng)過夜,至0D600約為O. 6時收集菌液,4000rpm離心lOmin,沉淀重懸于1/2MS液體培養(yǎng)基中。
(6)葉盤法侵染煙草將煙草幼葉置于自來水中沖洗3-4次,然后在70%乙醇中浸泡30_60sec,10%次氯酸鈉中消毒10_20min,再用無菌水充分沖洗,然后置于無菌培養(yǎng)皿中,將葉片切成
0.5-1 cm2的小片,將剪好的葉片分別放入含有pBI121-PgPDR3質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液中侵染5min,將葉片上的菌液用無菌濾紙吸干。(7)共培養(yǎng)侵染過并吸干表面菌液的葉盤,氣孔面朝上,緊靠著放在共培養(yǎng)基上(MS+6-BA
1.Omg/L+IAA O. lmg/L),黑暗處培養(yǎng) 2d。(8)篩選及分化培養(yǎng)暗培養(yǎng)2d后,轉換到篩選分化培養(yǎng)基上(MS+6-BA I. Omg/L+IAA O. Img/L+Kanl00mg/L+Cef300mg/L),每15d換一次篩選分化培養(yǎng)基,至分化出的煙草長至3_5cm時轉至生根培養(yǎng)基中。(9)生根培養(yǎng)將分化至3-5cm的煙草分別切下,轉移至生根培養(yǎng)基(1/2MS+IBA 2. Omg/L)。(10)移栽當再生植株的根長至5_8cm時,打開封口膜煉苗2_3d,將幼苗移栽至花盆內(nèi),移栽后最初的5-10d罩上透明塑料,保持90%-100%的濕度,并在罩上打些小孔以利于氣體交換。移栽的基質(zhì)以及花盆均預先消毒。(7)轉基因植株PCR鑒定以轉基因植株的基因組DNA為模板,采用上述重組質(zhì)粒鑒定所用的PgPDR3基因特異性引物進行PCR擴增,PCR反應體系和反應條件同上。經(jīng)鑒定得到分化成苗的Ttl代陽性轉基因植株。2、轉運功能鑒定取轉PgPDR3基因的煙草幼葉,采用上述相同方法誘導產(chǎn)生懸浮細胞,利用人參皂苷飼喂及比較植物功能基因組學技術,通過通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gaschromatography-mass spectrometry, GC/MS)法直接定量測定并比較分析轉基因煙草培養(yǎng)系中人參皂苷化學成分譜表型的改變,確定PgPDR3轉運蛋白對人參皂苷的轉運功能。3、原核表達分析(I) PCR 擴增以已擴增的PgPDR3基因為模板,以上下游分別添加EcoR I和Hind III酶切位點序列的引物進行擴增,其擴增所用的引物如下(劃線部分分別為EcoR I和HindIII酶切位 點)F:5,-CGGGA ATTCATGGCATTAAAAAGTAGCAG-3,;( SEQ ID NO 13)R:5 -CCCAAGCTTGGGCATTTTGTTATCTCTTTTGG-3>。(SEQ ID NO. 14)反應體系同上,PCR反應程序如下94°C 30sec,55°C 45sec,72°C 4min30sec,35 個循環(huán);72°C IOmin。(2)酶切、連接轉化及其篩選分別用EcoR I和Hind III雙酶切pET28a和PCR產(chǎn)物,回收pET28a和PCR產(chǎn)物片段。將兩片段連接并轉化BL21,通過卡那霉素篩選、PCR擴增和酶切鑒定出重組子,重組質(zhì)粒命名為pET28a-PgPDR3。(3) PgPDR3蛋白誘導表達及其功能分析挑取含有重組pET28a-PgPDR3 質(zhì)粒的菌落 BL21 (DE3),至 IOmlLB(含 Kan50 μ g/ml)中37°C過夜培養(yǎng)。取Iml菌液加入到含IOOml LB培養(yǎng)基(含Kan50 μ g/ml),37°C震蕩培養(yǎng)至0D600約為O. 4-0. 6。加入IPTG至終濃度為ImM進行誘導,每隔Ih收集一次菌液,5000 X g離心lOmin,收獲沉淀,以Ig菌體加入4ml PBS緩沖液的比例重懸,加入5 X SDS-PAGE上樣緩沖液,混勻,沸水浴5min取上清進行SDS-PAGE分析。選取PgPDR3蛋白表達量高的時間點,加入人參皂苷等底物,分析PgPDR3蛋白的轉運功能,并結合His-tag進行蛋白純化,體外解析其結構。
權利要求
1.一種人參PgPDR3基因,其特征在于,所述PgPDR3基因序列如SEQ ID NO. I所示。
2.一種用于擴增權利要求I所述PgPDR3基因的引物對,其特征在于,所述引物對如SEQID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6 所示。
3.—種重組載體,由空載體和插入該空載體的目的基因組成,其特征在于,所述目的基因為權利要求I所述的PgPDR3基因。
4.根據(jù)權利要求2所述的重組載體,其特征在于,所述空載體為PBI121或pET28a。
5.根據(jù)權利要求I所述PgPDR3基因在調(diào)控人參皂苷轉運與積累中的應用。
6.根據(jù)權利要求I所述PgPDR3基因在人參育種中的應用。
7.一種轉運蛋白,其特征在于,所述蛋白由SEQ ID NO. I所示的基因編碼,其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
8.根據(jù)權利要求6所述蛋白在調(diào)控人參皂苷轉運與積累中的應用。
9.根據(jù)權利要求6所述蛋白在人參育種中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種促進人參皂苷轉運與積累相關基因PgPDR3及其編碼蛋白和應用。該人參皂苷轉運與積累相關基因PgPDR3序列如SEQ ID NO.1所示,其編碼的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。研究發(fā)現(xiàn)PgPDR3基因表達具有組織特異性且與人參皂苷的積累密切相關。所述PgPDR3基因在促進人參皂苷合成、轉運和積累方面有顯著的效果??梢酝ㄟ^該基因或其衍生物篩選或改良人參及其它植物,獲得人參皂苷含量高的優(yōu)良植物品種。亦可以采用人參轉基因細胞或植物生產(chǎn)原人參二醇、Rb、Re、Rh2、Rg2和Rg3等人參皂苷單體。
文檔編號A01H5/00GK102925459SQ20121046240
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月16日 優(yōu)先權日2012年11月16日
發(fā)明者羅志勇, 張儒, 黃景嘉, 祝捷, 陳湘暉, 曹宏哲 申請人:中南大學