專利名稱：粉狀葡萄土壤桿菌菌株ae206生物農(nóng)藥的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物農(nóng)藥的制備方法，特別是葡萄土壤桿菌菌株AE206生物農(nóng)藥的制備方法，屬于葡萄土壤桿菌菌株AE206生物農(nóng)藥制備領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
根癌病是由根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)引起的一種世界范圍的細(xì)菌性病害，病原菌寄主范圍廣，可侵染93科331屬643種高等植物，除侵染桃、李、杏、櫻桃、梨、蘋果等主要果樹外，還能危害葡萄、棗、木瓜、板栗、核桃等多種果樹。病樹樹勢(shì)衰弱，生長遲緩，產(chǎn)量降低，壽命縮短，嚴(yán)重者絕產(chǎn)甚至死亡。葡萄土壤桿菌菌株AE206 (Agrobacteriun vitis AE206)為細(xì)菌生物制劑，該菌屬于土壤桿菌，能在葡萄等苗 木根部定殖，保護(hù)傷口、產(chǎn)生抗菌素抑制根癌病菌，對(duì)根癌病有良好的預(yù)防作用。關(guān)于葡萄土壤桿菌菌株AE206生物農(nóng)藥的制備方法目前報(bào)道的不多。CN101451112A(CN101451112B，2010年9月15日授權(quán))公開了一種葡萄土壤桿菌菌株AE206(保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏登記號(hào)為CGMCC No. 2408)、其菌劑和制備方法，但不具備規(guī)模化生產(chǎn)水平。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，通過對(duì)葡萄土壤桿菌菌株AE206生物農(nóng)藥制備方法中各種工藝條件的選擇，提供一種可大規(guī)模生產(chǎn)葡萄土壤桿菌菌株AE206生物農(nóng)藥的方法，獲得的葡萄土壤桿菌菌株AE206生物農(nóng)藥的袍子產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低。本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種粉狀葡萄土壤桿菌菌株AE206生物農(nóng)藥的制備方法，其包括如下步驟制備菌種；第一次發(fā)酵，即種子罐發(fā)酵；第二次發(fā)酵，即生產(chǎn)罐發(fā)酵；制造粉狀生物農(nóng)藥，其特征在于，所述制備菌種中，搖瓶培養(yǎng)基由蔗糖、牛肉膏、酵母粉或酵母抽提粉、MgSO4WH2O和蒸餾水構(gòu)成；所述第一次發(fā)酵中，所用培養(yǎng)基由蔗糖、酵母膏、K2HPO4, MgSO4 7H20、KC1、CaCl2和水構(gòu)成；所述第二次發(fā)酵中，所用培養(yǎng)基由綿白糖、玉米漿膏、K2HPO4, MgSO4 7H20、KC1、CaCl2和水構(gòu)成。如上所述制備方法，所述制備菌種中的搖瓶培養(yǎng)基的具體組成為蔗糖5g、牛肉膏5g、酵母粉或酵母抽提粉Ig、MgSO4 7H20 0. 5g和蒸餾水1000ml。如上所述制備方法，所述第一次發(fā)酵中所用培養(yǎng)基的具體組成為蔗糖20g、酵母膏 5g、K2HP04 3g、MgS04 7H20 0.3g、KCl 0. 15g, CaCl2 0. Olg 和水 1000ml。如上所述制備方法，所述第二次發(fā)酵中所用培養(yǎng)基的具體組成為綿白糖20g、玉米漿膏 15g、K2HPO4 3g、MgSO4 7H20 0. 3g、KCl 0. 15g、CaCl2 0. Olg 和水 1000ml。如上所述制備方法，所述制備菌種中，搖瓶培養(yǎng)的搖瓶的裝量為1/3，搖床轉(zhuǎn)速為180rpmo如上所述制備方法，所述第一次發(fā)酵中，發(fā)酵罐的裝罐系數(shù)為0. 6-0. 7、攪拌速度為 200_300rpm。如上所述制備方法，所述第二次發(fā)酵中，發(fā)酵罐的裝罐系數(shù)為0. 6-0. 7、攪拌速度為 200_300rpm。本發(fā)明的有益效果通過本發(fā)明的方法，可以獲得含水量為10-30%的粉狀制劑，每批次可生產(chǎn)所述粉狀制劑2000kg以上，優(yōu)選2400kg至2800kg，其活菌數(shù)在109cfu/g以上，可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，且生產(chǎn)成本低。
具體實(shí)施例方式根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中菌株為葡萄土壤桿菌菌株AE206，是可以購買得到的，也可以通過如CN101451112A中公開的方法培養(yǎng)得到，即采用平板培養(yǎng)基(牛肉膏，NaCl，瓊脂等)，在25 33° C培養(yǎng)48小時(shí)。所述菌株可通過以下方法保存(I)長期保存方法冷凍干燥保存；(2)短期保存方法試管斜面液體石蠟封存2-4° C低溫保存。 根據(jù)本發(fā)明的制備方法，所述菌種通過以下方法制備得到(I)平板及試管菌種的制備將低溫保存的菌株在平板培養(yǎng)基上劃線25 33° C活化，挑取單菌落在斜面培養(yǎng)基上擴(kuò)繁備用。(2)搖瓶菌種的制備搖瓶培養(yǎng)基配方鹿糖5g、牛肉膏5g、酵母粉或酵母抽提粉lg、MgS04 *7H200. 5g和蒸餾水 1000ml, pH 為 7. 0-7. 2。(3)搖瓶培養(yǎng)條件搖瓶裝量為1/3，在28±1° C下，培養(yǎng)24-36小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm。(4)接種用無菌水將試管斜面菌種配制成菌懸液，按2-5%體積比接種。(5)獲得菌種顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，與純菌種一致，菌體為短桿狀，單細(xì)胞；革蘭氏染色，為陰性；搖瓶菌種微黃色，無臭味，活菌數(shù)在109cfu/ml以上。根據(jù)本發(fā)明的制備方法，所述第一次發(fā)酵(種子罐發(fā)酵)具體為配置種子罐培養(yǎng)基蔗糖20g、酵母膏 5g、K2HP04 3g、MgS04 *7H20 0. 3g、KCl 0. 15g、CaCl2 0. Olg 和水 1000ml, pH=7. 2。種子罐滅菌、接種量和接種溫度121° C滅菌I小時(shí)；接種量為5%體積比，接種溫度為28±1° C；發(fā)酵控制及發(fā)酵時(shí)間裝罐系數(shù)為0. 6-0. 7，溫度為28±1° C，攪拌速度為200 300rpm，取樣間隔時(shí)間為4小時(shí)，發(fā)酵周期為18-24小時(shí)；所得的種子液，微黃色，無臭味，活菌數(shù)在109cfu/ml以上。在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，與純菌種一致，菌體為短桿狀，單細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的制備方法，所述第二次發(fā)酵(生產(chǎn)罐發(fā)酵)具體為配置生產(chǎn)罐培養(yǎng)基綿白糖20g、玉米漿膏15g、K2HPO4 3g、MgSO4 7H200. 3g、KCl0. 15g、CaCl2 0. Olg 和水 1000ml, pH=7. 2。生產(chǎn)罐滅菌、接種量和接種溫度121° C滅菌I小時(shí)；接種量為2%體積比，接種溫度為28±1° C；發(fā)酵控制及發(fā)酵周期裝罐系數(shù)為0. 6-0. 7，溫度為28±1° C，攪拌速度為200 300rpm，不需調(diào)節(jié)pH值。取樣間隔時(shí)間為3小時(shí)，發(fā)酵周期為24-30小時(shí)；所得菌液，微黃色，無臭味，活菌數(shù)在109cfu/ml以上。在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，與純菌種一致，菌體為短桿狀，單細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的制備方法，所述粉狀制劑的制備具體為將上述第二次發(fā)酵后的AE206發(fā)酵液與滅菌后的草炭直接混合，重量份數(shù)比為I :5，攪拌均勻，然后遮蔭風(fēng)干。使其成為含水量為10-30%的粉狀制劑，分裝即可。根據(jù)本發(fā)明的制備方法，所述制劑通過以下步驟儲(chǔ)存
常溫(18° C-25° C)避光保存，防止日曬，保質(zhì)期為100-120天，避免與強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等接觸，避免與揮發(fā)性農(nóng)藥共同存放。本發(fā)明的有益效果通過本發(fā)明的方法，可以獲得含水量為10-30%的粉狀制劑，每批次可生產(chǎn)粉狀制劑2000kg以上，優(yōu)選2400kg至2800kg，其活菌數(shù)在109cfu/g以上，可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，且生產(chǎn)成本低。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于實(shí)施例。實(shí)施例I通過以下步驟制備粉狀制劑(I)制備菌種葡萄土壤桿菌菌株AE206 (Agrobacteriun vitis AE206)米用試管斜面液體石臘封存2-4° C低溫保存。將上述低溫保存的菌株在平板培養(yǎng)基上劃線30° C活化，挑取單菌落在斜面培養(yǎng)基上擴(kuò)繁備用。配置搖瓶培養(yǎng)基鹿糖5g、牛肉膏5g、酵母粉或酵母抽提粉lg、MgSO4 IW2O 0. 5g和蒸餾水 1000ml, pH 為 7. 0-7. 2。搖瓶裝量為1/3，在28±1° C下，培養(yǎng)36小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm。用無菌水將試管斜面菌種配制成菌懸液，按4%體積比接種。顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，與純菌種一致，菌體為短桿狀，單細(xì)胞，革蘭氏染色，為陰性；搖瓶菌種微黃色，無臭味，活菌數(shù)在IO9CfuAil以上。 (2)第一次發(fā)酵(種子罐發(fā)酵)配置種子罐培養(yǎng)基蔗糖20g、酵母膏 5g、K2HPO4 3g、MgSO4 7H20 0. 3g、KCl 0. 15g、CaCl2O. Olg 和水1000ml, pH=7. 2。種子罐滅菌、接種量和接種溫度121° C滅菌I小時(shí)；接種量為5%體積比，接種溫度為28±1° C。發(fā)酵控制及發(fā)酵時(shí)間裝罐系數(shù)為0. 6，溫度為28±1° C，攪拌速度為250rpm，取樣間隔時(shí)間為4小時(shí)。發(fā)酵周期為20小時(shí)。所得種子液，微黃色，無臭味，活菌數(shù)在2 X 109cfu/ml。在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，與純菌種一致，菌體為短桿狀，單細(xì)胞。( 3 )第二次發(fā)酵(生產(chǎn)罐發(fā)酵)
配置生產(chǎn)罐培養(yǎng)基綿白糖20g、玉米漿膏 15g,K2HPO4 3g、MgS04 7H20 0. 3g、KCl 0. 15g、CaCl2 0. Olg和水 1000ml, pH=7. 2。生產(chǎn)罐滅菌、接種量和接種溫度121° C滅菌I小時(shí)。接種量為2%體積比，接種溫度為28±1° C。發(fā)酵控制及發(fā)酵周期裝罐系數(shù)為0. 6，溫度為28±1°C，攪拌速度為250rpm，不需調(diào)節(jié)pH值。取樣間隔時(shí)間為3小時(shí)，發(fā)酵周期為26小時(shí)。所得菌液，微黃色，無臭味，活菌數(shù)在2X109cfu/ml。在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，與純菌種一致，菌體為短桿狀，單細(xì)胞。(4)成品制備和儲(chǔ)存第二次發(fā)酵的AE206發(fā)酵液與滅菌后的草炭直接混合，重量份數(shù)比為I :5，攪拌均勻，然后遮蔭風(fēng)干。使其成為含水量為20%的粉狀制劑，分裝即可。產(chǎn)品的儲(chǔ)存常溫(18°C_25°C)避光保存，防止日曬，保質(zhì)期為100-120天，避免與強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等接觸，避免與揮發(fā)性農(nóng)藥共同存放。實(shí)施例2 步驟同實(shí)施例1，具體參數(shù)及結(jié)果見表I。實(shí)施例3 步驟同實(shí)施例I，具體參數(shù)及結(jié)果見表I。表I
權(quán)利要求
1.一種粉狀葡萄土壤桿菌菌株AE206生物農(nóng)藥的制備方法，其包括如下步驟制備菌種；第一次發(fā)酵，即種子罐發(fā)酵；第二次發(fā)酵，即生產(chǎn)罐發(fā)酵；制造粉狀生物農(nóng)藥，其特征在于，所述制備菌種中，搖瓶培養(yǎng)基由蔗糖、牛肉膏、酵母粉或酵母抽提粉、MgSO4 7H20和蒸餾水構(gòu)成；所述第一次發(fā)酵中，所用培養(yǎng)基由蔗糖、酵母膏、K2HPO4, MgSO4 7H20、KC1、CaCl2和水構(gòu)成；所述第二次發(fā)酵中，所用培養(yǎng)基由綿白糖、玉米漿膏、K2HPO4, MgSO4 7H20、KC1、CaCl2和水構(gòu)成。
2.如權(quán)利要求I所述制備方法，所述制備菌種中，搖瓶培養(yǎng)的搖瓶的裝量為1/3，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm。
3.如權(quán)利要求I或2所述制備方法，所述第一次發(fā)酵中，發(fā)酵罐的裝罐系數(shù)為0.6-0. 7、攪拌速度為 200-300rpm。
4.如權(quán)利要求I至3之一所述制備方法，所述第二次發(fā)酵中，發(fā)酵罐的裝罐系數(shù)為0.6-0. 7、攪拌速度為 200-300rpm。
5.如權(quán)利要求I至4之一所述制備方法，所述制備菌種中的搖瓶培養(yǎng)基的組成具體為蔗糖5g、牛肉膏5g、酵母粉或酵母抽提粉lg、MgSO4 7H20 0. 5g和蒸餾水1000ml。
6.如權(quán)利要求I至5之一所述制備方法，所述第一次發(fā)酵中所用培養(yǎng)基的組成具體為蔗糖 20g、酵母膏 5g、K2HPO4 3g、MgSO4 7H20 0.3g、KCl 0.15g、CaCl2 0. Olg 和水 1000ml。
7.如權(quán)利要求I至6之一所述制備方法，所述第二次發(fā)酵中所用培養(yǎng)基的組成具體為綿白糖 20g、玉米漿膏 15g、K2HPO4 3g、MgSO4 7H20 0. 3g、KC10. 15g、CaCl2 0. Olg 和水IOOOml0
全文摘要
本發(fā)明提供一種粉狀葡萄土壤桿菌菌株AE206生物農(nóng)藥的制備方法，其包括如下步驟制備菌種；第一次發(fā)酵，即種子罐發(fā)酵；第二次發(fā)酵，即生產(chǎn)罐發(fā)酵；制造粉狀生物農(nóng)藥，其特征在于，所述制備菌種中，搖瓶培養(yǎng)基由蔗糖、牛肉膏、酵母粉或酵母抽提粉、MgSO4·7H2O和蒸餾水構(gòu)成。通過對(duì)葡萄土壤桿菌菌株AE206生物農(nóng)藥制備方法中各種工藝條件的選擇，提供一種可大規(guī)模生產(chǎn)葡萄土壤桿菌菌株AE206生物農(nóng)藥的方法，獲得的葡萄土壤桿菌菌株AE206生物農(nóng)藥的袍子產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低。
文檔編號(hào)A01P1/00GK102960368SQ20121049179
公開日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月27日
發(fā)明者梁洪柱, 田會(huì)鵬, 陳倩, 李學(xué)燕 申請(qǐng)人:北京市西山試驗(yàn)林場