專利名稱：大豆的組織培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物的組織培養(yǎng)方法，具體涉及一種通過大豆成熟種子的子葉節(jié)作為外植體產(chǎn)生體細(xì)胞胚獲得再生植株的方法。
背景技術(shù)：
通過分子育種及轉(zhuǎn)基因手段來改良大豆種質(zhì)資源成為了大豆育種的趨勢，轉(zhuǎn)基因的主要手段有農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化和基因槍轉(zhuǎn)化方法，組織培養(yǎng)是轉(zhuǎn)基因工作的重要環(huán)節(jié)。大豆組織培養(yǎng)再生途徑主要有兩種器官發(fā)生和體細(xì)胞胚發(fā)生，器官發(fā)生所用的外植體一般
是無菌苗的子葉節(jié)、未成熟種子的子葉和莖尖和無菌苗上胚軸等，其中最為成熟的是大豆子葉節(jié)不定芽器官發(fā)生體系，但是這種方法存在嵌合體多，純化和篩選難度大等缺點，而體細(xì)胞胚發(fā)生途徑被認(rèn)為是最有潛力適合遺傳轉(zhuǎn)化的再生體系之一。1983年Christionson等首次觀測到大豆細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時體細(xì)胞胚胎發(fā)生，1989年P(guān)airott等使用該體系進(jìn)行了農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，但是轉(zhuǎn)化效率低，并且嵌合體多；Finer等對體細(xì)胞發(fā)生體系進(jìn)行了改良，使用未成熟的幼胚作為外植體，成功的得到大豆體細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系，并且使用農(nóng)桿菌和基因槍的方法進(jìn)行了成功的轉(zhuǎn)化，該方法得到很多研究者的青睞。但是未成熟的幼胚獲得較為復(fù)雜，受季節(jié)和環(huán)境的限制，需要較大的人力。如何有效方便的得到大豆的體細(xì)胞胚，對于大豆的遺傳轉(zhuǎn)化具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種新的大豆的組織培養(yǎng)方法。本發(fā)明實施簡便，利用本發(fā)明通過大豆成熟種子子葉節(jié)作為外植體，能夠更加有效的、方便的產(chǎn)生體細(xì)胞胚獲得再生植株。本發(fā)明所提供的大豆的組織培養(yǎng)方法包括將大豆成熟種子的子葉節(jié)作為外植體培養(yǎng)成再生植株。優(yōu)選地，所述組織培養(yǎng)方法包括如下步驟I)獲得大豆成熟種子的子葉節(jié)；2)將所述子葉節(jié)作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織；3)將所述愈傷組織培養(yǎng)成體細(xì)胞胚；4)將所述體細(xì)胞胚培養(yǎng)成再生植株。優(yōu)選地，在第I)步中，所述子葉節(jié)為大豆成熟種子萌發(fā)5 7天后形成的子葉節(jié)。更優(yōu)選地，在第I)步中，獲得子葉節(jié)的方法為挑選健康無病斑的成熟大豆籽粒，清水漂洗干凈，75%酒精消毒30 60秒，O. I %的Ca(ClO) 2消毒20 30分鐘，期間搖晃5次左右，無菌水洗去Ca (ClO) 2殘留，沖洗5 8次，接種在萌發(fā)培養(yǎng)基中，無菌萌發(fā)5 7天，光照16h/天，25±3°C ;其中，所述萌發(fā)培養(yǎng)基的成分為MSB+7g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH值為5.8。優(yōu)選地，在第2)步中，誘導(dǎo)愈傷組織的方法為將子葉節(jié)的切面貼在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)3-5周，25±3°C。更優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基的成分為MSB+4 6mg/L 2，4-D+7g/L 瓊脂 +30g/L 蔗糖，pH 值為 5. 8。優(yōu)選地，在第3)步中，將所述愈傷組織培養(yǎng)成體細(xì)胞胚的方法為將所述愈傷組織接種在體細(xì)胞胚培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3 5周，每兩周換一次培養(yǎng)基，光照16h/天，25±3°C。更優(yōu)選地，所述體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基的成分為MSB+0. 66g/L天冬氨酸+7g/L瓊脂+30g/L鹿糖，pH值為5. 8。優(yōu)選地，在第4)步中，將所述體細(xì)胞胚培養(yǎng)成再生植株的方法包括將所述體細(xì)胞胚移到生根培養(yǎng)基中，光照16h/天，25±3°C，培養(yǎng)3 4周，培養(yǎng)成再生苗。更優(yōu)選地，所述生根培養(yǎng)基的成分為MSB+3%蔗糖+6. 5g/L瓊脂，pH值為5. 8。優(yōu)選地，將所述體細(xì)胞胚培養(yǎng)成再生植株的方法還包括將所述再生苗洗干凈，移栽到滅菌的蛭石/珍珠巖=3 I的花盆中，澆灌無菌的MSB溶液，放到保濕盒中培養(yǎng)2周復(fù)壯，光照16h/天，25±3°C，然后移栽到大田中。優(yōu)選地，本發(fā)明中的大豆選自綏農(nóng)28、墾豐16或合豐55。在本發(fā)明所提供的大豆的組織培養(yǎng)方法中，以大豆成熟的種子作為外植體，經(jīng)過體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)得到再生苗，愈傷組織的誘導(dǎo)率可以達(dá)到95-98% (誘導(dǎo)率=生產(chǎn)愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)X 100% );體細(xì)胞胚發(fā)生率可以達(dá)到45-50% (體細(xì)胞胚發(fā)生率=出現(xiàn)體細(xì)胞胚的愈傷數(shù)/接種總愈傷數(shù)X100% );體細(xì)胞胚分化率可以達(dá)到50-55% (體細(xì)胞胚分化率=體細(xì)胞胚分化的愈傷數(shù)/含有體細(xì)胞胚的愈傷數(shù)X 100% )。該方法不受季節(jié)的限制，從而建立起一套易于掌握，簡便節(jié)約，快速高效的再生體系。


圖I為本發(fā)明實施例I中的綏農(nóng)28大豆種子在萌發(fā)培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天后的照片。圖2為本發(fā)明實施例I中的子葉節(jié)在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)3周后的照片。圖3為本發(fā)明實施例I中的愈傷組織在體細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的照片。圖4為本發(fā)明實施例I中形成的體細(xì)胞胚的照片。圖5為本發(fā)明實施例I中體細(xì)胞胚在分化培養(yǎng)基中分化出子葉期胚的照片。
具體實施例方式以下是結(jié)合附圖和實施例，對依據(jù)本發(fā)明提供的具體實施步驟詳述如下實施例I參照圖1-5。(I)挑選健康無病斑的成熟大豆籽粒綏農(nóng)28，清水漂洗干凈，75%酒精消毒30秒，O. 1%的Ca(ClO)2消毒20分鐘(期間搖晃5次左右)，無菌水洗去Ca(ClO)2殘留，沖洗5次，接種在萌發(fā)培養(yǎng)基中MSB+7g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH = 5. 8，大豆種子無菌萌發(fā)5天，光照16h/天，25°C。大豆種子萌發(fā)5天后的照片如圖I所示。(2)大豆萌發(fā)5天后，切下子葉節(jié)，除凈芽點，將子葉節(jié)切面貼在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MSB+6mg/L 2，4_D+7g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH = 5. 8，暗培養(yǎng)3周，25°C。子葉節(jié)暗培養(yǎng)3周后的照片如圖2所示。其中，誘導(dǎo)率為95% (誘導(dǎo)率=生產(chǎn)愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)X 100% )。
(3)將暗培養(yǎng)后的愈傷組織接種在體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSB+0. 66g天冬氨酸+7g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH = 5. 8，培養(yǎng)3周，每兩周換一次培養(yǎng)基，光照16h/天，25°C。愈傷組織在體細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)及形成的體細(xì)胞胚的照片如圖3和圖4所示。其中，體細(xì)胞胚發(fā)生率=45% (體細(xì)胞胚發(fā)生率=出現(xiàn)體細(xì)胞胚的愈傷數(shù)/接種總愈傷數(shù)X 100% ) ο(4)將有體細(xì)胞產(chǎn)生的愈傷組織移到體細(xì)胞胚分化培養(yǎng)基中，體細(xì)胞分化培養(yǎng)基MSB+6%麥芽糖+0. 5%活性炭+7g/L瓊脂，pH = 5. 8，培養(yǎng)3周，每隔兩周換一次培養(yǎng)基，光照16h/天，25°C。培養(yǎng)3周后的照片如圖5所示。其中，體細(xì)胞胚分化率約為50% (體細(xì)胞胚分化率=體細(xì)胞胚分化的愈傷數(shù)/含有體細(xì)胞胚的愈傷數(shù)X 100% )。(5)將得到的幼胚移到生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基為MSB+3%蔗糖+6. 5g/L瓊脂，pH = 5. 8，培養(yǎng) 3 周，光照 16h/天，25°C。
(6)再生苗沖洗干凈，除去上面的培養(yǎng)基，移栽到滅菌的蛭石/珍珠巖=3 : I的花盆中，澆灌無菌的MSB溶液，放到保濕盒中培養(yǎng)2周復(fù)壯，光照16h/天，250C，然后移栽到大田中。實施例2(I)挑選健康無病斑的成熟大豆籽粒墾豐16，清水漂洗干凈，75%酒精消毒45秒，O. 1%的Ca(ClO)2消毒30分鐘(期間搖晃5次左右)，無菌水洗去Ca(ClO)2殘留，沖洗8次，接種在萌發(fā)培養(yǎng)基中MSB+7g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH = 5. 8，大豆種子無菌萌發(fā)7天，光照 16h/天，26°C。(2)大豆萌發(fā)7天后，切下子葉節(jié)，除凈芽點，將子葉節(jié)切面貼在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MSB+5mg/L 2，4_D+7g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH = 5. 8，暗培養(yǎng)4周，26°C。誘導(dǎo)率為96%。(誘導(dǎo)率=生產(chǎn)愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)X 100% )(3)將暗培養(yǎng)后的愈傷組織接種在體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSB+0. 66g天冬氨酸+7g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH = 5. 8，培養(yǎng)4周，每兩周換一次培養(yǎng)基，光照16h/天，26°C。體細(xì)胞胚發(fā)生率為48% (體細(xì)胞胚發(fā)生率=出現(xiàn)體細(xì)胞胚的愈傷數(shù)/接種總愈傷數(shù)X100% )。(4)將有體細(xì)胞產(chǎn)生的愈傷移到體細(xì)胞胚分化培養(yǎng)基中，體細(xì)胞分化培養(yǎng)基MSB+6%麥芽糖+0. 5%活性炭+7g/L瓊脂，pH = 5. 8，培養(yǎng)4周，每隔兩周換一次培養(yǎng)基，光照16h/天，26°C。體細(xì)胞胚分化率為52% (體細(xì)胞胚分化率=體細(xì)胞胚分化的愈傷數(shù)/含有體細(xì)胞胚的愈傷數(shù)X 100% )。(5)將得到的幼胚移到生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基為MSB+3%蔗糖+6. 5g/L瓊脂，pH = 5. 8，培養(yǎng) 3. 5 周，光照 16h/天，26°C。(6)再生苗沖洗干凈，除去上面的培養(yǎng)基，移栽到滅菌的蛭石/珍珠巖=3 : I的花盆中，澆灌無菌的MSB溶液，放到保濕盒中培養(yǎng)2. 5周復(fù)壯，光照16h，26°C，然后移栽到大田中。實施例3(I)挑選健康無病斑的成熟大豆籽粒合豐55，清水漂洗干凈，75%酒精消毒60秒，O. I %的Ca (ClO) 2消毒25分鐘(期間搖晃5次左右)，無菌水洗去Ca (ClO) 2殘留，接種在萌發(fā)培養(yǎng)基中1^8+78/1瓊脂+3(^/1蔗糖，？!1 = 5.8，大豆種子無菌萌發(fā)6天左右，光照16h/天，28。。。(2)大豆萌發(fā)6天后，切下子葉節(jié)，除凈芽點，將子葉節(jié)切面貼在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MSB+4mg/L 2，4_D+7g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH = 5. 8，暗培養(yǎng)5周，28°C。誘導(dǎo)率為98%。(誘導(dǎo)率=生產(chǎn)愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)X 100% )(3)將暗培養(yǎng)后的愈傷組織接種在體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSB+0. 66g天冬氨酸+7g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH = 5. 8，培養(yǎng)5周，每兩周換一次培養(yǎng)基，光照16h/天，28°C。體細(xì)胞胚發(fā)生率為50% (體細(xì)胞胚發(fā)生率=出現(xiàn)體細(xì)胞胚的愈傷數(shù)/接種總愈傷數(shù)X100% )。(4)將有體細(xì)胞產(chǎn)生的愈傷移到體細(xì)胞胚分化培養(yǎng)基中，體細(xì)胞分化培養(yǎng)基MSB+6%麥芽糖+0. 5%活性炭+7g/L瓊脂，pH = 5. 8，培養(yǎng)5周，每隔兩周換一次培養(yǎng)基，光照16h/天，28°C。體細(xì)胞胚分化率為55% (體細(xì)胞胚分化率=體細(xì)胞胚分化的愈傷數(shù)/含有體細(xì)胞胚的愈傷數(shù)X 100% )。 (5)將得到的幼胚移到生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基為MSB+3%蔗糖+6. 5g/L瓊脂，pH = 5. 8，培養(yǎng) 4 周，光照 16h/天，28°C。(6)再生苗沖洗干凈，除去上面的培養(yǎng)基，移栽到滅菌的蛭石/珍珠巖=3 : I的花盆中，澆灌無菌的MSB溶液，放到保濕盒中培養(yǎng)3周復(fù)壯，光照16h/天，280C，然后移栽到大田中。以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員無需創(chuàng)造性勞動就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思做出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可以得到的技術(shù)方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.大豆的組織培養(yǎng)方法，其特征在于，所述組織培養(yǎng)方法包括將大豆成熟種子的子葉節(jié)作為外植體培養(yǎng)成再生植株。
2.如權(quán)利要求I所述的組織培養(yǎng)方法，其中，所述組織培養(yǎng)方法包括如下步驟 1)獲得大豆成熟種子的子葉節(jié)； 2)將所述子葉節(jié)作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織； 3)將所述愈傷組織培養(yǎng)成體細(xì)胞胚； 4)將所述體細(xì)胞胚培養(yǎng)成再生植株。
3.如權(quán)利要求2所述的組織培養(yǎng)方法，其中，在第I)步中，所述子葉節(jié)為大豆成熟種子萌發(fā)5 7天后形成的子葉節(jié)。
4.如權(quán)利要求2所述的組織培養(yǎng)方法，其中，在第I)步中，獲得子葉節(jié)的方法為挑選健康無病斑的成熟大豆籽粒，清水漂洗干凈，75 %酒精消毒30 60秒，O. I %的Ca (ClO) 2消毒20 30分鐘，期間搖晃5次左右，無菌水洗去Ca(ClO)2殘留，沖洗5 8次，接種在萌發(fā)培養(yǎng)基中，無菌萌發(fā)5 7天，光照16h/天，25±3°C ;其中，所述萌發(fā)培養(yǎng)基的成分為MSB+7g/L 瓊脂 +30g/L 蔗糖，pH 值為 5. 8。
5.如權(quán)利要求2所述的組織培養(yǎng)方法，其中，在第2)步中，誘導(dǎo)愈傷組織的方法為將子葉節(jié)的切面貼在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)3-5周，25±3°C。
6.如權(quán)利要求5所述的組織培養(yǎng)方法，其中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基的成分為MSB+4 6mg/L 2，4-D+7g/L 瓊脂 +30g/L 蔗糖，pH 值為 5. 8。
7.如權(quán)利要求2所述的組織培養(yǎng)方法，其中，在第3)步中，將所述愈傷組織培養(yǎng)成體細(xì)胞胚的方法為將所述愈傷組織接種在體細(xì)胞胚培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3 5周，每兩周換一次培養(yǎng)基，光照16h/天，25±3°C。
8.如權(quán)利要求2所述的組織培養(yǎng)方法，其中，在第4)步中，將所述體細(xì)胞胚培養(yǎng)成再生植株的方法包括將所述體細(xì)胞胚移到生根培養(yǎng)基中，光照16h/天，25±3°C，培養(yǎng)3 4周，培養(yǎng)成再生苗。
9.如權(quán)利要求8所述的組織培養(yǎng)方法，其中，將所述體細(xì)胞胚培養(yǎng)成再生植株的方法還包括將所述再生苗洗干凈，移栽到滅菌的蛭石/珍珠巖=3 I的花盆中，澆灌無菌的MSB溶液，放到保濕盒中培養(yǎng)2周復(fù)壯，光照16h/天，25±3°C，然后移栽到大田中。
10.如權(quán)利要求1-9中任一所述的組織培養(yǎng)方法，其中，所述大豆選自綏農(nóng)28、墾豐16或合豐55。
全文摘要
本發(fā)明公開通過大豆成熟種子子葉節(jié)作為外植體產(chǎn)生體細(xì)胞胚獲得再生植株的方法，涉及農(nóng)作物組織培養(yǎng)方法領(lǐng)域。主要步驟包括成熟的大豆籽粒萌發(fā)得到子葉節(jié)外植體，大豆愈傷組織的誘導(dǎo)，大豆體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)，大豆體細(xì)胞胚的分化，大豆幼胚的伸長與生根，大豆再生苗煉苗及移栽大田。該方法簡單，易操作，不受季節(jié)限制，能有效的通過體細(xì)胞胚獲得大豆再生苗。
文檔編號A01H4/00GK102919131SQ20121047680
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月21日
發(fā)明者閆軍輝, 鐘云鵬, 程琳靜, 王彪, 武天龍 申請人:上海交通大學(xué)