專利名稱：一種提高雜交白楊抗蟲能力的方法
一種提高雜交白楊抗蟲能力的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于植物品種改良的生物技術(shù)，具體地涉及一種提高雜交白楊抗蟲能力的方法背景技術(shù)
楊樹是世界上分布最廣，適應(yīng)性最強的樹種，是我國重要的速生用材樹種之一。然而，隨著環(huán)境的不斷惡化，自然災(zāi)害的頻繁發(fā)生，食葉害蟲和蛀干害蟲的危害成為大面積發(fā)展楊樹豐產(chǎn)林的最大障礙，化學(xué)防治方法不僅成本高、污染環(huán)境，而且易使害蟲產(chǎn)生抗藥性，因此，利用基因工程方法培育具有抗蟲能力的楊樹新品種是控制蟲害的重要途徑。林木植物由于生長周期較長，總是面臨周圍環(huán)境中各種病蟲害的侵犯，因此在長期的演化過程中，他們自身已獲得了適度、有效的生物抗性機制，能夠最大限度地避免逆境的危害。通過深入挖掘并利用林木植物這種自身的病蟲害防御機制，利用基因工程方法培育轉(zhuǎn)基因抗蟲林木新品種，對發(fā)展生態(tài)林業(yè)、保護生態(tài)環(huán)境具有重要意義。
POP3是一種功能未知的創(chuàng)傷誘導(dǎo)蛋白，尚無文獻資料報道其具有抗蟲能力。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種提高雜交白楊抗蟲能力的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下
一種提高雜交白楊抗蟲能力的方法，包括如下步驟
(I)以毛果楊(P. Trichocarpa)葉片的 mRNA 為模板，以 SEQ ID No. 2,SEQ ID No. 3 所示核苷酸序列為上、下游引物，通過RT-PCR得到了 SEQ ID No. I表示的核苷酸序列；
(2)將凝膠回收的SEQ ID No. I表示的核苷酸序列連接到pMD18_T載體上得到重組質(zhì)粒并導(dǎo)入E. coli菌株DH5a，篩選出陽性克隆，提取質(zhì)粒；
(3)將步驟(2)獲得的質(zhì)粒雙酶切，將凝膠回收的SEQ ID No. I表示的核苷酸序列與經(jīng)雙酶切的植物表達載體PBI121進行連接，轉(zhuǎn)化E. coli菌株DH5 a ；
(4)用SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3篩選含有抗性質(zhì)粒的菌落，提取質(zhì)粒并進行質(zhì)粒PCR驗證、BamHI/SacI雙酶切驗證，挑選正確的重組子，將其命名為pBI121_P0P3 ；
(5)將PBI121-P0P3通過電擊法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌C58中，得到的菌落進行菌落PCR 鑒定，大小為326bp片段的菌落即為正確的菌株；
(6)將步驟(5)獲得的菌株轉(zhuǎn)化雜交白楊(Populus alba L. XPopulus tremula L.)，獲得提聞雜交白楊抗蟲能力的轉(zhuǎn)基因苗。
本發(fā)明將毛果楊中編碼創(chuàng)傷應(yīng)答蛋白POP3的基因?qū)腚s交白楊(Populus alba L. XPopulustremula L.)中得到轉(zhuǎn)基因雜交白楊,利用所述轉(zhuǎn)基因雜交白楊和對照植物雜交白楊的葉片分別飼喂美國白蛾，結(jié)果證明，轉(zhuǎn)基因雜交白楊對美國白蛾幼蟲的致死率顯著優(yōu)于對照植物；轉(zhuǎn)基因雜交白楊對美國白蛾幼蟲生長發(fā)育的負面影響顯著高于對照植物；轉(zhuǎn)基因雜交白楊對美國白蛾成蟲的化蛹率、羽化率、產(chǎn)卵量和卵孵化率的負面影響均顯著高于飼喂對照植物。
本發(fā)明通過將創(chuàng)傷應(yīng)答蛋白POP3基因遺傳轉(zhuǎn)化重要林木植物雜交白楊以提高其抗蟲能力，利用該方法能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因雜交白楊對世界性檢疫害蟲——鱗翅目美國白蛾的抗蟲能力，為培育抗蟲林木提供了一種十分有效的方法，對降低農(nóng)藥使用、延緩害蟲抗性的產(chǎn)生具有一定的意義，對維持生態(tài)系統(tǒng)的平衡和可持續(xù)發(fā)展也有重大的應(yīng)用價值。


圖I為來源于毛果楊的創(chuàng)傷應(yīng)答蛋白基因cDNA的克隆。
圖2為攜帶創(chuàng)傷應(yīng)答蛋白基因POP3的植物表達載體圖。
圖3為轉(zhuǎn)POP3基因雜交白楊基因組DNA的PCR檢測。
圖4為轉(zhuǎn)POP3基因雜交白楊的RT-PCR檢測。
具體實施方式
下述結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
本發(fā)明所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
實施例I :轉(zhuǎn)POP3楊樹的獲得
I、毛果楊(P. Trichocarpa)創(chuàng)傷應(yīng)答蛋白基因cDNA的克隆
根據(jù)Genbank登錄的歐洲山楊創(chuàng)傷應(yīng)答蛋白cDNA序列(AJ276517),在毛果楊 (P. Trichocarpa)全基因組草圖中進行Blastn搜索，得到的序列在Genbank的登錄狀態(tài)顯示是一種功能未知的預(yù)測蛋白，其氨基酸序列為(XP 002314976)，基因序列為(XM 002314940)。
以毛果楊(P.Trichocarpa)葉片的 mRNA 為模板，以 Forward: 5’ -atggcaaccagaa ctccaaa-3，；(SEQ ID No. 2)和 Reverse:5，-tagtagagaaagtagtctatcacaagacgc-3> ； (SEQ ID No. 3)為上、下游引物，通過RT-PCR得到了預(yù)期大小的特異條帶(SEQ ID No. I表示的核苷酸序列)，結(jié)果如圖I所示。
凝膠回收PCR產(chǎn)物(SEQ ID No. I表示的核苷酸序列)，并將回收的PCR產(chǎn)物連接到PMD18-T載體上，將連接產(chǎn)物導(dǎo)入E. coli菌株DH5 α ;并篩選出陽性克隆，測序后與毛果楊(P. Trichocarpa)基因組草圖比較,利用DNAMAN進行氨基酸預(yù)測后與Genbank中預(yù)測蛋白氨基酸序列(GenBank:EER)1147. I)比較，結(jié)果完全一致，表明克隆的序列正確，為毛果楊(P. Trichocarpa)損傷應(yīng)答蛋白基因cDNA。
2、植物表達載體的構(gòu)建
將上述陽性克隆單菌落提取質(zhì)粒(POP3重組到測序載體pMDlS-T后構(gòu)建的質(zhì)粒)經(jīng)BamHI/SacI雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳回收326 bp的片段，植物表達載體pBI121 經(jīng)BamHI/SacI雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳回收載體大片段。將回收的2種片段連接后轉(zhuǎn)化 E. coli菌株DH5 α，在含有50 mg/L卡那霉素的LB平板上用SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3 篩選含有抗性質(zhì)粒的菌落。對篩選出的單菌落提取質(zhì)粒，并對質(zhì)粒用POP3目的基因的特異性引物(SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3)進行PCR驗證、BamHI/SacI雙酶切驗證，挑選正確的重組子，將其命名為PBI121-POP3，載體圖譜如圖2所示。4
3、農(nóng)桿菌工程菌株的制備
將上述獲得的植物表達載體pBI121-P0P3通過電擊法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌C58中，在含有利福平和卡那霉素各50mg/L的YEB固體培養(yǎng)基上涂板，得到的菌落進行菌落PCR鑒定，得到大小為326bp片段的菌落即為正確的菌株。將該菌株的單菌落接種到新鮮YEB培養(yǎng)基(含利福平和卡那霉素各50mg/L)中，28°C 180rpm震蕩培養(yǎng)至0D600大約為O. 5時制得用于轉(zhuǎn)化的菌液。
4、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的楊樹遺傳轉(zhuǎn)化
在超凈工作臺上，將雜交白楊(Populusalba L. XPopulus tremula L. )2_3cm長的莖段放入上述菌液中浸泡lOmin，之后將莖段轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基中于23°C暗培養(yǎng)3天。 之后將莖段轉(zhuǎn)入附加20mg/L卡那霉素的篩選培養(yǎng)基中，于23°C培養(yǎng)I個月后出現(xiàn)愈傷組織。將帶有抗性愈傷組織的莖段轉(zhuǎn)接于分化篩選培養(yǎng)基，大約I個月后可觀察到不定芽。待不定芽長至2-3cm時沿其基部剪下，轉(zhuǎn)移到生根篩選培養(yǎng)基，3-4周根系發(fā)育完全，獲得提高雜交白楊抗蟲能力的轉(zhuǎn)基因苗(轉(zhuǎn)POP3楊樹苗)。
5、楊樹轉(zhuǎn)化植株的分子檢測
(I)基因組DNA的PCR鑒定
用Takara 公司的 Universal genomic DNA extraction kit 提取提高雜交白楊抗蟲能力的轉(zhuǎn)基因苗葉片的基因組DNA，以該DNA為模板，用目的基因的特異性引物(SEQ ID No. 2、SEQID No. 3)對其進行PCR。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖3所示，I DNA marker ;2_9 :轉(zhuǎn)POP3楊樹苗；10 :非轉(zhuǎn)基因楊樹苗(陰性對照)；11 pBI121-P0P3質(zhì)粒 (陽性對照)。從圖中可以看出，轉(zhuǎn)POP3楊樹苗和陽性對照均能擴增得到326bp的特異性條帶，證明POP3已經(jīng)整合進楊樹基因組中。
(2) RT-PCR 檢測
用QIAGEN公司的RNeasy mini kit提取轉(zhuǎn)POP3楊樹苗葉片的總RNA，以該RNA 為模板進行cDNA合成(iScript cDNA Synthesis kit, BioRad),用目的基因的特異性引物 (SEQ IDNo. 2,SEQ IDNo. 3)對反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行RT-PCR分析。結(jié)果如圖4所示，I =DNAmarker ； 2-4 -M POP3楊樹苗；5 :非轉(zhuǎn)基因楊樹苗(陰性對照)；6 pBI121-P0P3質(zhì)粒(陽性對照)；。 從圖中可以看出，轉(zhuǎn)POP3楊樹苗和陽性對照均能擴增得到326bp的特異性條帶，證明POP3 已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因楊樹苗葉片中表達。
共培養(yǎng)培養(yǎng)基包括MS鹽4. 4g，蔗糖30g，生長素NAA I. 86mg，細胞分裂素2ipI.02mg, pH=5. 7,乙酰丁香酮 19. 86mg,瓊脂 7. 2g，加水至 1L。
篩選培養(yǎng)基包括MS鹽4. 4g，蔗糖30g，細胞分裂素TDZ O. 05mg,pH=5. 7，頭孢霉素 350mg,卡那霉素20mg,瓊脂7. 2g，加水至1L。
分化篩選培養(yǎng)基包括MS鹽4. 4g，蔗糖30g，細胞分裂素TDZ O. 0022mg,pH=5. 7，頭孢霉素350mg,卡那霉素20mg,瓊脂7. 2g,加水至1L。
生根篩選培養(yǎng)基包括MS鹽2. 2g，蔗糖30g，pH=5. 7，頭孢霉素350mg，卡那霉素 20mg，瓊脂7. 2g，加水至IL0
實施例2 :轉(zhuǎn)POP3楊樹苗的抗蟲能力研究
I、美國白蛾的群體飼養(yǎng)
在室內(nèi)常溫條件下孵化美國白蛾卵塊，將剛孵化的美國白蛾I齡幼蟲放在清潔干燥的罐頭瓶中，用轉(zhuǎn)POP3楊樹苗和非轉(zhuǎn)基因楊樹苗的葉片分別喂飼幼蟲，用透氣紗布扎緊瓶口，保證葉片新鮮、充足。每瓶30只，設(shè)6個重復(fù)。將培養(yǎng)瓶置于(25±2) °C，相對濕度 (RH) 70%-80%的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。飼養(yǎng)3周時統(tǒng)計各處理美國白蛾幼蟲的體重和體長； 化蛹前統(tǒng)計存活情況，計算死亡率；記錄每次飼喂葉片重量和剩余葉片重量，計算與對照相比的取食量；化蛹后統(tǒng)計化蛹率和平均蛹重；羽化后統(tǒng)計羽化、產(chǎn)卵量和孵化情況。
2、轉(zhuǎn)POP3楊樹苗對美國白蛾的抗蟲能力分析
(I)轉(zhuǎn)POP3基因楊樹苗對美國白蛾幼蟲生長發(fā)育的影響
分別用不同株系的轉(zhuǎn)POP3楊樹苗和非轉(zhuǎn)基因楊樹苗(陰性對照)葉片飼養(yǎng)美國白蛾初孵幼蟲，飼養(yǎng)3周時統(tǒng)計各處理美國白蛾幼蟲的體重和體長，飼喂非轉(zhuǎn)基因楊樹苗的幼蟲平均體重為318mg，平均體長2. 8cm，化蛹后的平均蛹重為187. lmg，而飼喂轉(zhuǎn)POP3楊樹苗的幼蟲平均體重和體長及蛹重均顯著降低，說明轉(zhuǎn)POP3楊樹苗對美國白蛾幼蟲的生長發(fā)育影響高于非轉(zhuǎn)基因楊樹苗。化蛹前飼喂非轉(zhuǎn)基因楊樹苗使美國白蛾幼蟲的總死亡率為3.1%，而飼喂轉(zhuǎn)POP3楊樹苗使幼蟲的總死亡率顯著提高達48. 3%-52. 0%，表明轉(zhuǎn)POP3楊樹苗對美國白蛾幼蟲的致死作用高于非轉(zhuǎn)基因楊樹苗。結(jié)果見表I。
表I轉(zhuǎn)POP3楊樹苗和非轉(zhuǎn)基因楊樹苗(對照)對美國白蛾幼蟲生長發(fā)育的影響
權(quán)利要求
1.一種提高雜交白楊抗蟲能力的方法，其特征是包括如下步驟(1)以毛果楊(P.Trichocarpa)葉片的 mRNA 為模板，以 SEQ ID No. 2, SEQ IDNo. 3 所示核苷酸序列為上、下游引物，通過RT-PCR得到了 SEQ ID No. I表示的核苷酸序列；(2)將凝膠回收的SEQID No. I表示的核苷酸序列連接到pMD18_T載體上得到重組質(zhì)粒并導(dǎo)入E. coli菌株DH5a，篩選出陽性克隆，提取質(zhì)粒；(3)將步驟(2)獲得的質(zhì)粒雙酶切，將凝膠回收的SEQID No. I表示的核苷酸序列與經(jīng)雙酶切的植物表達載體PBI121進行連接，轉(zhuǎn)化E. coli菌株DH5 a ；(4)用SEQID No. 2,SEQ ID No. 3篩選含有抗性質(zhì)粒的菌落，提取質(zhì)粒并進行質(zhì)粒PCR驗證、BamHI/SacI雙酶切驗證，挑選正確的重組子，將其命名為pBI121_P0P3 ；(5)將pBI121-P0P3通過電擊法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌C58中，得到的菌落進行菌落PCR鑒定，大小為326bp片段的菌落即為正確的菌株；(6)將步驟(5)獲得的菌株轉(zhuǎn)化雜交白楊(Populusalba L. XPopulus tremulaL.),獲得提聞雜交白楊抗蟲能力的轉(zhuǎn)基因苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高雜交白楊抗蟲能力的方法，步驟為以毛果楊葉片的mRNA為模板，以SEQ ID No.2、3為引物，通過RT-PCR得到了SEQ ID No.1并連接pMD18-T，得到的重組質(zhì)粒導(dǎo)入E.coli菌株DH5α，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒并雙酶切，將SEQ ID No.1與經(jīng)雙酶切的pBI121進行連接，轉(zhuǎn)化E.coli菌株DH5α；篩選含有抗性質(zhì)粒的菌落，提取質(zhì)粒進行PCR驗證、雙酶切驗證，挑選正確的重組子，命名為pBI121-POP3并轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌中，進行菌落PCR鑒定；獲得的菌株轉(zhuǎn)化雜交白楊，得到轉(zhuǎn)基因苗。本發(fā)明的方法能提高雜交白楊抗蟲能力。
文檔編號A01H5/00GK102925482SQ201210464809
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月15日
發(fā)明者王潔華, 楊少輝, 宋英今 申請人:天津大學(xué)