專利名稱：一種蜂房類芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物種質(zhì)資源的開發(fā)與利用領(lǐng)域，尤其涉及一種蜂房類芽孢桿菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
西紅花(藏紅花)作為一種名貴的藥材能給種植戶帶來非常可觀的經(jīng)濟(jì)效益，目前西紅花已成為全國(guó)不少縣(市)的農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)之一，然而近年西紅花種球腐爛病的頻發(fā)給這一產(chǎn)業(yè)帶來了不容忽視的損失。西紅花球莖被害后葉發(fā)黃、變褐色、萎蔫枯死，球莖發(fā)黑腐爛留下空殼。據(jù)調(diào)查和統(tǒng)計(jì)，浙江省一般年份西紅花球莖發(fā)生腐爛的比例為5%左右，嚴(yán)重年份部分種植戶西紅花球莖腐爛達(dá)40 %以上，甚至全部腐爛。對(duì)罹病球莖的致病菌進(jìn)行分離鑒定結(jié)果表明，西紅花球莖腐爛病是由一種尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysp orum)和一種炭疽菌(Anthracnose sp.)的交互侵染導(dǎo)致的。西紅花球莖腐爛病前期主要是尖孢鐮刀菌侵染導(dǎo)致，而后炭疽菌侵染，加重病情。西紅花球莖腐爛病嚴(yán)重影響球莖和西紅花的品質(zhì)，目前防治這種病害的主要手段是使用化學(xué)殺菌劑。然而由于長(zhǎng)期大量使用農(nóng)藥造成抗藥性增強(qiáng)、自然生態(tài)環(huán)境污染及農(nóng)藥殘留的問題越來越突出，尋求作物病害防治的新途徑一直是人們努力的目標(biāo)。利用生物防治手段防治作物病害能有效地避免上述缺點(diǎn)，因而具有廣闊的發(fā)展前途。其中拮抗細(xì)菌作為一類重要的生物防治制劑，在植物病害的綜合防治中占有重要的一席之地。細(xì)菌在生物防治應(yīng)用中的主要優(yōu)勢(shì)在于:(1)細(xì)菌的種類和數(shù)量眾多，在植物根際和地上部大量存在；(2)細(xì)菌對(duì)病原菌的作用方式較廣，可以通過競(jìng)爭(zhēng)、拮抗和寄生、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性等方式對(duì)病原菌產(chǎn)生影響；(3)具有驚人的繁殖速度；(4)許多細(xì)菌存在于植物根際和地上部，對(duì)植物的生態(tài)比較適宜；(5)細(xì)菌大多可以人工培養(yǎng),便于控制,在實(shí)踐中易于操作；(6)有些細(xì)菌不僅能防治病害而且具有促生作用，可以增加作物產(chǎn)量。多粘類芽抱桿菌(PaenibacilluspoIymyxa)是類芽抱桿菌屬(Paenibacillus)的模式種，類芽孢桿菌屬是芽孢桿菌屬分類上的新發(fā)展，1993年由Ash等將11個(gè)種從芽孢桿菌中分出來。同其他種類的用于植物病害生物防治的芽孢桿菌相似，類芽孢桿菌也能產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)并產(chǎn)生芽孢，具有很強(qiáng)的繁殖能力，對(duì)一些植物病原菌有明顯的抑制作用，因此能夠進(jìn)一步開發(fā)出生物農(nóng)藥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種蜂房類芽孢桿菌(Paenibacillus alvei) ZJUB2011-1,該菌能高效拮抗尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum),可用于防治由尖孢鐮刀菌侵染引起的西紅花
球莖腐爛病等植物病害。一種蜂房芽孢桿菌,分類命名為蜂房芽孢桿菌(Paenibacillus alvei),株號(hào)為ZJUB2011-1，保藏于位于武漢市珞珈山武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏日期為2012年11月6日，保藏號(hào)為CCTCCM2012448。該菌株為革蘭氏陽性兼性厭氧菌。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上生長(zhǎng)時(shí)，無可溶性色素，菌落圓形、白色、扁平、表面光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊；在液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)時(shí)，菌液渾濁，有沉淀物，并常在菌液表面形成一層菌膜。該菌株的生長(zhǎng)溫度為15 45°C，最適生長(zhǎng)溫度為30 35°C ;最適生長(zhǎng)pH為7左右。對(duì)蜂房類芽孢桿菌ZJUB2011-1的顯微形態(tài)進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，該菌株的菌體為桿狀，大小為0.6 0.8 μ mX 2.2 4.5 μ m,無莢膜。芽孢為橢圓形,位于菌體中央或亞頂端,芽抱大小為0.7 0.9 μ mX L 8 2.2 μ m。所述蜂房類芽孢桿菌ZJUB2011-1分離自西紅花表皮，提取所述蜂房類芽孢桿菌ZJUB2011-1的DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得其16S rDNA序列，該16S rDNA序列如SEQ N0.1所
/Jn ο本發(fā)明還提供了一種包含所述蜂房類芽孢桿菌的菌劑。該菌劑通過將蜂房類芽孢桿菌ZJUB2011-1與適宜的載體混合而成。所述蜂房類芽孢桿菌ZJUB2011-1的濃度優(yōu)選為IO7 108cfu/mL。本發(fā)明還提供了所述蜂房類芽孢桿菌在拮抗尖孢鐮刀菌中的應(yīng)用。本發(fā)明的蜂房類芽孢桿菌ZJU2011-1對(duì)尖孢鐮刀菌具有較顯著的抑制作用，在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，抑制率為73%，高于陽性對(duì)照枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)生防菌I。本發(fā)明還提供了所述蜂房類芽孢 桿菌在防治西紅花球莖腐爛病中的應(yīng)用，利用蜂房類芽孢桿菌ZJU2011-1對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制作用，可將蜂房芽孢桿菌ZJU2011-1應(yīng)用于防治由尖孢鐮刀菌侵染引起的西紅花球莖腐爛病等植物病害。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明的蜂房類芽孢桿菌ZJU2011-1可高效抑制尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)，可用于防治由尖孢鐮刀菌侵染引起的西紅花球莖腐爛病等植物病害，應(yīng)用前景廣闊。


圖1為蜂房類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)ZJU2011-1的革蘭氏染色結(jié)果圖；圖2為蜂房類芽孢桿菌(Paenibacillus po lymyxa) ZJU2011-1營(yíng)養(yǎng)體的透射電鏡觀察圖；圖3為蜂房類芽孢桿菌(Paenibacillus po lymyxa) ZJU2011-1在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上的生長(zhǎng)狀態(tài)圖；圖4為蜂房類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa) ZJU2011-1在液體培養(yǎng)基內(nèi)的生長(zhǎng)狀態(tài)圖；圖5為生防菌對(duì)尖孢鐮刀菌的離體拮抗作用圖；其中，1、2、3號(hào)為蜂房芽孢桿菌ZJU2011-1，4號(hào)為枯草芽孢桿菌1，5為不接生防菌的陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式一、病原真菌分離純化從浙江省建德市三都鎮(zhèn)和村黃泥山實(shí)地采集了室內(nèi)培植階段的西紅花健康種球和患西紅花球莖腐爛病的發(fā)病種球。依據(jù)Koch法則，采用組織表面分離法，從西紅花種球腐爛部位分離純化得到該病的病原真菌-尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)。二、拮抗細(xì)菌篩選切取5g西紅花表皮放入45mL無菌水中震蕩20min，然后從中吸取ImL放至盛有9mL無菌水帶塞試管中充分振蕩，制成10—1稀釋液；以此類推，制成為10_2、10_310_4、10_5、10_6的稀釋；分別取0.1mL 10_4、10_5、10_6濃度的稀釋液涂板(NA培養(yǎng)基)，于30°C條件下培養(yǎng)48h;然后挑取培養(yǎng)特征各異的單菌落進(jìn)行劃線培養(yǎng)直至得到純培養(yǎng)，備用。以步驟I中從西紅花發(fā)病種球上分離得到的尖孢鐮刀菌為指示菌，采用平板對(duì)峙法，從獲得的純培養(yǎng)中篩選對(duì)尖孢鐮刀菌具有抑制作用的菌株。挑取純化后生長(zhǎng)旺盛的尖孢鐮刀菌菌絲塊(直徑約7mm)置于PDA平板中央，將分離到的純培養(yǎng)菌株點(diǎn)接在平板邊緣距中心25mm處，每個(gè)培養(yǎng)皿接4點(diǎn)，28°C培養(yǎng)3d，獲得一株對(duì)尖孢鐮刀菌具有抑制效果的菌株。三、生防菌株鑒定對(duì)步驟2中分離得到的西紅花種球腐爛病生防細(xì)菌的形態(tài)及生物學(xué)特征進(jìn)行鑒定。如圖1所示，該菌株為革蘭氏陽性兼性厭氧菌；電鏡顯微形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，該菌株的菌體為短桿狀，大小為0.6 0.8 μ mX 2.2 4.5 μ m(圖2),無莢膜。芽孢為橢圓形，位于菌體中央或亞頂端，芽孢大小為0.7 0.9 μ mX 1.8 2.2 μ m。該菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上生長(zhǎng)時(shí)，菌落圓形、白色、扁平、表面光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊(圖3);在液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)時(shí)，菌液渾濁，有沉淀物，并常在菌液表面形成一層菌膜(圖4)。該菌株的生長(zhǎng) 溫度為15 45°C，最適生長(zhǎng)溫度為30 35°C ;最適生長(zhǎng)pH為
7.0左右。提取該菌株基因組DNA ；以基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得16S rDNA序列，并在NCBI上的Genbank進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)合上述觀察得到的生理生化特征，將該菌株鑒定為蜂房類芽孢桿菌(Paenibacillusalvei)，編號(hào)為蜂房類芽孢桿菌ZJU2011-1。四、生防菌離體抑菌活性測(cè)定用打孔直徑為7mm的打孔器打取生長(zhǎng)旺盛的尖孢鐮刀菌菌餅，轉(zhuǎn)接于PDA平板中央，在與其相距2cm的四個(gè)角上分別點(diǎn)接篩選所得的蜂房芽孢桿菌ZJUB2011-1，將培養(yǎng)皿置于28°C恒溫箱中培養(yǎng)6d，以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)生防菌I為陽性對(duì)照菌，未接拮抗菌為陰性對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。抑制結(jié)果如圖5所示。采用DPS軟件對(duì)各組結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。分析結(jié)果顯示，蜂房芽孢桿菌ZJUB2011-1對(duì)尖孢鐮刀菌具有較顯著的抑制能力，抑制率達(dá)到73.00%，高于陽性對(duì)照菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表I所示。表1.蜂房芽孢桿菌ZJU2011-1離體抑菌效果
MI菌落直徑(mm) I抑制率(％ )~
蜂房芽孢桿菌 ZJUB2011-1 27.2±0.93° 73.00_芽孢桿菌 I32.3±1.16b 66.18
栗接拮抗菌|81.7±0.89° |θ—注:1.表中數(shù)字右上角字母表示鄧肯氏多重差異分析結(jié)果，同列不同字母表示差異顯著(P < 0.05)；2.抑制率(<% ) = 100X (陰性對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(陰性對(duì)照菌落直徑-7mm)。五、生防菌活體防病效果測(cè)定將蜂房芽孢桿菌ZJUB2011-1制成濃度為IX 108CFU/mL的菌懸液，選取無病蟲危害、無傷口、成熟度和大小一致的西紅花種球浸入菌懸液中，浸泡時(shí)間為30min,間隔時(shí)間12h后在西紅花種球上接種尖孢鐮刀菌。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組包含三個(gè)對(duì)照:以常規(guī)農(nóng)藥50%多菌靈可濕性粉劑的300倍稀釋液浸種后接種尖孢鐮刀菌為陽性對(duì)照I (化學(xué)農(nóng)藥)；以濃度為I X 108CFU/mL的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)生防菌I懸液浸種后接種尖孢鐮刀菌為陽性對(duì)照2 (生物農(nóng)藥)；以無菌水浸種后接種尖孢鐮刀菌為空白對(duì)照。置28°C的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，IOd后調(diào)查發(fā)病情況。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，取平均值。結(jié)果如表2所示。表2.各處理液對(duì)西紅花球莖腐爛病的活體防治效果
權(quán)利要求
1.一種蜂房類芽孢桿菌，其特征在于，命名為蜂房類芽孢桿菌(Paenibacillus alvei)ZJUB2011-1，保藏號(hào)為 CCTCC M 2012448。
2.一種包含權(quán)利要求1所述蜂房類芽孢桿菌的菌劑。
3.如權(quán)利要求2所述的菌劑，其特征在于，蜂房類芽孢桿菌的濃度為IO7 108cfu/mL。
4.如權(quán)利要求1所述的蜂房類芽孢桿菌在拮抗尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)中的應(yīng)用。
5.如權(quán) 利要求1所述的蜂房類芽孢桿菌在防治西紅花球莖腐爛病中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蜂房類芽孢桿菌，分類命名為蜂房類芽孢桿菌(Paenibacillus alvei)，株號(hào)為ZJUB2011-1，保藏號(hào)為CCTCC M 2012448。本發(fā)明還公開了一種含有所述蜂房類芽孢桿菌的菌劑。本發(fā)明還公開了所述蜂房類芽孢桿菌在拮抗尖孢鐮刀菌以及防治西紅花球莖腐爛病上的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的蜂房類芽孢桿菌ZJU2011-1可高效抑制尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)，可用于防治由尖孢鐮刀菌侵染引起的西紅花球莖腐爛病等植物病害，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)A01P3/00GK103205372SQ201210536839
公開日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2012年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月11日
發(fā)明者陶中云, 謝關(guān)林, 曾紅星, 謝國(guó)雄, 周青, 崔舟琦, 劉賀, 李斌, 徐福壽 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)