專利名稱：農桿菌介導轉基因培養(yǎng)大巖桐植株的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及大巖桐植株再生方法，尤其涉及農桿菌介導轉基因培養(yǎng)大巖桐植株的方法。
背景技術：
花卉作為鮮活觀賞商品，在圣誕節(jié)、元旦、春節(jié)等重大節(jié)日之前需求量大，其價格在需求高峰、一般、停滯等不同時期相差高達7、8倍，常常形成供給高潮與需求高峰期的錯位，導致很大的生產和流通風險。因此，運用現(xiàn)代基因工程技術培育有自主知識產權的目標花期花卉品種，不僅有利于保護花農的經濟利益，更有利于提升我國花卉產業(yè)的高科技含量，躋身于世界花卉生產強國的行列。
大巖桐(Sinningia speciosa)原產巴西，為苦苣苔科多年生球根花丼，是一種極好的春夏季節(jié)室內盆花，世界各地廣泛栽培。大巖桐外植體極易分化，在附加2. O mg/L 6-BA和O. 2 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上可不經愈傷組織而在外植體邊緣直接分化苗，生長也比較快速。
如中國發(fā)明專利(申請?zhí)?00410061427. 9申請日2004-12_24)，公開了一種大巖桐栽培方法，以組織培養(yǎng)的無根苗為材料，其步驟是，首先將大巖桐嫩梢切下；其次是將新梢插入基質中；第3是澆灌營養(yǎng)液；第4是將生根苗定植在相同的基質中。但是國內外對大巖桐的轉基因研究一直未見報道。發(fā)明內容
為了解決上述的技術問題，本發(fā)明的目的是提供一種農桿菌介導轉基因培養(yǎng)大巖桐植株的方法，該方法可以快速高效轉化大巖桐，獲得轉化植株。
為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用了以下的技術方案 農桿菌介導轉基因培養(yǎng)大巖桐植株的方法，該方法采用大巖桐幼嫩葉片作為外植體， 外植體預培后與去除培養(yǎng)物中殘存的抗生素和細菌代謝物的農桿菌菌株EHA105菌液共培，脫菌，再經過抗性篩選后，直接分化獲得轉基因植株。
作為優(yōu)選，上述的農桿菌菌株EHA105菌液的0D_為O. 2^0. 4，共培的時間為2 4天。
作為優(yōu)選，上述的共培的方法如下取出預培養(yǎng)的葉片于無菌的小燒杯中，加入制備好的菌液中浸3 8min，搖晃數(shù)次；取出葉片，在無菌濾紙上吸干多余的菌液，葉背朝上置于基本MS固體培養(yǎng)基上，25°C，暗培養(yǎng)2 4d。
作為優(yōu)選，上述的農桿菌菌株EHA105菌液培養(yǎng)采用含有卡那霉素和利福平LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。
作為最優(yōu)選，上述的農桿菌菌株EHA105菌液的制備方法如下I)從-70°C冰箱取出含有重組質粒的農桿菌菌株EHA105，在含有抗生素Kan 100 mg/ L, Rif 80 mg/L的LB固體培養(yǎng)基上劃線活化，直至培養(yǎng)基上長出農桿菌單菌落；2)取5 IOmlLB液體培養(yǎng)基，加入抗生素-卡那霉素和利福平，使其終濃度為 Kan 100mg/L, Rif 80mg/L ;從新鮮平板中挑取單菌落加入其中，搖勻，于28°C，180 r/min過夜培養(yǎng)至對數(shù)期，OD600約為O. 8 1. O ;3)吸取上述菌液Iml于1.5ml離心管中，4°C,4000rpm離心2min,去上清，再用30ml 1/2 MS懸浮農桿菌，再搖約l_2h，至菌液略顯混濁，OD600為O. 2^0. 4即可，備用。
作為優(yōu)選，上述的脫菌采用特美汀無菌溶液水洗。由于現(xiàn)有的羧芐青霉素和頭孢霉素連續(xù)使用后，抗性愈傷組織分化頻率較低，因此在本發(fā)明中選用特美汀(160 mg/L)除菌，這樣既能取得除菌效果又不影響抗性組織的分化能力。
作為優(yōu)選，上述的抗性篩選采用的標記基因是hpt，采用潮霉素作為選擇壓力。在大巖桐的轉化中，現(xiàn)有的卡那霉素篩選會干擾綠色植株的再生，而絕大多數(shù)植物對潮霉素比對卡那霉素敏感，潮霉素用于植物轉化比卡那霉素的效果好。故我們都是選用潮霉素作為抗性篩選標記。
作為優(yōu)選，上述的潮霉素的濃度為20mg/L。
作為優(yōu)選，上述的抗性篩選的抗性選擇培養(yǎng)基為MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.3 mg/ L+hgy 20mg/L+Tm 160 mg/L ;進行兩輪選擇培養(yǎng)，每輪持續(xù)12 15d。
作為優(yōu)選，上述的外植體預培取大巖桐無菌苗的中、上部的葉片，沿葉緣剪一圈， 接到含80 120 uM乙酰丁香酮的基本MS固體培養(yǎng)基上，25°C，暗培養(yǎng)2(T30h。本發(fā)明由于采用了上述的技術方案，借助農桿菌介導法，可以快速高效轉化大巖桐，獲得轉化植株首次成功獲得大巖桐轉基因植株，取得了較好的成果。


圖1轉基因大巖桐的組培過程。
圖2轉基因大巖桐的組培誘導分化以及生根。
圖3大巖桐轉化植株的再生。
圖4不同濃度潮霉素篩選壓下培養(yǎng)的大巖桐葉片。
具體實施方式
實施例1:農桿菌的培養(yǎng)(1)從_70°C冰箱取出含有重組質粒的農桿菌菌株EHA105，在含有抗生素(Kan100 mg/L, Rif 80 mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上劃線活化，直至培養(yǎng)基上長出農桿菌單菌落；(2)取5 IOmlLB液體培養(yǎng)基，加入抗生素——卡那霉素和利福平，使其終濃度為Kan 100mg/L, Rif 80mg/L。從新鮮平板中挑取單菌落加入其中，搖勻，于28°C， 180 r/min過夜培養(yǎng)至對數(shù)期，OD600約為O. 8 1. O ;(3)吸取上述菌液Iml于1.5ml離心管中(Iml X 2), 4°C, 4000rpm離心2min,去上清。 再用30ml 1/2 MS懸浮農桿菌(事先加入2ml 1/2 MS，用移液槍吸打均勻)，再搖約l_2h， 至菌液略顯混濁，0D600約為O. 3即可，備用。
實施例2 :外植體的處理取大巖桐無菌苗的中、上部的葉片，沿葉緣剪一圈，接到含100 uM乙酰丁香酮(As)的基本MS固體培養(yǎng)基上，25°C，暗培養(yǎng)Id。
實施例3 :轉化(1)取出預培養(yǎng)的葉片于無菌的小燒杯中，加入制備好的菌液中浸5min左右，搖晃數(shù)次；(2)取出葉片，在無菌濾紙上吸干多余的菌液，葉背朝上置于基本MS固體培養(yǎng)基上 ， 25°C，暗培養(yǎng)3 do
實施例4 :脫菌與篩選培養(yǎng)(1)暗培養(yǎng)3d后，從培養(yǎng)基中收集葉片到滅菌的小燒杯中，經如下過程洗滌無菌水漂洗3次一加入50ml含160mg/L特美汀(Tm)的無菌水洗2次一無菌濾紙吸干；(2)然后轉入抗性選擇培養(yǎng)基①上，進行兩輪選擇培養(yǎng)，每輪持續(xù)2周；潮霉素(hgy)選擇培養(yǎng)基①MS+6-BA 2 mg/L+NAA O. 3 mg/L+hgy 20mg/L+Tm 160 mg/L ；(3)將培養(yǎng)基①上再生的潮霉素抗性愈傷轉置生芽培養(yǎng)基②上；生芽培養(yǎng)基②MS+KT 2. 5 mg/L+NAA1. 9 mg/L+ GA31. O mg/L ；(4)將在生芽培養(yǎng)基②上長至2 3cm的植株移植到增殖培養(yǎng)基③上繼續(xù)培養(yǎng)； 增殖培養(yǎng)基③MS+KT 2. O mg/L+NAA O. 2 mg/L+ GA31. O mg/L ；(5)將增殖培養(yǎng)基③上長至2 3cm的植株移入生根培養(yǎng)基④上，做生根培養(yǎng)； 生根培養(yǎng)基④1/2 MS+NAA O. 2 mg/L+蔗糖2%。
實施例5 :轉化植株的PCR鑒定1、選取轉化植株，用CTAB-free法微量提取基因組DNA，做PCR模板，進行鑒定(O取少量幼葉，于液氮浴中用研缽磨成粉末，將粉末移入1. 5ml離心管，加入O. 6ml CTAB-free 緩沖液(200mmol/L Tris-HCl, 50mmol/L EDTA, 250mmol/L NaCl, 1%巰基乙醇)， 震蕩混勻后置于冰上放置lOmin。
(2)4°C,8000r/min離心 5min,小心棄去上清,加入O. 3ml 預熱至 65°C的 3XCTAB 緩沖液(3% CTAB, IOOmmoI/L Tris-HCl, 25mmol/L EDTA,1. 5mol/L NaCl, 1%巰基乙醇)，重懸沉淀，65°C水浴30min。加入等體積氯仿/異戊醇，輕輕顛倒混勻，靜止至分層。
(3) 5000rpm離心5min，將上層水相移到新的1. 5ml離心管中，加入兩倍體積的無水乙醇，顛倒混勻后靜置5min，用吸管將絮狀的DNA沉淀轉到新的1.5ml離心管。
(4)用Iml 70%乙醇洗滌沉淀2遍，空氣干燥20min，溶于20μ1 TE (RNase)緩沖液，4 °C保存?zhèn)溆谩?br> 2、Trizol法提取大巖桐RNA(I) 75%酒精擦拭試驗區(qū)域，整個實驗過程需佩戴手套以及口罩，并及時更換。
(2)取O. 6mg大巖桐幼葉，液氮研磨樣品，待樣品研磨完全，取無菌藥匙(提前置于液氮中預冷)，將組織粉末轉移至預冷的1. 5ml離心管，每管分裝O.1克樣品。
(3)迅速加入Iml Trizol試劑(樣品體積不超過Trizol試劑體積的10% ),迅速震蕩混勻(若樣品較多可先將混好的樣品置于冰上)；室溫下凈置5 IOmin以利于核酸蛋白質復合體的解離。
(4)4。。，12000 rpm離心IOmin,吸取上清,移至新1. 5ml離心管。
(5)加200 μ 的氯仿，劇烈搖蕩15 30sec，室溫下靜置5min左右。
(6)4°C, 12000 rpm離心15min，將上清轉入新離心管(400 μ )(盡量不觸及沉淀，一般吸取不超過800μ1)。
(7)加一倍體積異丙醇，輕輕混勻，室溫下沉淀IOmin。
(8) 4°C, 12000rpm 離心 15min,棄上清。
(9)加Iml 75%乙醇(DEPC處理的水配置)清洗RNA，振蕩片刻后(務必使沉淀懸浮起來，以確保洗漆干凈)，10000 rpm離心5min,小心棄上清。
(10)室溫靜置5 15min，干燥RNA沉淀，加入20 50 μ DEPC水溶解(65°C水浴 IOmin)。
(11) DNaseI處理，體系如下I 成分體積I腿水權液20 '50kgI IOXDNaseI bufferI DNaseI (RNase^fxee 5U/ul)|μ ;RNase Inhibitox(40U/ul)0·5μ1I DEPC-H20 補足律積至 50μ ，水· SOmin(12)加入200μ1 DEPC-H20和200μ1氯仿，震蕩混勻后，靜止至分層，4°C，12000rpm離心 5min。
(13)取200μ1上清至新的離心管，加入1/10體積的3Μ醋酸鈉(pH5. 2),2. 5倍體積的無水乙醇，_20°C放置4h以上。
(14) 12000rpm離心15min，棄上清，75%酒精洗滌沉淀，干燥，加入適量DEPC-H20 溶解，測定濃度以及純度，保存于_70°C冰箱，備用。
3、半定量 RT-PCR普通反轉錄(I)Microtube管中配制下列模板RNA/引物混合液,全量12 μ I。I 模板RM3i Oligo (dJ) 12-18 Primer (50 M-1) 或Specific Primer C10 P-M)2 μιI KMase free dH20up to 12 M-1
(2) 70°C保溫IOmin后迅速在冰上急冷2min以上。
(3)離心數(shù)秒鐘使模板RNA/引物的變性溶液聚集于Microtube管底部。
(4)在上述Microtube管中配制下列反轉錄反應液。試劑名稱使用量上述模板RNA/引物變性溶液12 μ I5XM-MLVBuffer4μ IdNTPMixture (各 IOmM)Ιμ RNaseInhibitor (40U/μ I)O. 5μ IRTaseM-MLV (RNaseH-) (200U/u I)O. 5μ IRNasefreedH20upto20μ I
(5)421保溫111。
(6)70°C保溫15min后冰上冷卻，加入等體積的ddH20稀釋，得到的cDNA溶液可直接用于2nd-Strand cDNA的合成或者PCR擴增等，PCR擴增時cDNA溶液的使用量建議使用 I μ I ~ 5 μ I。
半定量PCR首先吸取I μ I RT產物做模板，進行管家基因actin的第一輪PCR (actin的表達豐度比較高，一般設定26 28個循環(huán)即可)，20 μ I PCR體系，吸取10 μ I產物電泳，使用Image J軟件分析actin條帶亮度。根據(jù)分析結果適當調整各樣品的模板量，并用ddH20補足差量，進行actin的第二輪PCR,以此反復直至actin電泳條帶亮度基本一致,記錄個樣品模板的添加量，依次進行特異基因的PCR (各特異基因的循環(huán)數(shù)依據(jù)其表達豐度而定)，并電泳拍照，記錄下各特異基因的表達模式。
實施例6:出苗移栽 將鑒定過的陽性幼苗從瓶中取出，洗去瓊脂，栽入6:4的蛭石/珍珠巖混合基質中，用0.1%的高錳酸鉀澆透，遮蔭養(yǎng)護。
權利要求
1.農桿菌介導轉基因培養(yǎng)大巖桐植株的方法，其特征在于該方法采用大巖桐幼嫩葉片作為外植體，外植體預培后與去除培養(yǎng)物中殘存的抗生素和細菌代謝物的農桿菌菌株EHA105菌液共培，脫菌，再經過抗性篩選后，直接分化獲得轉基因植株。
2.根據(jù)權利要求1所述的農桿菌介導轉基因培養(yǎng)大巖桐植株的方法，其特征在于農桿菌菌株EHA105菌液的OD6tltl為0. 2^0. 4，共培的時間為2 4天。
3.根據(jù)權利要求2所述的農桿菌介導轉基因培養(yǎng)大巖桐植株的方法，其特征在于共培的方法如下取出預培養(yǎng)的葉片于無菌的小燒杯中，加入制備好的農桿菌菌株EHA105菌液中浸3lmin，搖晃數(shù)次；取出葉片，在無菌濾紙上吸干多余的菌液，葉背朝上置于基本MS固體培養(yǎng)基上，25°C，暗培養(yǎng)2 4d。
4.根據(jù)權利要求1或2或3所述的農桿菌介導轉基因培養(yǎng)大巖桐植株的方法，其特征在于農桿菌菌株EHA105菌液培養(yǎng)采用含有卡那霉素和利福平LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。
5.根據(jù)權利要求4所述的農桿菌介導轉基因培養(yǎng)大巖桐植株的方法,其特征在于農桿菌菌株EHA105菌液的制備方法如下 1)從-70°C冰箱取出含有重組質粒的農桿菌菌株EHA105，在含有抗生素Kan100 mg/L, Rif 80 mg/L的LB固體培養(yǎng)基上劃線活化，直至培養(yǎng)基上長出農桿菌單菌落； 2)取5 IOmlLB液體培養(yǎng)基，加入抗生素-卡那霉素和利福平，使其終濃度為Kan 100mg/L, Rif 80mg/L ;從新鮮平板中挑取單菌落加入其中，搖勻，于28°C，180r/min過夜培養(yǎng)至對數(shù)期，OD600約為0. 8 1. 0 ; 3)吸取上述菌液Iml于1.5ml離心管中，4°C,4000rpm離心2min,去上清，再用30ml1/2 MS懸浮農桿菌，再搖約l_2h，至菌液略顯混濁，OD600為0. 2^0. 4即可，備用。
6.根據(jù)權利要求1所述的農桿菌介導轉基因培養(yǎng)大巖桐植株的方法，其特征在于脫菌采用特美汀無菌溶液水洗。
7.根據(jù)權利要求1所述的農桿菌介導轉基因培養(yǎng)大巖桐植株的方法，其特征在于抗性篩選采用的標記基因是hpt，采用潮霉素作為選擇壓力。
8.根據(jù)權利要求7所述的農桿菌介導轉基因培養(yǎng)大巖桐植株的方法,其特征在于潮霉素的濃度為20mg/L。
9.根據(jù)權利要求8所述的農桿菌介導轉基因培養(yǎng)大巖桐植株的方法,其特征在于抗性篩選的抗性選擇培養(yǎng)基為MS+6_BA 2 mg/L+NAA 0. 3 mg/L+hgy 20mg/L+Tm 160 mg/L ；進行兩輪選擇培養(yǎng)，每輪持續(xù)12 15d。
10.根據(jù)權利要求1所述的農桿菌介導轉基因培養(yǎng)大巖桐植株的方法，其特征在于夕卜植體預培取大巖桐無菌苗的中、上部的葉片，沿葉緣剪一圈，接到含8(T120 uM乙酰丁香酮的基本MS固體培養(yǎng)基上，25 0C，暗培養(yǎng)20 30h。
全文摘要
本發(fā)明涉及大巖桐植株再生方法，尤其涉及農桿菌介導轉基因培養(yǎng)大巖桐植株的方法。農桿菌介導轉基因培養(yǎng)大巖桐植株的方法，該方法采用大巖桐幼嫩葉片作為外植體，外植體預培后與去除培養(yǎng)物中殘存的抗生素和細菌代謝物的農桿菌菌株EHA105菌液共培，脫菌，再經過抗性篩選后，直接分化獲得轉基因植株。本發(fā)明由于采用了上述的技術方案，借助農桿菌介導法，可以快速高效轉化大巖桐，獲得轉化植株首次成功獲得大巖桐轉基因植株，取得了較好的成果。
文檔編號A01H5/00GK102994544SQ201210511218
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月4日 優(yōu)先權日2012年12月4日
發(fā)明者邊紅武, 韓凝, 朱睦元, 李曉燕, 張明哲 申請人:浙江大學