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      以葉片為外植體的甜葉菊組織培養(yǎng)方法及其專(zhuān)用培養(yǎng)基的制作方法

      文檔序號(hào):243646閱讀:275來(lái)源:國(guó)知局
      以葉片為外植體的甜葉菊組織培養(yǎng)方法及其專(zhuān)用培養(yǎng)基的制作方法
      【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了以葉片為外植體的甜葉菊組織培養(yǎng)方法及其專(zhuān)用培養(yǎng)基。該甜葉菊的組織培養(yǎng)方法,包括將甜葉菊的離體葉片接入愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)得到甜葉菊再生芽的步驟;所述愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基是在植物組織培養(yǎng)基本培養(yǎng)基中添加植物生長(zhǎng)物質(zhì)、碳源和凝膠劑制成的固體培養(yǎng)基;所述植物生長(zhǎng)物質(zhì)含有NAA和TDZ。本發(fā)明的以葉片為外植體的甜葉菊組織培養(yǎng)方法,可提高甜葉菊的再生頻率和再生增殖系數(shù),縮短再生周期,為甜葉菊轉(zhuǎn)基因研究建立了穩(wěn)定高效的再生體系。
      【專(zhuān)利說(shuō)明】以葉片為外植體的甜葉菊組織培養(yǎng)方法及其專(zhuān)用培養(yǎng)基
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001]本發(fā)明涉及甜葉菊組織培養(yǎng)方法及其專(zhuān)用培養(yǎng)基,特別涉及一種以葉片為外植體的甜葉菊組織培養(yǎng)方法及其專(zhuān)用培養(yǎng)基。
      【背景技術(shù)】
      [0002]甜葉菊(Stevia rebaudiana Bertoni)又名“甜菊”、“甜草”,原產(chǎn)于南美巴拉圭,幾個(gè)世紀(jì)以來(lái)一直被當(dāng)?shù)鼐用褡鳛樘鹞讹嬃巷嬘?,是一種小型多年生菊科(Compositae)斯臺(tái)維亞屬植物,宿根性、須根型、多年生、短日照、草本植物。1970年日本從巴西引進(jìn)甜葉菊,開(kāi)始馴化、栽培、制備出糖苷,同時(shí)進(jìn)行毒理、食品檢測(cè)等試驗(yàn),并首先開(kāi)發(fā)利用甜葉菊產(chǎn)品一甜葉菊糖苷;我國(guó)于1976年開(kāi)始由南京中山植物園、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院等科研單位先后從日本引進(jìn)甜葉菊試種成功?,F(xiàn)在江蘇、福建、山東、新疆、河南、安徽等地都有大量種植,總面積達(dá)100萬(wàn)畝以上,我國(guó)已成為世界上種植甜葉菊面積最多的國(guó)家,也是世界上甜葉菊糖苷最大的生產(chǎn)國(guó)和出口國(guó)。
      [0003]甜菊糖苷(甜菊糖)是從甜葉菊的甜葉中提取的一類(lèi)高甜度、低熱量、對(duì)人體無(wú)副作用的天然產(chǎn)物,對(duì)肥胖病、糖尿病、高血壓病、心臟病、齲齒等也有一定的輔助治療作用。甜菊糖苷的甜度是蔗糖的300倍,而其熱值卻為蔗糖的1/300,所以目前不少?gòu)S家把甜菊糖苷作為一種甜味劑替代蔗糖。甜菊糖苷是理想的甜味食品,人體無(wú)法分解甜菊配糖體使它轉(zhuǎn)變成葡萄糖,也不會(huì)因此被血管吸收,經(jīng)消化后以纖維形態(tài)會(huì)排泄出體外,故不含剩下多余卡路里而引致肥胖或增加糖尿病患者的葡萄糖水平,甜葉菊深受肥胖癥患者和糖尿病人的青睞。甜菊糖苷是最接近蔗糖口味的天然低熱值甜味劑,它是繼甘蔗甜菜糖之外第三種有開(kāi)發(fā)價(jià)值和健康推崇的天然蔗糖替代品,被國(guó)際上譽(yù)為“世界第三蔗糖”。甜菊糖苷代替部分蔗糖加工食品飲 料可大大降低用糖成本。隨著人們對(duì)健康的關(guān)注程度越來(lái)越重,甜菊糖作為一種功能性糖類(lèi)必將具有良好的市場(chǎng)前景。我國(guó)衛(wèi)生部于1985年和1990年分別批準(zhǔn)了甜葉菊糖苷為不限量使用的天然甜味劑和醫(yī)藥用甜味劑輔料,美國(guó)FDA于2008年12月對(duì)甜菊糖苷可用作甜味劑正式審批,2011年11月14日歐盟也已經(jīng)批準(zhǔn)甜菊糖苷作為一種甜味劑在歐盟使用。甜葉菊逐漸成為食品和醫(yī)藥領(lǐng)域研究開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn),這將帶動(dòng)甜葉菊產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。
      [0004]甜葉菊為自交不親和異花授粉植物,遺傳穩(wěn)定性差,不利于雜交種的純合及品種的防雜保純,而且,甜葉菊種子細(xì)小,發(fā)芽率低,僅靠種子繁殖無(wú)法滿足市場(chǎng)上對(duì)甜葉菊的需求。采用組織培養(yǎng)技術(shù)不僅能保持品種的優(yōu)良特性,還可以不受外界條件的影響常年繁殖。20世紀(jì)70年代開(kāi)始,國(guó)內(nèi)不少研究單位就進(jìn)行了甜葉菊組織培養(yǎng)的研究。但大多都是以快繁為目的的實(shí)驗(yàn),利用帶有芽點(diǎn)的莖尖、側(cè)芽等,其擴(kuò)繁系數(shù)有限,增殖系數(shù)低。利用不帶芽點(diǎn)的葉片等外植體,一般報(bào)道僅為20-60%,再生增殖系數(shù)3-10。沈秀麗等(1996)以葉片為外植體在添加BA 0.5mg/L和NAA0.5mg/LMS的培養(yǎng)基上,不定芽再生率為20%,再生增殖系數(shù)為3 ;倪德祥等(1985)采用甜葉菊葉片為外植體,在MS添加BA 2.0mg/L和NAA
      2.0mg/L培養(yǎng)基上不定芽再生率為37%,再生增殖系數(shù)為9.3/10塊Jain等(2009)在添加BAP 2.2uM和IAA 2.8uM的MS培養(yǎng)基上,甜葉菊葉片外植體的不定芽再生率為45%,再生增殖系數(shù)9.2。一般甜葉菊葉片外植體需經(jīng)過(guò)3、4代愈傷組織繼代培養(yǎng)才能再生,再生時(shí)間長(zhǎng),再生增殖系數(shù)低。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供再生率高和/或再生增殖系數(shù)高的以葉片為外植體的三種甜葉菊組織培養(yǎng)方法及其專(zhuān)用培養(yǎng)基。
      [0006]本發(fā)明所提供的以葉片為外植體的甜葉菊組織培養(yǎng)方法一,包括將甜葉菊的離體葉片接入愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)得到甜葉菊再生芽的步驟;所述愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基是在植物組織培養(yǎng)基本培養(yǎng)基中添加植物生長(zhǎng)物質(zhì)、碳源和凝膠劑制成的固體培養(yǎng)基;所述植物生長(zhǎng)物質(zhì)含有NAA和TDZ。
      [0007]上述甜葉菊組織培養(yǎng)方法一中,所述植物生長(zhǎng)物質(zhì)還可含有其它的植物激素或植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,如 6-BA、KT、IBA、2,4_D、ΙΑΑ。
      [0008]上述甜葉菊組織培養(yǎng)方法一中,所述愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基中,NAA的濃度可為 0.lmg/L-0.2mg/L,如 0.1mg/L、0.15mg/L、0.2mg/L、0.1-0.15mg/L、0.15-0.2mg/L, TDZ的濃度可為 1.0mg/L-3.0mg/L,如 1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L、1.0-1.5mg/L、l.5-2.0mg/L、
      2.0-2.5mg/L、2.5-3.0mg/L。
      [0009]本發(fā)明所提供的以葉片為外植體的甜葉菊組織培養(yǎng)方法二,包括將甜葉菊的離體葉片接入愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)得到甜葉菊再生芽的步驟;所述愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基是在植物 組織培養(yǎng)基本培養(yǎng)基中添加植物生長(zhǎng)物質(zhì)、碳源和凝膠劑制成的固體培養(yǎng)基;所述植物生長(zhǎng)物質(zhì)含有NAA和6-BA。
      [0010]上述甜葉菊組織培養(yǎng)方法二中,所述植物生長(zhǎng)物質(zhì)還可含有其它的植物激素或植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,如IBA、2,4-D、IAA。
      [0011]所述甜葉菊組織培養(yǎng)方法二中,所述愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基可為A、B、C或D ;
      [0012]A、所述愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基中,所述NAA的濃度為0.lmg/L-0.2mg/L, 6-BA的濃度為 1.0mg/L-3.0mg/L ;
      [0013]B、所述植物生長(zhǎng)物質(zhì)含有NAA、6-BA和KT ;具體地,所述NAA的濃度為0.1mg/L-0.2mg/L, 6-BA 的濃度為 1.0mg/L-3.0mg/L, KT 的濃度為 1.0mg/L-2.0mg/L ;
      [0014]C、所述植物生長(zhǎng)物質(zhì)為NAA和6-BA ;所述愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基中,NAA的濃度為 0.lmg/L-0.2mg/L,6-BA 的濃度為 1.0mg/L-4.0mg/L ;
      [0015]D、所述植物生長(zhǎng)物質(zhì)為NAA、6-BA和KT ;所述愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基中,NAA的濃度為 0.lmg/L-0.2mg/L,6-BA 的濃度為 L Omg/L-3.0mg/L, KT 的濃度為 1.0mg/L-2.0mg/L0
      [0016]上述甜葉菊組織培養(yǎng)方法一和方法二中,所述培養(yǎng)可為先進(jìn)行黑暗培養(yǎng)再進(jìn)行正常光照培養(yǎng)。
      [0017]本發(fā)明所提供的以葉片為外植體的甜葉菊組織培養(yǎng)方法三,包括將甜葉菊的離體葉片接入愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)得到甜葉菊再生芽的步驟;所述愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基是在植物組織培養(yǎng)基本培養(yǎng)基中添加植物生長(zhǎng)物質(zhì)、碳源和凝膠劑制成的固體培養(yǎng)基;所述培養(yǎng)為先進(jìn)行黑暗培養(yǎng)再進(jìn)行正常光照培養(yǎng)。[0018]上述甜葉菊組織培養(yǎng)方法三中,所述愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基中所述植物生長(zhǎng)物質(zhì)含有NAA和6-BA。
      [0019]上述甜葉菊組織培養(yǎng)方法三中,所述植物生長(zhǎng)物質(zhì)還可含有其它的植物激素或植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,如IBA、2,4-D、IAA。
      [0020]具體地,上述甜葉菊組織培養(yǎng)方法三中,所述愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基可為上述 A、B、C 或 D。
      [0021]上述甜葉菊組織培養(yǎng)方法一、方法二和方法三中,所述植物組織培養(yǎng)基本培養(yǎng)基可為MS培養(yǎng)基、White培養(yǎng)基、Miller培養(yǎng)基、Heller培養(yǎng)基、LS培養(yǎng)基、ER培養(yǎng)基、MT培養(yǎng)基、NN培養(yǎng)基、NLN培養(yǎng)基、Nitsh培養(yǎng)、H培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基、SH培養(yǎng)基、DKff培養(yǎng)基或WPM培養(yǎng)基。
      [0022]其中,所述MS培養(yǎng)基的溶劑是水、溶質(zhì)及其濃度如表1所示。
      [0023]表1.MS培養(yǎng)基的溶質(zhì)及其濃度(mg/L)
      [0024]
      【權(quán)利要求】
      1.甜葉菊的組織培養(yǎng)方法,包括將甜葉菊的離體葉片接入愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)得到甜葉菊再生芽的步驟;所述愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基是在植物組織培養(yǎng)基本培養(yǎng)基中添加植物生長(zhǎng)物質(zhì)、碳源和凝膠劑制成的固體培養(yǎng)基;所述植物生長(zhǎng)物質(zhì)含有 NAA 和 TDZ。
      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:所述植物生長(zhǎng)物質(zhì)為NAA和TDZ;所述愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基中,NAA的濃度為0.lmg/L-0.2mg/L, TDZ的濃度為1.0mg/L-3.0mg/Lo
      3.甜葉菊的組織培養(yǎng)方法,包括將甜葉菊的離體葉片接入愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)得到甜葉菊再生芽的步驟;所述愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基是在植物組織培養(yǎng)基本培養(yǎng)基中添加植物生長(zhǎng)物質(zhì)、碳源和凝膠劑制成的固體培養(yǎng)基;所述植物生長(zhǎng)物質(zhì)含有 NAA 和 6-BA。
      4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法,其特征在于:所述愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基為A、B、C或D ; A、所述愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基中,所述NAA的濃度為0.lmg/L-0.2mg/L, 6-BA的濃度為 1.0mg/L-3.0mg/L ; B、所述植物生長(zhǎng)物質(zhì)含有NAA、6-BA和KT;具體地,所述NAA的濃度為0.lmg/L-0.2mg/L, 6-BA 的濃度為 1.0mg/L-3.0mg/L, KT 的濃度為 1.0mg/L-2.0mg/L ; C、所述植物生長(zhǎng)物質(zhì)為NAA和6-BA;所述愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基中,NAA的濃度為0.lmg/L-0.2mg/L, 6-BA 的濃度為 1.0mg/L-4.0mg/L ; D、所述植物生長(zhǎng)物質(zhì)為NAA、6-BA和KT;所述愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基中,NAA的濃度為 0.lmg/L-0.2mg/L, 6-BA 的濃度為 1.0mg/L-3.0mg/L, KT 的濃度為 1.0mg/L-2.0mg/L。
      5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述`的方法,其特征在于:所述培養(yǎng)為先進(jìn)行黑暗培養(yǎng)再進(jìn)行正常光照培養(yǎng)。
      6.甜葉菊的組織培養(yǎng)方法,包括將甜葉菊的離體葉片接入愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)得到甜葉菊再生芽的步驟;所述愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基是在植物組織培養(yǎng)基本培養(yǎng)基中添加植物生長(zhǎng)物質(zhì)、碳源和凝膠劑制成的固體培養(yǎng)基;所述培養(yǎng)為先進(jìn)行黑暗培養(yǎng)再進(jìn)行正常光照培養(yǎng)。
      7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法,其特征在于:所述黑暗培養(yǎng)的時(shí)間為1-6天、4-6天、4天或6天。
      8.根據(jù)權(quán)利要求5-7中任一所述的方法,其特征在于:所述正常光照為每天12-14小時(shí)光照其余時(shí)間黑暗。
      9.根據(jù)權(quán)利要求5-8中任一所述的方法,其特征在于:所述正常光照的光照強(qiáng)度為2000_30001ux。
      10.根據(jù)權(quán)利要求5-9中任一所述的方法,其特征在于:所述黑暗培養(yǎng)和所述正常光照培養(yǎng)在22-25 °C下進(jìn)行。
      11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一所述的方法,其特征在于:所述方法還包括對(duì)所述甜葉菊再生芽進(jìn)行繼代培養(yǎng)和/或?qū)λ鎏鹑~菊再生芽進(jìn)行生根培養(yǎng)的步驟。
      12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法,其特征在于:所述繼代培養(yǎng)采用的繼代培養(yǎng)基是在所述植物組織培養(yǎng)基本培養(yǎng)基中添加NAA、6-BA、碳源和凝膠劑制成的固體培養(yǎng)基;具體地,所述繼代培養(yǎng)基中,NAA的濃度為0.lmg/L-0.2mg/L,6_BA的濃度為0.2mg/L_l.0mg/L ; 和/或, 所述生根培養(yǎng)采用的生根培養(yǎng)基是在所述植物組織培養(yǎng)基本培養(yǎng)基中添加NAA、碳源和凝膠劑制成的固體培養(yǎng)基;具體地,NAA在所述生根培養(yǎng)基中的濃度為0.lmg/L-0.4mg/L0
      13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一所述的方法,其特征在于:所有所述凝膠劑是瓊脂、卡拉膠或固化劑(Gelrite);具體地,所述瓊脂在所有所述培養(yǎng)基中的濃度為7_llg/L ; 和/或, 所述碳源是蔗糖、葡萄糖和/或麥芽糖;具體地所述蔗糖在所述培養(yǎng)基中的濃度為15-30g/L。
      14.甜葉菊的組織培養(yǎng)基,包括培養(yǎng)基a和培養(yǎng)基b,所述培養(yǎng)基a為愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基,所述培養(yǎng)基b為生根培養(yǎng)基和/或繼代培養(yǎng)基;所述愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基為權(quán)利要求1_4、6和13中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述方法中所述的愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基,所述繼代培養(yǎng)基是權(quán)利要求12或13所述方法中的所述繼代培養(yǎng)基;所述生根培養(yǎng)基是權(quán)利要求12或13所述方法中的生根培養(yǎng)基。
      15.甜葉菊葉片的愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基,為權(quán)利要求1_4、6和13中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述方法中所述的愈傷組織誘導(dǎo)與分`化培養(yǎng)基。
      【文檔編號(hào)】A01H4/00GK103858757SQ201210530224
      【公開(kāi)日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2012年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月11日
      【發(fā)明者】肖玲, 葉紹云, 蔡南海, 許駿 申請(qǐng)人:豐益(上海)生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司
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