專利名稱：一種獲得巴戟天體細(xì)胞再生植株的方法及其培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種獲得巴戟天體細(xì)胞再生植株的方法及其培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
巴戟天(Morinda off icinalis How.)是菌草科多年生木質(zhì)藤本植物，肉質(zhì)根入藥，根皮含蒽醌化合物，環(huán)烯醚萜甙、植物留醇及多糖、低聚糖等藥用成分。具有補(bǔ)腎壯陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕等功效，用途十分廣泛，是目前我國出口創(chuàng)匯和內(nèi)需的主要中藥品之一，力口上近年來巴戟天的市場需求量大，以至巴戟天的栽培規(guī)模不斷擴(kuò)大，由于巴戟天種植是剪取自身藤條作為種苗，對于大規(guī)模種植時所需種苗產(chǎn)生了瓶頸制約，本技術(shù)是利用植物細(xì)胞的全能性進(jìn)行苗木培育植物體的每一個細(xì)胞都攜帶著一套完整的基因組，并具有發(fā)育為完整植株的潛能，因為每個細(xì)胞都是來自于受精卵，所以有與受精卵具有相同的遺傳物質(zhì)?；谥参锎颂攸c，有必要對巴戟天進(jìn)行組培快繁研究，為種植戶提供優(yōu)質(zhì)、大量巴戟天種苗，切實解決巴戟天苗木需求的瓶頸，提高巴戟天種植產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種用于獲得巴戟天(Morinda officinalis How.)體細(xì)胞再生植株的成套培養(yǎng)基，它含有獨(dú)立包裝的培養(yǎng)基A (即誘導(dǎo)培養(yǎng)基)，所述培養(yǎng)基A為由MS基本培養(yǎng)基、細(xì)胞分裂素、生長素、蔗糖或葡萄糖、和凝固劑制成的固體培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)基A中的所述細(xì)胞分裂素的含量為O. lmg/L ；所述培養(yǎng)基A中的所述生長素的含量為0. lmg/L ο在上述成套培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基A中的所述細(xì)胞分裂素為6-BA或KT ；和/或，所述培養(yǎng)基A中的所述生長素為2，4-D或NAA ；和/或，所述培養(yǎng)基A中的所述蔗糖或葡萄糖的含量為20g/L ；和/或，所述培養(yǎng)基A中的所述凝固劑為瓊脂，所述瓊脂在所述培養(yǎng)基A中的含量為 7 — 8g/L。在上述成套培養(yǎng)基中，還可含有獨(dú)立包裝的培養(yǎng)基B (即增殖培養(yǎng)基)，所述培養(yǎng)基B為由MS基本培養(yǎng)基、細(xì)胞分裂素、生長素、蔗糖和凝固劑制成的固體培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)基B中的所述細(xì)胞分裂素的含量為I. 0—2. 0mg/L ；所述培養(yǎng)基B中的所述生長素的含量為0. 5mg/L。在上述成套培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基B中的所述細(xì)胞分裂素為6-BA ；和/或，所述培養(yǎng)基B中的所述生長素為2，4-D或NAA ；和/或，所述培養(yǎng)基B中的所述蔗糖的含量為20g/L ；和/或，所述培養(yǎng)基B中的所述凝固劑為瓊脂，所述瓊脂在所述培養(yǎng)基B中的含量為 7 — 8g/L。在上述成套培養(yǎng)基中，還可含有獨(dú)立包裝的培養(yǎng)基C (即生根培養(yǎng)基)，所述培養(yǎng)基C為由1/2 —1/8的MS基本培養(yǎng)基、NAA和凝固劑制成的固體培養(yǎng)基；
所述培養(yǎng)基C中的所述NAA的含量為O. 01—0. lmg/L,如O. 01mg/L、0. 05mg/L或
O.lmg/L ；所述培養(yǎng)基C中的所述凝固劑具體為瓊脂，所述瓊脂在所述培養(yǎng)基C中的含量為4—6g/L。本發(fā)明的另一個目的是提供一種獲得巴戟天(Morinda officinalis How.)體細(xì)胞再生植株的方法，所述方法包括將所述巴戟天的帶節(jié)莖段用所述培養(yǎng)基A進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng) 獲得巴戟天不定芽的步驟。所述方法還可包括將所述巴戟天不定芽用所述培養(yǎng)基B進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)以獲得更多不定芽的步驟。所述方法還可包括將所述巴戟天不定芽用所述培養(yǎng)基C進(jìn)行生根培養(yǎng)的步驟。在上述方法中，所述將所述巴戟天的帶節(jié)莖段用所述培養(yǎng)基A進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)前，包括將所述巴戟天的帶節(jié)莖段按照包括如下步驟I) -2)的方法進(jìn)行消毒的步驟I)用體積百分含量為75%的乙醇溶液浸泡30秒；2)用有效氯質(zhì)量百分含量為10%的次氯酸鈉溶液浸泡20分鐘。在上述方法中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的光照條件為先黑暗培養(yǎng)7天再按照如下光照條件培養(yǎng)每天24小時中光照12小時，光照的強(qiáng)度為1000—30001UX，其余時間為黑暗；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度為26°C—28°C ；和/或，所述擴(kuò)繁培養(yǎng)的光照條件為先在每天24小時中光照12小時、光照強(qiáng)度為20001UX、其余時間為黑暗的條件下培養(yǎng)7天，再移至每天24小時中光照12小時，光照強(qiáng)度為1000— 1500LUX，其余時間為黑暗的條件下培養(yǎng)；所述擴(kuò)繁培養(yǎng)的溫度為26°C—28°C ；和/或，所述生根培養(yǎng)的光照條件為先在每天24小時中光照12小時，光照強(qiáng)度為1000— 1500LUX，其余時間為黑暗的條件下培養(yǎng)，再移至1000-20001UX條件下培養(yǎng)；所述生根培養(yǎng)的溫度為22°C。所述MS基本培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如表I所示。使用本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法進(jìn)行巴戟天體細(xì)胞再生植株培養(yǎng)的優(yōu)點如下誘發(fā)巴戟天不定芽的時間短，從接種帶節(jié)莖段至獲得l-3cm長的不定芽只需15天，而現(xiàn)有技術(shù)一般為20-30天；增殖頻率高，繁殖系數(shù)為(46-56)/50天，現(xiàn)有技術(shù)一般為6/50天；生長周期短、且苗齊苗壯、生長良好。本發(fā)明為巴戟天組培快繁提供了一種高效的方法和途徑。


圖I為巴戟天經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的帶不定芽的莖段。圖2為巴戟天不定芽經(jīng)擴(kuò)繁培養(yǎng)獲得的叢生芽。圖3為巴戟天的生根培養(yǎng)。圖4為包括根莖葉的巴戟天再生植株。圖5為經(jīng)組織培養(yǎng)獲得的巴戟天再生植株移栽后的杯苗。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
下述實施例中所用的MS基本培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如表I所示。表I. MS基本培養(yǎng)基
大量元素j培養(yǎng)基中濃度(g· L/1)
NH4NO31.65
KNO^~L9
KH2PO4O. 17
MgSO4 · 7H20O. 37
CaCl2 · 2H200. 44
微量元素培養(yǎng)基中濃度(m g · L'1)
FeSO4 · 7H2027. 8
Na2EDTA37. 3
MnSO4 · 4H2022. 3
ZnSO4 · 4Η20δΓθ
H3BO36.2
Κ 0.83
Na2MoO4 · 2Η20O. 25
CuSO4 · 5Η20O. 025
CoCl2 · 6Η20O. 025
有機(jī)成分培養(yǎng)基中濃度(mg · L/1)
甘氨酸270
鹽酸硫胺素0Π鹽酸吡哆素
煙酸VB50Γδ
肌醇100
實施例I、獲得巴戟天體細(xì)胞再生植株的方法I、外植體的獲取選擇生長優(yōu)良的巴戟天(Morinda officinalis How.)枝條,采集巴戟天新梢生至30 50 cm的莖，選擇晴好的天氣，剪下新枝，除去葉子，留一小段葉柄，立即放入裝有少量清水的塑料袋運(yùn)回組培室；先用自來水沖洗15分鐘，去掉老葉，剪成約3 cm 5 cm長的帶節(jié)莖段。2、外植體的消毒將步驟I獲得的巴戟天帶節(jié)莖段在超凈工作臺中進(jìn)行如下消毒處理用體積百分含量為75%的乙醇溶液浸泡30秒；除去液體后用無菌水洗一遍；用有效氯質(zhì)量百分含量為10%的次氯酸鈉溶液浸泡20分鐘，除去液體用無菌水洗三至五次；用無菌吸水紙吸干巴戟天帶節(jié)莖段表面水 份。3、芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)無菌條件下，將經(jīng)步驟2消毒處理過的帶節(jié)莖段的兩端傷口剪去，獲得I一2cm長的帶節(jié)莖段，插入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)；培養(yǎng)的光照條件為先黑暗培養(yǎng)I周再按照如下光照條件培養(yǎng):每天24小時中光照12小時，光照的強(qiáng)度為1000— 3000LUX，其余時間為黑暗；培養(yǎng)溫度為26°C—28°C ;空氣濕度在70%以下。經(jīng)上述誘導(dǎo)培養(yǎng)的莖段，其莖節(jié)處會長出不定芽(圖1)，當(dāng)不定芽長為I一3 Cm時，可用于步驟4的增殖培養(yǎng)。上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是MS基本培養(yǎng)基(表I )，向MS基本培養(yǎng)基中添加激素 NAA O. lmg/L、6-BA O. lmg/L,葡萄糖 20g/L 和瓊脂 7g/L,滅菌前調(diào) pH 值為 5. 7,121 °C 高壓滅菌20min，得到的固體培養(yǎng)基即為該誘導(dǎo)培養(yǎng)基。統(tǒng)計方法隨機(jī)取30— 45個帶節(jié)莖段，每10 —15個為一個重復(fù)，在帶節(jié)莖段插入誘導(dǎo)培養(yǎng)基7天后，統(tǒng)計污染率(長菌莖段數(shù)/插入莖段數(shù));在插入誘導(dǎo)培養(yǎng)基14天后，統(tǒng)計誘導(dǎo)率(即獲得長I一3 cm不定芽的莖段數(shù)占插入莖段數(shù)的百分比)。結(jié)果如表2所示。4、芽的擴(kuò)繁培養(yǎng)無菌條件下，將步驟3獲得的長為1-3 Cm的不定芽切下，接種于增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)獲得叢生芽(圖2);培養(yǎng)的光照條件為先在每天24小時中光照12小時、光照強(qiáng)度為20001UX、其余時間為黑暗的條件下培養(yǎng)7天，再移至每天24小時中光照12小時，光照強(qiáng)度為1000-1500LUX，其余時間為黑暗的條件下培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度為26°C—28°C ;空氣濕度在70%以下。上述增殖培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是MS基本培養(yǎng)基，向MS基本培養(yǎng)基中添加NAAO. 5mg/L、6-BA 2mg/L、鹿糖20g/L和瓊脂7g/L,滅菌前調(diào)pH值為5. 7,121°C高壓滅菌20min，得到的固體培養(yǎng)基即為該增殖培養(yǎng)基。每個接種的不定芽經(jīng)擴(kuò)繁培養(yǎng)發(fā)育為一個叢生芽，當(dāng)叢生芽長到高為2 Cm時，將叢生芽分成的高為I一2cm單個不定芽，轉(zhuǎn)移至新配制的增殖培養(yǎng)基按照同樣方法進(jìn)行再次擴(kuò)繁培養(yǎng)。統(tǒng)計方法隨機(jī)取96—120個初次擴(kuò)繁培養(yǎng)的不定芽，每32— 40個不定芽為一個重復(fù)，經(jīng)擴(kuò)繁培養(yǎng)50天后(即擴(kuò)繁2次，每次25天)，統(tǒng)計繁殖系數(shù)(即獲得高為I一2cm的不定芽數(shù)目/初次擴(kuò)繁培養(yǎng)的不定芽數(shù)目)，結(jié)果如表2所示。5、生根培養(yǎng)從經(jīng)步驟4擴(kuò)繁培養(yǎng)2次獲得的高為2 cm的叢生芽上取高為I一2 Cm的不定芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)(圖3)，獲得包括根莖葉的巴戟天再生植株(圖4);生根培養(yǎng)的光照條件為先在每天24小時中光照12小時，光照強(qiáng)度為1000— 1500LUX，其余時間為黑暗的條件下培養(yǎng)，再移至1000-200LUX條件下培養(yǎng)；所述生根培養(yǎng)的溫度為22°C。上述生根培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是1/2的MS基本培養(yǎng)基，向1/2MS基本培養(yǎng)基中添加NAA O. 01mg/L、瓊脂4g/L，滅菌前調(diào)pH值為5. 7，121°C高壓滅菌20min，得到的固體培養(yǎng)基即為該生根培養(yǎng)基。 統(tǒng)計方法隨機(jī)取60個進(jìn)行生根培養(yǎng)的不定芽，每20個為一個重復(fù)，經(jīng)生根培養(yǎng)7天后，統(tǒng)計生根率(即生根的再生植株數(shù)占進(jìn)行生根培養(yǎng)的不定芽數(shù)的百分比)，同時觀察再生植株主根粗壯，須根較多，葉色濃綠，苗莖紫紅。結(jié)果如表2所示。6、再生植株的移栽待步驟5獲得的包括根莖葉的再生植株長至含5片葉以上時，從培養(yǎng)基中取出，洗去培養(yǎng)基，用多菌靈浸泡10分鐘，移栽到黃心土和泥炭土(或椰糠)為2:10的混合基質(zhì)中，置于溫室中進(jìn)行常規(guī)栽培管理，定時澆水，注意遮光保濕。30天后統(tǒng)計再生植株的移栽成活率，結(jié)果如表2所不。表2.巴戟天體細(xì)胞植株再生實驗結(jié)果(一)
SM~j污染率(％)~j誘導(dǎo)率(％)~j繁殖系數(shù)(50天)~j生根率(％) j成活率(％)
11080598085
2685527590
3789587884 平均~~ 85 56 77 86實施例2、獲得巴戟天體細(xì)胞再生植株的方法I、外植體的獲取與實施例I中步驟I的方法相同。2、外植體的消毒與實施例I中步驟I的方法相同。3、芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)按照實施例I中步驟3的方法進(jìn)行，不同之處在于誘導(dǎo)培養(yǎng)基是向MS基本培養(yǎng)基中添加 2，4-D O. lmg/L, KT O. lmg/L,蔗糖 20g/L 和瓊脂 8g/L。4、芽的擴(kuò)繁培養(yǎng)按照實施例I中步驟4的方法進(jìn)行，不同之處在于增殖培養(yǎng)基是向MS基本培養(yǎng)基中添加 NAA O. 5mg/L、6-BA 2mg/L、鹿糖 20g/L 和瓊脂 7. 5g/L。
5、生根培養(yǎng)按照實施例I中步驟5的方法進(jìn)行，不同之處在于生根培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是1/6的MS基本培養(yǎng)基，向該基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加NAA O. 05mg/L和瓊脂5g/L。6、再生植株的移栽按照實施例I中步驟6的方法進(jìn)行。結(jié)果如表3所示。表3.巴戟天 體細(xì)胞植株再生實驗結(jié)果權(quán)利要求
1.用于獲得巴戟天(Morindaofficinalis How.)體細(xì)胞再生植株的成套培養(yǎng)基,其特征在于所述成套培養(yǎng)基中含有獨(dú)立包裝的培養(yǎng)基A，所述培養(yǎng)基A為由MS基本培養(yǎng)基、細(xì)胞分裂素、生長素、蔗糖或葡萄糖、和凝固劑制成的固體培養(yǎng)基； 所述培養(yǎng)基A中的所述細(xì)胞分裂素的含量為O. lmg/L ； 所述培養(yǎng)基A中的所述生長素的含量為O. lmg/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的成套培養(yǎng)基，其特征在于 所述培養(yǎng)基A中的所述細(xì)胞分裂素為6-BA或KT ； 和/或，所述培養(yǎng)基A中的所述生長素為2，4-D或NAA ； 和/或，所述培養(yǎng)基A中的所述蔗糖或葡萄糖的含量為20g/L ； 和/或，所述培養(yǎng)基A中的所述凝固劑為瓊脂，所述瓊脂在所述培養(yǎng)基A中的含量為7—8g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的成套培養(yǎng)基，其特征在于所述成套培養(yǎng)基中含有獨(dú)立包裝的培養(yǎng)基B，所述培養(yǎng)基B為由MS基本培養(yǎng)基、細(xì)胞分裂素、生長素、蔗糖和凝固劑制成的固體培養(yǎng)基； 所述培養(yǎng)基B中的所述細(xì)胞分裂素的含量為I. 0—2. Omg/L ； 所述培養(yǎng)基B中的所述生長素的含量為O. 5mg/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的成套培養(yǎng)基，其特征在于 所述培養(yǎng)基B中的所述細(xì)胞分裂素為6-BA ； 和/或，所述培養(yǎng)基B中的所述生長素為2，4-D或NAA ； 和/或，所述培養(yǎng)基B中的所述蔗糖的含量為20g/L ； 和/或，所述培養(yǎng)基B中的所述凝固劑為瓊脂，所述瓊脂在所述培養(yǎng)基B中的含量為7—8g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求I一4中任一所述的成套培養(yǎng)基，其特征在于所述成套培養(yǎng)基中含有獨(dú)立包裝的培養(yǎng)基C，所述培養(yǎng)基C為1/2 —1/8的MS基本培養(yǎng)基、NAA和凝固劑制成的固體培養(yǎng)基； 所述培養(yǎng)基C中的所述NAA的含量為O. 01—0. lmg/L ； 所述培養(yǎng)基C中的所述凝固劑具體為瓊脂，所述瓊脂在所述培養(yǎng)基C中的含量為4一6g/L。
6.獲得巴戟天(Morindaofficinalis How.)體細(xì)胞再生植株的方法,其特征在于所述方法包括將所述巴戟天的帶節(jié)莖段用權(quán)利要求I或2中的所述培養(yǎng)基A進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得巴戟天不定芽的步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述方法包括將所述巴戟天不定芽用權(quán)利要求3或4中的所述培養(yǎng)基B進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)的步驟。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述方法包括將所述巴戟天不定芽用權(quán)利要求5中的所述培養(yǎng)基C進(jìn)行生根培養(yǎng)的步驟。
9.根據(jù)權(quán)利要求6—8中任一所述的方法,其特征在于 所述將所述巴戟天的帶節(jié)莖段用權(quán)利要求I或2中的所述培養(yǎng)基A進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)前，將所述巴戟天的帶節(jié)莖段按照包括如下步驟I) -2)的方法進(jìn)行消毒的步驟 I)用體積百分含量為75%的乙醇溶液浸泡30秒；2)用有效氯質(zhì)量百分含量為10%的次氯酸鈉溶液浸泡20分鐘。
10.根據(jù)權(quán)利要求6—9中任一所述的方法,其特征在于 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的光照條件為先黑暗培養(yǎng)7天再按照如下光照條件培養(yǎng)每天24小時中光照12小時，光照的強(qiáng)度為1000— 30001UX，其余時間為黑暗；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度為260C-280C ； 和/或，所述擴(kuò)繁培養(yǎng)的光照條件為先在每天24小時中光照12小時、光照強(qiáng)度為20001UX、其余時間為黑暗的條件下培養(yǎng)7天，再移至每天24小時中光照12小時，光照強(qiáng)度為1000— 1500LUX，其余時間為黑暗的條件下培養(yǎng)；所述擴(kuò)繁培養(yǎng)的溫度為26°C—28°C ； 和/或，所述生根培養(yǎng)的光照條件為先在每天24小時中光照12小時，光照強(qiáng)度為1000— 1500Lux，其余時間為黑暗的條件下培養(yǎng)，再在1000-2000Lux條件下培養(yǎng)；所述生根培養(yǎng)的溫度為22°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種獲得巴戟天體細(xì)胞再生植株的方法及其培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基為成套培養(yǎng)基，包括誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和/或生根培養(yǎng)基；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為在MS基本培養(yǎng)基中添加細(xì)胞分類素(6-BA或KT)0.1mg/L和生長素(2,4-D或NAA)0.1mg/L；所述增殖培養(yǎng)基為在MS基本培養(yǎng)基中添加細(xì)胞分類素(6-BA)1.0—2.0mg/L和生長素(2,4-D或NAA)0.5mg/L；所述生根培養(yǎng)基為在1/2—1/8MS基本培養(yǎng)基中添加NAA 0.01—0.1mg/L。本發(fā)明的優(yōu)點如下誘發(fā)巴戟天不定芽的時間短，從接種帶節(jié)莖段至獲得1-3cm長的不定芽只需15天；增殖頻率高，繁殖系數(shù)為(46—56)/50天；生長周期短、且苗齊苗壯、生長良好。本發(fā)明為巴戟天組培快繁提供了一種高效的方法和途徑。
文檔編號A01H4/00GK102960251SQ20121051093
公開日2013年3月13日 申請日期2012年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月3日
發(fā)明者秦垂新, 羅江清, 姚松君, 郭愛玲, 鄭志娟, 梁展, 陳偉文, 孫君社, 鄭志安, 張秀清 申請人:無限極(中國)有限公司, 高要市董福行農(nóng)副產(chǎn)品種植管理有限公司