防治芝麻枯萎病的生防菌、分離方法、菌劑及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種防治芝麻枯萎病的生防菌、分離方法、生防菌菌劑及其應用，其中，該生防菌為皮奧顯亞類芽孢桿菌（Paenibacillus?peoriae）SF4-11，保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址，湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保藏中心，保藏日期：2012年11月28日，保藏號：CCTCC?NO：M2012489。本發(fā)明通過對紫花地丁根系土壤進行微生物分離、對峙培養(yǎng)，分離得到防治芝麻枯萎病的生防菌。本發(fā)明的生防菌是一種有效防治芝麻枯萎病的菌種，采用該生防菌制備的菌劑，在使用過程中不會對生態(tài)環(huán)境造成污染，可達到無公害的效果。使用本發(fā)明的生防菌可以減少其他化學農藥的用量，降低芝麻病害的防控成本，促進芝麻生長，具有良好的推廣價值。
【專利說明】防治芝麻枯萎病的生防菌、分離方法、菌劑及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種防治芝麻枯萎病的生防菌，同時涉及該生防菌的分離方法、該生防菌菌劑及其應用，屬于植物保護【技術領域】。
【背景技術】
[0002]植物枯萎病是一類重要的植物土傳病害，主要致病菌是尖孢鐮刀菌，這種病害從植物根部危害植物，可造成植物的大規(guī)模減產。其中，芝麻就是被危害最嚴重的一種農作物。
[0003]芝麻(Sesamum indicum),隸屬于胡麻科胡麻屬，是世界上最古老的油料作物之一，也是我國重要的優(yōu)質油料作物。我國芝麻年種植面積1200萬畝左右，總產量約75萬噸，在國際油料貿易中具有重要的地位。芝麻枯萎病是(Sesame Fusarium wilt, SFff)由尖孢鍵刀菌芝麻專化型(Fusarium oxysporum f.sp.sesami (Zaprometoff) CastelIani, FOS)菌侵染引起的一種土傳真菌病害。芝麻在全生育期均可被尖孢鐮刀菌侵染。該病屬于世界性病害，印度、蘇丹、埃及和巴基斯坦等許多芝麻生產國每年均有不同程度發(fā)生。該病在我國主要發(fā)生在東北、華北、西北、黃淮以及江淮部分地區(qū)，常年發(fā)生率15%左右，嚴重發(fā)生時可達30%以上，常導致芝麻種子不成熟、籽粒瘦癟，易在收獲前炸落，嚴重威脅和阻礙著芝麻的生產與發(fā)展。以往傳統(tǒng)方法主要靠化學農藥防治農作物枯萎病病害，但是隨著化學農藥的大量使用，對自然環(huán)境造成了嚴重的污染，也危害了人類的健康。而且，化學農藥的大量使用也使枯萎病病原菌產生了耐藥性，防治枯萎病效果大打折扣。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種防治芝麻枯萎病的生防菌。
[0005]為了實現以上目的，本發(fā)明所采用的技術方案是提供一種防治芝麻枯萎病的生防菌，所述生防菌為皮奧顯亞類芽孢桿菌`(Paenibacillus peoriae) SF4-11,保藏日期:2012年11月28日，保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址，湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保藏中心，保藏號:CCTCC N0:M2012489o
[0006]本發(fā)明的目的還在于提供一種防治芝麻枯萎病的生防菌的分離方法。
[0007]本發(fā)明所采用的技術方案還在于提供一種防治芝麻枯萎病的生防菌的分離方法，包括以下步驟:
[0008]I)病原菌及土壤微生物的分離:
[0009]a)病原菌的分離:
[0010]取芝麻枯萎病發(fā)病植株，對芝麻植株的病桿進行消毒、清洗，再將病感中央維管束組織放入含有50 μ g/mL氯霉素的PDA培養(yǎng)基上，在26_28°C條件下培養(yǎng)3_4d，然后將優(yōu)勢菌落在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-4d后，進行單孢分離純化，保存?zhèn)溆茫?br> [0011]b) 土壤微生物的分離:
[0012]稱取紫花地丁根部土壤，加入無菌水，采用濃度梯度法稀釋土壤懸液，取濃度梯度土壤懸液均勻涂布在1/10TSA培養(yǎng)平板上，在26-28°C條件下，倒置培養(yǎng)l_2d ;將生長出的菌落接種于TSA培養(yǎng)基進行分離純化，然后將純化的細菌與50%甘油等量混合-70°C冷凍保存?zhèn)溆茫?br> [0013]2)拮抗菌篩選:
[0014]將培養(yǎng)的不同土壤細菌與尖孢鐮刀菌芝麻?；驮赑DK培養(yǎng)基上對峙培養(yǎng)，判斷有無拮抗作用；
[0015]3)對拮抗菌進行鑒定分類。
[0016]所述芝麻植株病桿為芝麻桿病健交界處的莖桿。
[0017]所述PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉15g，蒸餾水1000mL,ρΗ7.0-7.2，121 °C濕熱滅菌 20min。
[0018]所述1/10TSA 培養(yǎng)基為:TSB (Trypticase Soya Broth, Difc0.) 3g,瓊脂 15g,蒸懼水 1000mL, ρΗ7.0-7.2，121 °C濕熱滅菌 20min。
[0019]所述TSA 培養(yǎng)基為:TSB (Trypticase Soya Broth, Difc0.) 30g,瓊脂 15g,蒸懼水1000mL, ρΗ7.0-7.2，121 °C濕熱滅菌 20min。
[0020]所述roK培養(yǎng)基:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨10g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL,ρΗ7.0-7.2，121 °C濕熱滅菌 20min。
[0021]本發(fā)明的目的還在于提供一種防治芝麻枯萎病的生防菌菌劑。
[0022]本發(fā)明所采用的技`術方案還在于提供一種防治芝麻枯萎病的生防菌菌劑，將生防菌接種在LB液體培養(yǎng)基中，在30-33°C條件下振蕩培養(yǎng)2-3d，離心，取沉淀加入無菌水即得。
[0023]所述LB液體培養(yǎng)基為:酵母提取物5g,蛋白胨IOg,氯化鈉IOg,瓊脂15g,蒸懼水1000mL, ρΗ7.0-7.2，121 °C濕熱滅菌 20min。
[0024]本發(fā)明的目的還在于提供一種防治芝麻枯萎病的生防菌在促進芝麻生長方面的應用。
[0025]本發(fā)明所采用的技術方案還在于提供一種防治芝麻枯萎病的生防菌在促進芝麻生長方面的應用。
[0026]本發(fā)明分離得到的生防菌是一種有效防治芝麻枯萎病的菌種，采用該生防菌制備菌劑，方法簡單、操作方便，便于生防菌的保存和運輸，制得的菌劑屬于生物制劑，在使用過程中不會對生態(tài)環(huán)境造成污染，可達到無公害的效果。另外，使用本發(fā)明的生防菌可以減少其他化學農藥的用量，降低芝麻病害的防控成本，同時促進芝麻生長，具有良好的推廣價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為本發(fā)明的生防菌與尖孢鐮刀菌芝麻?；蛯χ排囵B(yǎng)；
[0028]圖2為本發(fā)明的生防菌在培養(yǎng)平板上的菌落形態(tài)；
[0029]圖3為本發(fā)明的生防菌對芝麻植株生長促進作用效果圖，
[0030]圖中，圖3左:為本發(fā)明的溫室盆缽試驗生防菌對芝麻植株生長促進作用的效果圖，
[0031]圖3右:為本發(fā)明的大田盆缽試驗生防菌對芝麻植株生長促進作用的效果圖?！揪唧w實施方式】
[0032]芝麻枯病病原菌株HSFO 09100是河南省芝麻研究中心與2009年從河南省封丘魯崗鄉(xiāng)和寨村芝麻病株中分離得到，并由河南省芝麻研究中心植物病理研究室保存?zhèn)溆谩?br> [0033]芝麻枯病病原菌株HSFO 10044是河南省芝麻研究中心與2010年從山西省晉中市榆次縣芝麻病株中分離得到，并由河南省芝麻研究中心植物病理研究室保存?zhèn)溆谩?br> [0034]紫花地丁根部土壤為河南省西峽縣云臺村堇菜科紫花地丁根部土壤。
[0035]培養(yǎng)基的配制:
[0036]PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂粉15g，蒸餾水1000mL, ρΗ7.0-7.2，121 °C濕熱滅菌20min。
[0037]1/10TSA 培養(yǎng)基為:TSB (Trypticase Soya Broth, Difc0.) 3g,瓊脂 15g,蒸懼水1000mL, ρΗ7.0-7.2，121 °C濕熱滅菌 20min。
[0038]TSA 培養(yǎng)基為:TSB (Trypticase Soya Broth, Difc0.) 30g,瓊脂 15g,蒸懼水1000mL, ρΗ7.0-7.2，121 °C濕熱滅菌 20min。
[0039]PDK培養(yǎng)基:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨10g，瓊脂15g，蒸餾水lOOOmL，ρΗ7.0-7.2，121 °C濕熱滅菌 20min。
[0040]LB液體培養(yǎng)基為:酵母提取物5g,蛋白胨IOg,氯化鈉IOg,瓊脂15g,蒸懼水1000mL, ρΗ7.0-7.2，121 °C濕熱滅菌 20min。
[0041]實施例1、病原菌的分離
[0042]在芝麻桿病健交界處用無菌切割刀將莖桿切成2cm的小段，75%酒精表面消毒30s, 3%次氯酸鈉表面消毒3min，然`后用無菌水沖洗4次；再用無菌切割刀把莖桿小段從中部縱切成兩半，使維管束組織顯露出來；輕輕鑷取中央維管束組織，放于含有50 μ g/mL氯霉素的PDA培養(yǎng)基上。26-28 °C恒溫箱中恒溫保濕培養(yǎng)4d后，挑選出優(yōu)勢菌落PDA培養(yǎng)4d后，進行單孢分離純化，并保存?zhèn)溆谩?br> [0043]實施例2、土壤微生物的分離
[0044]取采集的紫花地丁根部土壤lg，用無菌水梯度稀釋至10_5_10_3g/mL，將稀釋好的混合液均勻地涂布于1/10TSA培養(yǎng)平板上，于28°C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2d,待細菌菌落長出后，用無菌牙簽挑取大小、顏色或形態(tài)不同的細菌在TSA培養(yǎng)基表面劃線分離純化。
[0045]實施例3、生防菌篩選
[0046]生防菌篩選采用平板對峙培養(yǎng)法，在PDK平板中央接尖孢鐮刀菌菌塊，離菌塊25mm處接待測菌，置于26-28°C恒溫箱培養(yǎng)4_6d，觀察有無抑菌圈產生，并測量抑菌圈大小，如圖1所示。
[0047]拮抗測試結果表明，紫花地丁根系土壤中發(fā)現一種芝麻枯萎病生防菌，命名為SF4-11。實施例4、生防菌形態(tài)學觀察
[0048]生防菌SF4-11菌落牙白色，近圓形，直徑l_2mm，表面干燥皺褶，不透明，易挑取，如圖1所示。
[0049]實施例5、生防菌的鑒定分類
[0050]對篩選出的生防菌進行測序,鑒定結果為皮奧顯亞類芽孢桿菌(Paenibacilluspeoriae)。
【權利要求】
1.防治芝麻枯萎病的生防菌，其特征在于，所述生防菌為皮奧顯亞類芽孢桿菌(Paenibacillus peoriae)SF4_ll，保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址:湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保藏中心，保藏號:CCTCCNO:M 2012489。
2.一種如權利要求1所述的防治芝麻枯萎病生防菌的分離方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)病原菌及土壤微生物的分離: a)病原菌的分離: 取芝麻枯萎病發(fā)病植株，對芝麻植株的病桿進行消毒、清洗，再將病感中央維管束組織放入含有50 μ g/mL氯霉素的PDA培養(yǎng)基上，在26-28 °C條件下培養(yǎng)3_4d，然后將優(yōu)勢菌落在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-4d后，進行單孢分離純化，保存?zhèn)溆茫? b)土壤微生物的分離: 稱取紫花地丁根部土壤，加入無菌水，采用濃度梯度法稀釋土壤懸液，取濃度梯度土壤懸液均勻涂布在1/10TSA培養(yǎng)平板上，在26-28°C條件下，倒置培養(yǎng)l_2d ;將生長出的菌落接種于TSA培養(yǎng)基進行分離純化，然后將純化的細菌與50%甘油等量混合_70°C冷凍保存?zhèn)溆茫? 2)拮抗菌篩選: 將培養(yǎng)的不同土壤細菌與尖孢鐮刀菌芝麻專化型在PDK培養(yǎng)基上對峙培養(yǎng)，判斷有無拮抗作用； 3)對拮抗菌進行鑒定分類。`
3.根據權利要求2所述的一種防治芝麻枯萎病生防菌的分離方法，其特征在于，所述芝麻植株病桿為芝麻桿病健交界處的莖桿。
4.根據權利要求2所述的一種防治芝麻枯萎病生防菌的分離方法，其特征在于，所述PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉15g，蒸餾水1000mL，pH7.0-7.2，121 °C濕熱滅菌 20min。
5.根據權利要求2所述的一種防治芝麻枯萎病生防菌的分離方法，其特征在于，所述1/10TSA 培養(yǎng)基為:TSB (Trypticase Soya Broth, Difc0.) 3g,瓊月旨 15g,蒸懼水 1000mL,ρΗ7.0-7.2，121 °C濕熱滅菌 20min。
6.根據權利要求2所述的一種防治芝麻枯萎病生防菌的分離方法，其特征在于，所述 TSA 培養(yǎng)基為:TSB (Trypticase Soya Broth, Difc0.) 30g,瓊脂 15g,蒸懼水 1000mL,ρΗ7.0-7.2，121 °C濕熱滅菌 20min。
7.根據權利要求2所述的一種防治芝麻枯萎病生防菌的分離方法，其特征在于，所述PDK培養(yǎng)基:馬鈴薯200g,葡萄糖20g，蛋白胨IOg,瓊脂15g，蒸餾水1000mL, ρΗ7.0-7.2，121 °C濕熱滅菌20min。
8.—種如權利要求1所述的防治芝麻枯萎病的生防菌菌劑，其特征在于，將生防菌接種在LB液體培養(yǎng)基中，在30-33°C條件下振蕩培養(yǎng)2-3d，離心，取沉淀加入無菌水即得。
9.根據權利要求8所述的防治芝麻枯萎病的生防菌菌劑，其特征在于，所述LB液體培養(yǎng)基為:酵母提取物5g，蛋白胨10g，氯化鈉10g，瓊脂15g，蒸餾水lOOOmL，pH7.0-7.2，121 °C濕熱滅菌20min。
10.一種防治芝麻枯萎病的生防菌在促進芝麻生長方面的應用。
【文檔編號】A01P21/00GK103865825SQ201210538699
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月13日 優(yōu)先權日:2012年12月13日
【發(fā)明者】苗紅梅, 張海洋, 常淑嫻, 魏利斌, 段迎輝 申請人:河南省農業(yè)科學院