專利名稱：一種川芎種質(zhì)的離體保存方法及川芎離體保存培養(yǎng)基的制作方法
一種川芎種質(zhì)的離體保存方法及川芎離體保存培養(yǎng)基

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明屬于栽培領(lǐng)域，涉及一種川芎種質(zhì)的離體保存方法及川芎離體保存培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
川彎為傘形科植物川彎Ligusticum chuanxiong Hort.的根莖，為我國(guó)的傳統(tǒng)中藥，也是著名的川產(chǎn)道地藥材，具有近兩千年的栽培和使用歷史。歷代醫(yī)家均作為治頭痛、活血行氣、祛風(fēng)止痛藥使用。2005版《中國(guó)藥典》一部中收載的成方制劑和單味制劑共564種，其中使用川芎的有85種，約占藥典收載中成藥的15%。在2010年版《中國(guó)藥典》收載的1039個(gè)成方制劑和單味制劑中，含川芎的有155個(gè)，占所載成方制劑總數(shù)的14.92%。兩版藥典使用川芎的收載處方增加了 82.35%，說(shuō)明川芎使用量和需求量在不斷提高?，F(xiàn)代臨床上主要用于治療心腦血管系統(tǒng)的疾病，效果顯著，如“速效救心丸”等。川芎除供藥用外，還用于保健品、美容化妝品、飼料添加劑、煙用香料添加劑及天然防腐劑等，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)需求量大。川芎是無(wú)性繁殖，生產(chǎn)上用膨大的地上莖節(jié)(苓種或芎苓子)作為繁殖材料。長(zhǎng)期以來(lái)，川芎種植基本處于自發(fā)狀態(tài)，苓種繁育仍然停留在自繁自用，缺乏統(tǒng)一的生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程和科學(xué)的組織管理，且沒(méi)有苓種分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)和檢驗(yàn)規(guī)程，導(dǎo)致川芎苓種質(zhì)量良莠不齊，使產(chǎn)區(qū)川芎藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量受到極大影響。經(jīng)過(guò)上千年的栽種，加上缺乏選種育種，存在一定程度的種質(zhì)退化。蔣桂華等，“川芎種質(zhì)資源的調(diào)查收集與保存研究”，中草藥，2008年4月第39卷第4期與高農(nóng)等，“川芎苓子繁育技術(shù)”，藥用植物.特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物2004年第10期均報(bào)道了的川芎種質(zhì)的保存方法，但均為傳統(tǒng)的田間保存方法，存在耗費(fèi)人力物力，容易損失，成本聞，保存效果不佳等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述缺陷，本發(fā)明提供了一種川芎種質(zhì)的離體保存方法其離體保存培養(yǎng)基。本發(fā)明川芎種質(zhì)的離體保存方法，它包括如下步驟:(I)取川芎莖尖，消毒滅菌；(2)將步驟(I)處理后的川芎莖尖接種于川芎離體保存培養(yǎng)基中保存，保存條件為:溫度4 25°C，光照強(qiáng)度60(Tl5001x，光照時(shí)間l(Tl4h/d ;所述保存培養(yǎng)基以1/2MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加2(T30g/L蔗糖，或者以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加2(T60g/L蔗糖。其中，所述步驟(I)包括如下步驟:I)消毒:取川芎莖尖，用消毒粉消毒其表面；2)滅菌:取步驟I)處理后的川芎莖尖，用70%乙醇滅菌30s，再用HgCl2滅菌2 5min，或者先用70%乙醇滅菌15s， 再用HgCl2滅菌5min。
其中，步驟(2)所述保存培養(yǎng)基以1/2MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加20g/L蔗糖，或者以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加40g/L蔗糖。其中，步驟(2)所述保存培養(yǎng)基中含有植物生長(zhǎng)抑制劑。植物生長(zhǎng)抑制劑:是抑制或破壞植物頂端分生組織的分裂與膨大的一類化學(xué)物質(zhì)，它能延緩細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)，達(dá)到控制部分生長(zhǎng)、刺激花芽分化、延緩衰老等目的。所述植物生長(zhǎng)抑制劑為多效唑、矮壯素、烯效唑或者青鮮素。優(yōu)選地，所述多效唑的濃度不低于0.5mg/L ;所述矮壯素的濃度為(T40mg/L。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述多效唑的濃度為0.5mg/L ;所述矮壯素的濃度為40mg/L。其中，步驟(2)所述保存條件為:溫度為25°C，光照強(qiáng)度為8001x，光照時(shí)間為12h/d0本發(fā)明川芎離體保存培養(yǎng)基，它以1/2MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加2(T30g/L蔗糖，或者以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加2(T60g/L蔗糖。其中，所述保存培養(yǎng)基以1/2MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加20g/L蔗糖，或者以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加40g/L蔗糖。其中，所述保存培養(yǎng)基中還添加有植物生長(zhǎng)抑制劑。所述植物生長(zhǎng)抑制劑為多效唑、矮壯素、烯效唑或者青鮮素。優(yōu)選地，所述多效唑的濃度不低于0.5mg/L ;所述矮壯素的濃度為(T40mg/L。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述多效唑的濃度為0.5mg/L ;所述矮壯素的濃度為40mg/L。本發(fā)明保存方法實(shí)現(xiàn)了離體保存川芎種質(zhì)，操作方便，成本低廉，可以保證川芎的遺傳穩(wěn)定性，從而保留優(yōu)質(zhì)的川芎資源，具有良好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。


圖1不同培養(yǎng)基基本成分和不同蔗糖濃度保存試管苗存活率柱狀圖(I月)圖2不同培養(yǎng)基基本成分和不同蔗糖濃度保存試管苗株高柱狀圖(I月)圖3不同培養(yǎng)基基本成分和不同蔗糖濃度保存試管苗存活率柱狀圖(2月)圖4不同培養(yǎng)基基本成分和不同蔗糖濃度保存試管苗株高柱狀圖(2月)圖5不同培養(yǎng)基基本成分和不同蔗糖濃度保存試管苗存活率柱狀圖(3月)圖6不同培養(yǎng)基基本成分和不同蔗糖濃度保存試管苗株高柱狀圖(3月)圖7不同培養(yǎng)基基本成分和不同蔗糖濃度保存試管苗存活率柱狀圖(4月)圖8不同培養(yǎng)基基本成分和不同蔗糖濃度保存試管苗株高柱狀圖(4月)圖9不同培養(yǎng)基基本成分和不同蔗糖濃度保存試管苗存活率柱狀圖(5月)圖10不同培養(yǎng)基基本成分和不同蔗糖濃度保存試管苗株高柱狀圖(5月)圖11不同培養(yǎng)基基本成分和不同蔗糖濃度保存試管苗存活率柱狀圖(6月)圖12不同培養(yǎng)基基本成分和不同蔗糖濃度保存試管苗存活率柱狀圖(6月) (不同培養(yǎng)基基本成分和不同蔗糖濃度保存試管苗株高(6月))圖13不同培養(yǎng)基和蔗糖濃度在不同保存時(shí)間對(duì)試管苗存活率的影響圖14不同培養(yǎng)基和蔗糖濃度在不同保存時(shí)間對(duì)試管苗株高的影響圖15不同濃度PP333對(duì)川芎試管苗存活率的影響圖16不同濃度PP333對(duì)川芎試管苗株高的影響圖17不同濃度CCC對(duì)川芎試管苗存活率的影響圖18不同濃度CCC對(duì)川芎試管苗株高的影響圖19川芎再生苗(4號(hào))圖20 SOD圖譜，從左到右:川芎再生苗CK2 CKl (11號(hào))圖21 POD-VC圖譜，從左到右:CK1 CK2川芎再生苗(14號(hào))圖22 POD-愈創(chuàng)木酚圖譜，從左到右:CK1 CK2川芎再生苗(4號(hào))圖23 CAT圖譜(經(jīng)典法)，從左到右:CK1 CK2川芎再生苗(11號(hào))圖24 CAT圖譜(高錳酸鉀法)，從左到右:CK1 CK2川芎再生苗(14號(hào))
具體實(shí)施例方式縮略語(yǔ):PP333:多效唑；CCC:矮壯素。實(shí)驗(yàn)材料:消毒粉、洗潔精、PP333、CCC、MS培養(yǎng)基、1/2MS培養(yǎng)基，均為市售品。實(shí)施例1外植體的篩選實(shí)驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)方法分別選擇川芎莖節(jié)、頂端幼嫩莖尖作為外植體在MS培養(yǎng)基中離體培養(yǎng)。莖尖:用去污粉浸泡，清水沖洗20min，在無(wú)菌操作臺(tái)上用70%酒精消毒60s，升汞消毒 7min30s。莖節(jié):用去污粉浸泡，清水沖洗20min，在無(wú)菌操作臺(tái)上用70%酒精消毒70s，升汞消毒8min。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果兩周內(nèi)，大多數(shù)莖節(jié)褐化并產(chǎn)生霉菌，而莖尖僅有少部分褐化死亡，污染較少，說(shuō)明川芎的莖尖可以作為離體保存的外植體，而莖節(jié)不適合作為離體保存的外植體。實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，本發(fā)明保存方法中，使用川芎莖尖作為川芎種質(zhì)進(jìn)行保存是有效的。實(shí)施例2消毒滅菌方法的選擇1、實(shí)驗(yàn)方法取川芎莖尖作為外植體， 按照表I，對(duì)外植體外表面消毒滅菌方法進(jìn)行考察:表I川芎莖尖滅菌方法對(duì)比
權(quán)利要求
1.一種川芎種質(zhì)的離體保存方法，其特征在于:它包括如下步驟: (1)取川芎莖尖，消毒滅菌； (2)將步驟(I)處理后的川芎莖尖接種于川芎離體保存培養(yǎng)基中保存，保存條件為:溫度4 25°C，光照強(qiáng)度60(Tl5001x，光照時(shí)間l(Tl4h/d ;所述保存培養(yǎng)基以1/2MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加2(T30g/L蔗糖，或者以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加2(T60g/L蔗糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的保存方法，其特征在于:所述步驟(I)包括如下步驟: O消毒:取川芎莖尖，用消毒粉消毒其表面； 2)滅菌:取步驟I)處理后的川芎莖尖，用70%乙醇滅菌30s，再用HgCl2滅菌2 5min，或者先用70%乙醇滅菌15s，再用HgCl2滅菌5min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的保存方法，其特征在于:步驟(2)所述保存培養(yǎng)基以1/2MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加20g/L蔗糖，或者以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加40g/L蔗糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的保存方法，其特征在于:所述保存培養(yǎng)基還添加有植物生長(zhǎng)抑制劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的保存方法，其特征在于:所述植物生長(zhǎng)抑制劑為多效唑、矮壯素、烯效唑或者青鮮素。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的保存方法，其特征在于:所述多效唑的濃度不低于0.5mg/L ；所述矮壯素的濃度為(T40mg/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的保存方法，其特征在于:所述多效唑的濃度為0.5mg/L ;所述矮壯素的濃度為40mg/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的保存方法，其特征在于:步驟(2)所述保存條件:溫度為25°C，光照強(qiáng)度為8001x，光照時(shí)間為12h/d。
9.一種川芎離體保存培養(yǎng)基，其特征在于:它是以1/2MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加2(T30g/L蔗糖，或者以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加2(T60g/L蔗糖。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的培養(yǎng)基，其特征在于:所述保存培養(yǎng)基以1/2MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加20g/L蔗糖，或者以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加40g/L蔗糖。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的培養(yǎng)基，其特征在于:它還添加有植物生長(zhǎng)抑制劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的培養(yǎng)基，其特征在于:所述植物生長(zhǎng)抑制劑為多效唑、矮壯素、烯效唑或者青鮮素。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的培養(yǎng)基，其特征在于:所述多效唑的濃度不低于0.5mg/L ；所述矮壯素的濃度為(T40mg/L。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的培養(yǎng)基， 其特征在于:所述多效唑的濃度為0.5mg/L ;所述矮壯素的濃度為40mg/L。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種川芎種質(zhì)的離體保存方法，它包括如下步驟(1)取川芎莖尖，消毒滅菌；(2)將步驟(1)處理后的川芎莖尖接種于川芎離體保存培養(yǎng)基中保存，保存條件為溫度4～25℃，光照強(qiáng)度600～1500lx，光照時(shí)間10～14h/d；所述保存培養(yǎng)基以1/2MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加20～30g/L蔗糖，或者以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加20～60g/L蔗糖。本發(fā)明還公開(kāi)了一種川芎種質(zhì)的離體保存培養(yǎng)基。本發(fā)明川芎種質(zhì)的離體保存方法操作方便，操作簡(jiǎn)單，保存效果優(yōu)良。
文檔編號(hào)A01N3/00GK103210904SQ201210475218
公開(kāi)日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2012年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月21日
發(fā)明者蔣桂華, 馬逾英, 張俊, 唐琳, 梅蘭菊, 朱玲玲, 陳佳妮 申請(qǐng)人:成都中醫(yī)藥大學(xué)