一種培育抗白葉枯病植物的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種培育抗白葉枯病植物的方法。本發(fā)明提供了一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟：抑制出發(fā)植物中l(wèi)c7基因的表達(dá)，得到抗病性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物；所述lc7基因?yàn)榫幋a如下（a）或（b）所述蛋白質(zhì)的基因：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；（b）將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明發(fā)明，抑制水稻品種“日本晴”中的所述lc7基因表達(dá)后，植株對白葉枯病的抗性大大增加且具有顯著的矮化特征。本發(fā)明對于抗白葉枯病植物的育種和矮化植物的育種具有良好的應(yīng)用前景，對水稻的種植和生產(chǎn)具有重大價(jià)值。
【專利說明】一種培育抗白葉枯病植物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種培育抗白葉枯病植物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻原產(chǎn)亞洲熱帶，在中國廣為栽種后，逐漸傳播到世界各地。水稻所結(jié)稻粒去殼后稱大米或米。世界上近一半人口，都以大米為食。大米的食用方法多種多樣，有米飯、米粥、米餅、米糕、米線等。水稻除可食用外，還可以釀酒、制糖作工業(yè)原料，稻殼、稻桿也有很多用處。
[0003]水稻主要的生長區(qū)域是中國南方、臺(tái)灣、日本、朝鮮半島、東南亞、南亞、歐洲南部地中海沿岸、美國東南部、中美洲、大洋洲和非洲部分地區(qū)，中國北方沿河地區(qū)也種植稻。也就是說，除了南極洲之外，幾乎大部分地方都有稻米生長。在2003年統(tǒng)計(jì)，全世界的稻作產(chǎn)量高達(dá)5億8900萬噸。在亞洲就有5億3400萬噸的產(chǎn)量。而全世界稻田總面積可達(dá)150萬平方公里。
[0004]水稻白葉枯病在歐洲、非洲、南美、美國、澳大利亞、亞洲都有發(fā)生；而以日本、印度、我國發(fā)生較重。白葉枯病原菌(白葉枯菌)屬真細(xì)菌目，假單胞菌科，黃單胞菌屬，為短桿狀，一根極生鞭毛，不形成芽孢。病原菌形態(tài)特征:細(xì)菌桿狀有單根極鞭毛，格蘭氏染色反應(yīng)陰性。菌落圓形，表面光滑有光澤，蠟黃色。白葉枯病主要發(fā)生于葉片及葉鞘上。初起在葉緣產(chǎn)生半透明黃色小斑，以后沿葉緣一側(cè)或兩側(cè)或沿中脈發(fā)展成波紋狀的黃綠或灰綠色病斑；病部與健部分界線明顯；數(shù)日后病斑轉(zhuǎn)為灰白色，并向內(nèi)卷曲，遠(yuǎn)望一片枯槁色，故稱白葉枯病。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種培育抗白葉枯病植物的方法。
[0006]本發(fā)明提供了一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟:抑制出發(fā)植物中l(wèi)c7基因的表達(dá)，得到抗病性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物(lc7干擾植株)；
[0007]所述lc7基因?yàn)榫幋a如下(a)或(b)所述蛋白質(zhì)的基因:(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
[0008]所述lc7基因可為如下I)或2)或3)或4)的DNA分子:
[0009]1)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0010]2)序列表中序列3所示的DNA分子；
[0011]3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗病相關(guān)蛋白的DNA分子;
[0012]4)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物抗病相關(guān)蛋白的DNA分子。
[0013]上述嚴(yán)格條件可為在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC、0.1%SDS 和 I X SSC、0.1%SDS 各洗膜一次。
[0014]所述“抑制出發(fā)植物中l(wèi)c7基因的表達(dá)”的實(shí)現(xiàn)方式具體如下:在出發(fā)植物中導(dǎo)入針對所述lc7基因的干擾載體。所述干擾載體可為將特異DNA片段-1和特異DNA片段-1I分別插入植物表達(dá)載體的不同多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒；所述特異DNA片段-1如序列表的序列2自5’末端第1097至1431位核苷酸所示；所述特異DNA片段-1I與所述特異DNA片段-1反向互補(bǔ)。所述植物表達(dá)載體中可具有任何一種一般性啟動(dòng)子、增強(qiáng)啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所使用的載體進(jìn)行加工，如加入可選擇性標(biāo)記(⑶S基因、GFP和熒光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標(biāo)記基因(慶大霉素，卡那霉素等)。為了轉(zhuǎn)基因植物釋放的安全性，在構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)也可不攜帶任何標(biāo)記基因，在苗期接種水稻白葉枯病菌種進(jìn)行篩選。所述干擾載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)或基因槍等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物。所述植物表達(dá)載體具體可為PTCK303載體。
[0015]所述抗病具體可為抗白葉枯病。所述白葉枯病具體可為白葉枯菌菲律賓6號小種PX099引起的白葉枯病。
[0016]所述出發(fā)植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物可為禾本科植物，具體可為稻屬植物，更具體可為水稻品種“日本晴”。
[0017]發(fā)明人發(fā)現(xiàn):lc7干擾植株中細(xì)胞內(nèi)的活性氧清除酶活性增加以清除產(chǎn)生過多的活性氧，可能激發(fā)了細(xì)胞的防御反應(yīng)，對白葉枯菌產(chǎn)生廣譜抗性。
[0018]本發(fā)明還保護(hù)一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟:在出發(fā)植物中導(dǎo)入所述lc7基因，得到抗病性降低的轉(zhuǎn)基因植物。所述抗病具體可為抗白葉枯病。所述白葉枯病具體可為白葉枯菌菲律 賓6號小種PX099引起的白葉枯病。所述出發(fā)植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物可為禾本科植物，具體可為稻屬植物，更具體可為水稻品種“日本晴”。所述出發(fā)植物可為以上任一所述方法得到的抗病性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物(lc7干擾植株)。所述“在出發(fā)植物中導(dǎo)入所述lc7基因”的實(shí)現(xiàn)方法具體如下:在出發(fā)植物中導(dǎo)入含有所述lc7基因的表達(dá)載體。所述表達(dá)載體可為在植物表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)插入所述lc7基因得到的重組質(zhì)粒。所述表達(dá)載體中，所述lc7基因的表達(dá)可由序列表的序列3自5’末端第I至1465位核苷酸所示的lc7基因啟動(dòng)子啟動(dòng)。所述植物表達(dá)載體中可具有任何一種一般性啟動(dòng)子、增強(qiáng)啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所使用的載體進(jìn)行加工，如加入可選擇性標(biāo)記(GUS基因、GFP和熒光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標(biāo)記基因(慶大霉素，卡那霉素等)。所述表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)或基因槍等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物。所述重組質(zhì)粒具體可如下:將pCAMBIA2300-Actin載體的多克隆位點(diǎn)分別插入所述lc7基因啟動(dòng)子和所述lc7基因。
[0019]本發(fā)明還保護(hù)一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟:抑制出發(fā)植物中所述lc7基因的表達(dá)，得到矮化的轉(zhuǎn)基因植物(lc7干擾植株)。
[0020]所述“抑制出發(fā)植物中l(wèi)c7基因的表達(dá)”的實(shí)現(xiàn)方式具體如下:在出發(fā)植物中導(dǎo)入針對所述lc7基因的干擾載體。所述干擾載體可為將特異DNA片段-1和特異DNA片段-1I分別插入植物表達(dá)載體的不同多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒；所述特異DNA片段-1如序列表的序列2自5’末端第1097至1431位核苷酸所示；所述特異DNA片段-1I與所述特異DNA片段-1反向互補(bǔ)。所述植物表達(dá)載體中可具有任何一種一般性啟動(dòng)子、增強(qiáng)啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所使用的載體進(jìn)行加工，如加入可選擇性標(biāo)記(⑶S基因、GFP和熒光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標(biāo)記基因(慶大霉素，卡那霉素等)。為了轉(zhuǎn)基因植物釋放的安全性，在構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)也可不攜帶任何標(biāo)記基因，直接通過矮化表型進(jìn)行篩選。所述干擾載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)或基因槍等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物。所述植物表達(dá)載體具體可為PTCK303載體。
[0021]所述出發(fā)植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物可為禾本科植物，具體可為稻屬植物，更具體可為水稻品種“日本晴”。
[0022]本發(fā)明還保護(hù)一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟:在出發(fā)植物中導(dǎo)入所述lc7基因，得到株高增加的轉(zhuǎn)基因植物。所述出發(fā)植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物可為禾本科植物，具體可為稻屬植物，更具體可為水稻品種“日本晴”。所述出發(fā)植物可為以上任一所述方法得到的矮化的轉(zhuǎn)基因植物(lc7干擾植株)。所述“在出發(fā)植物中導(dǎo)入所述lc7基因”的實(shí)現(xiàn)方法具體如下:在出發(fā)植物中導(dǎo)入含有所述lc7基因的表達(dá)載體。所述表達(dá)載體可為在植物表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)插入所述lc7基因得到的重組質(zhì)粒。所述表達(dá)載體中，所述lc7基因的表達(dá)可由序列表的序列3自5’末端第I至1465位核苷酸所示的lc7基因啟動(dòng)子啟動(dòng)。所述植物表達(dá)載體中可具有任何一種一般性啟動(dòng)子、增強(qiáng)啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所使用的載體進(jìn)行加工，如加入可選擇性標(biāo)記(GUS基因、GFP和熒光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標(biāo)記基因(慶大霉素，卡那霉素等)。所述表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)或基因槍等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物。
[0023]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，抑制水稻品種“日本晴”中的所述lc7基因表達(dá)后，植株對白葉枯病的抗性大大增加且具有顯著的矮化特征。在所述lc7基因抑制植株中重新導(dǎo)入所述lc7基因，可以使其恢復(fù)水稻品種“日本晴”的表型，即對白葉枯病感病和株高增加。本發(fā)明對于抗白葉枯病植物的育種和矮化植物的育種具有良好的應(yīng)用前景，對水稻的種植和生產(chǎn)具有重大價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為重組質(zhì)粒甲的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0025]圖2為重組質(zhì)粒乙的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0026]圖3為各個(gè)植株正常培養(yǎng)至孕穗期的照片。
[0027]圖4為各個(gè)植株接種白葉枯菌菲律賓6號小種PX099兩周被接種葉片的照片?！揪唧w實(shí)施方式】
[0028]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。 下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。pMD18-T購自TaKaRa公司。
[0029]pCAMBIA2300-Actin載體:公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得；參考文獻(xiàn):Kejian Wang, Ding Tang, Lilan Hong, WenyingXu, Jian Huang, Ming Li,Minghong Gu,Yongbiao Xue,Zhukuan Cheng.DEP and AFO Regulate Reproductive Habitin Rice.January 2010.Volume 6。
[0030]pTCK303載體:公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得；參考文獻(xiàn):ZHEN WANG, CHANGBIN CHEN, YUNYUAN XU, RONGXI JIANG, YE HAN, ZHIHONG XU, KANG CHONGPlant Molecular Biology Reporter,2004,22:409 - 417。
[0031]白葉枯菌菲律賓6號小種PX099:公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得；參考文獻(xiàn):鄭崇珂，王春連，于元杰，梁云濤，趙開軍.水稻抗白葉枯病新基因Xa32(t)的鑒定和初步定位.作物學(xué)報(bào)，2009，35 (7):1173-1180。
[0032]農(nóng)桿菌菌株EHA105:公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得；參考文獻(xiàn):H.Xiao, Y.Wang, D.F.Liu, ff.M.Wang, X.B.Li, X.F.Zhao, J.C.Xu, ff.X.Zhai, L.H.Zhu.Functional analysis of the rice AP3 homologue 0sMADS16 by RNA interference.Plant Molecular Biology (2003)52:957-966。
[0033]lc7基因的基因組DNA如序列表的序列3所示，長度為16579bp，由33個(gè)外顯子組成。lc7基因的cDNA如序列表的序列2所示，長度為4848bp。lc7基因編碼序列表的序列I所示的蛋白質(zhì)(由1615個(gè)氨基酸殘基組成)。
[0034]實(shí)施例1、重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0035]一、重組質(zhì)粒甲的構(gòu)建
[0036]1、提取水稻 品種“日本晴”的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0037]2、以步驟I的cDNA為模板，用Fl和Rl組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)
增產(chǎn)物。
[0038]Fl:5' -GAGCTCatggccacgctcccacgtgc-3'；
[0039]Rl:5/ -GTCGACtcacttcgccgattgtactg-31。
[0040]3、用限制性內(nèi)切酶Sac I和Sal I雙酶切步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
[0041]4、用限制性內(nèi)切酶Sac I和Sal I雙酶切pCAMBIA2300_Actin載體，回收約IOkb的載體骨架。
[0042]5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒。
[0043]6、提取水稻品種“日本晴”的基因組DNA。
[0044]7、以步驟6提取的基因組DNA為模板，用F2和R2組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0045]F2:5' -GAATTCttgtaaggctgctaggagcc-3'；
[0046]R2:5' -GAGCTCgcgtgatatatctccaacga-31 ；
[0047]8、用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Sac I雙酶切步驟7的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
[0048]9、用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Sac I雙酶切步驟5得到的重組質(zhì)粒，回收約11.5kb的載體骨架。
[0049]10、將步驟8的酶切產(chǎn)物和步驟9的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒甲(又稱重組質(zhì)粒pClc7c)。重組質(zhì)粒甲的結(jié)構(gòu)示意圖見圖1，NPTII代表新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II基因，CaMV35S ter代表CaMV35S基因終止子，p35S代表CaMV 35S基因啟動(dòng)子，lc7 promoer代表lc7基因啟動(dòng)子，lc7c代表lc7基因的cDNA。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒甲進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下:將pCAMBIA2300-Actin載體EcoR I和Sac I酶切位點(diǎn)之間的小片段取代為了序列表的序列3自5’末端第I至1465位核苷酸所示的lc7基因啟動(dòng)子，Sac I和Sal I酶切位點(diǎn)之間的小片段取代為了序列表的序列2所示的lc7基因。
[0050]二、重組質(zhì)粒乙的構(gòu)建
[0051]1、提取水稻品種“日本晴”的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0052]2、以步驟I的cDNA為模板，用F3和R3組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)
增產(chǎn)物。
[0053]F3:5' -ACTAGTGGTACCctaaagcatctgattcagca-31 ;
[0054]R3:5' -GAGCTCGGATCCtgactcatccattggtataa-31
[0055]3、用限制性內(nèi)切酶Kpn I和BamH I雙酶切步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
[0056]4、用限制性內(nèi)切酶Kpn I和BamH I雙酶切pTCK303載體，回收約14.5kb的載體骨架。
[0057]5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒。
[0058]6、用限制性內(nèi)切酶SpeI和Sac I雙酶切步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。 [0059]7、用限制性內(nèi)切酶Sac I和SpeI雙酶切步驟5的重組質(zhì)粒，回收約15kb的載體骨架。
[0060]8、將步驟6的酶切產(chǎn)物和步驟7的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒乙(又稱重組質(zhì)粒pClc7RNAi)。重組質(zhì)粒乙的結(jié)構(gòu)示意圖見圖2，Hyg代表潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，CaMV35Ster代表CaMV35S基因終止子，p35S代表CaMV 35S啟動(dòng)子，pUbi代表水稻Ubiquitin基因啟動(dòng)子，GUSa代表β-葡萄糖苷酸酶的外顯子，NOS ter代表土壤農(nóng)桿菌質(zhì)粒的胭脂堿合成酶基因的終止子。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒乙進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下:以PTCK303載體為出發(fā)載體，用特異DNA片段-1 (即序列表的序列2自5’末端第1097至1431位核苷酸所示的雙鏈DNA片段)取代了出發(fā)載體Kpn I和BamH I酶切位點(diǎn)之間的小片段，并且用特異DNA片段-1I取代了出發(fā)載體Sac I和SpeI酶切位點(diǎn)之間的小片段；特異DNA片段-1I與特異DNA片段-1反向互補(bǔ)，且一端增加了 Kpn I酶切識別序列另一端增加了 BamH I酶切識別序列。
[0061]實(shí)施例2、轉(zhuǎn)基因植株的獲得和鑒定
[0062]一、轉(zhuǎn)基因植株乙的獲得
[0063]1、將重組質(zhì)粒乙導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株EHA105，得到重組農(nóng)桿菌乙。
[0064]2、將步驟I得到的重組農(nóng)桿菌乙與水稻品種“日本晴”的成熟胚愈傷組織共培養(yǎng)，采用50mg/L潮霉素篩選抗性愈傷組織，然后經(jīng)過預(yù)分化、分化、生根后得到Ttl代植株。
[0065]3、提取Ttl代植株的基因組DNA，用Hyg_F和Hyg_R組成的引物對進(jìn)行PCR鑒定，目的條帶約1035bp，PCR鑒定中擴(kuò)增得到目的條帶的植株即為轉(zhuǎn)基因植株乙(lc7干擾植株)。
[0066]Hyg_F:5/ -TAGGAGGGCGTGGATATGTC-3'；
[0067]Hyg_R:5/ -TACACAGCCATCGGTCCAGA-3'。
[0068]二、轉(zhuǎn)基因植株甲的獲得
[0069]1、將重組質(zhì)粒甲導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株EHA105，得到重組農(nóng)桿菌甲。
[0070]2、將步驟I得到的重組農(nóng)桿菌甲與轉(zhuǎn)基因植株乙的成熟胚愈傷組織共培養(yǎng)，采用120-200 μ g/L G418篩選抗性愈傷組織，然后經(jīng)過預(yù)分化、分化、生根后得到Ttl代植株。[0071]3、提取Ttl代植株的基因組DNA，用NPT_F和NPT_R組成的引物對進(jìn)行PCR鑒定，目的條帶約411bp，PCR鑒定中擴(kuò)增得到目的條帶的植株即為轉(zhuǎn)基因植株甲(lc7互補(bǔ)植株)。
[0072]NPT_F:5/ -GCAGGCATCGCCATGGG-3'；
[0073]NPT_R:5/ -GCCCTGAATGAACTGCA-3'。
[0074]三、對照植株的獲得
[0075]用PTCK303載體代替重組質(zhì)粒乙進(jìn)行步驟一，得到轉(zhuǎn)空載體植株乙。
[0076]用PCAMBIA2300載體代替重組質(zhì)粒甲，并且用水稻品種“日本晴”代替轉(zhuǎn)基因植株乙，進(jìn)行步驟二，得到轉(zhuǎn)空載體植株甲。
[0077]四、轉(zhuǎn)基因植株的鑒定
[0078]1、將Ttl代lc7干擾植株、T0代lc7互補(bǔ)植株、T0代轉(zhuǎn)空載體植株乙、T0代轉(zhuǎn)空載體植株甲和水稻品種“日本晴”各8株正常培養(yǎng)至孕穗期后拍照。照片見圖3，A為水稻品種“日本晴”，B為lc7干擾植株，C為轉(zhuǎn)空載體植株乙。
[0079]水稻品種“日本晴”的平均株高為106.4±2.1cm。
[0080]轉(zhuǎn)空載體植株甲的平均株高為106.4 ±2.5cm。
[0081]轉(zhuǎn)空載體植株乙的平均株高為106.4± 1.9cm。
[0082]lc7互補(bǔ)植株的平均株高為106.3±2.9cm。
[0083]lc7干擾植株的平均株聞為88.6±2.2cm。
[0084]與水稻品種“日本晴”相比，lc7干擾植株具有矮化的表型。lc7互補(bǔ)植株、轉(zhuǎn)空載體植株乙、轉(zhuǎn)空載體植株甲的株高表型均與水稻品種“日本晴” 一致。
[0085]2、將Ttl代lc7干擾植株、T0代lc7互補(bǔ)植株、T0代轉(zhuǎn)空載體植株乙、T0代轉(zhuǎn)空載體植株甲和水稻品種“日本晴”各8株正常培養(yǎng)至分蘗盛期，采用Kauffman等(1973年)的人工剪葉接種白葉枯菌菲律賓6號小種PX099，具體如下:每株植株接種3-5個(gè)葉片，接種時(shí)先把剪刀在白葉枯菌菲律賓6號小種PX099的菌液(溶劑為無菌水，菌濃度為IO9個(gè)細(xì)胞/ml)菌液中浸泡一下，然后用剪刀剪去每個(gè)要被接種的葉片頂端3-5cm，接種兩周后觀察各個(gè)植株上被接種葉片的表型并拍照,根據(jù)葉片的表型進(jìn)行病情分級。
[0086]水稻對白葉枯菌病情的分級標(biāo)準(zhǔn)見表2。
[0087]表2水稻對白葉枯菌病情的分級標(biāo)準(zhǔn)
[0088]
【權(quán)利要求】
1.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟:抑制出發(fā)植物中1C7基因的表達(dá)，得到抗病性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物；所述lc7基因?yàn)榫幋a如下(a)或(b)所述蛋白質(zhì)的基因: Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述lc7基因?yàn)槿缦翴)或2)或3)或4)的DNA分子: 1)序列表中序列2所不的DNA分子； 2)序列表中序列3所示的DNA分子； 3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗病相關(guān)蛋白的DNA分子; 4)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物抗病相關(guān)蛋白的DNA分子。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述“抑制出發(fā)植物中l(wèi)c7基因的表達(dá)”的實(shí)現(xiàn)方法如下:在出發(fā)植物中導(dǎo)入針對所述lc7基因的干擾載體。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述干擾載體為將特異DNA片段-1和特異DNA片段-1I分別插入植物表達(dá)載體的不同多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒；所述特異DNA片段-1如序列表的序列2自5’末端 第1097至1431位核苷酸所示；所述特異DNA片段-1I與所述特異DNA片段-1反向互補(bǔ)。
5.如權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于:所述抗病為抗白葉枯病。
6.如權(quán)利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于:所述出發(fā)植物為單子葉植物或雙子葉植物。
7.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟:在出發(fā)植物中導(dǎo)入lc7基因，得到抗病性降低的轉(zhuǎn)基因植物；所述lc7基因?yàn)榫幋a如下(a)或(b)所述蛋白質(zhì)的基因: Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
8.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟:抑制出發(fā)植物中l(wèi)c7基因的表達(dá)，得到矮化的轉(zhuǎn)基因植物；所述lc7基因?yàn)榫幋a如下(a)或(b)所述蛋白質(zhì)的基因: Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物矮化相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:所述lc7基因?yàn)槿缦翴)或2)或3)或4)的DNA分子: 1)序列表中序列2所不的DNA分子； 2)序列表中序列3所示的DNA分子； 3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗病相關(guān)蛋白的DNA分子; 4)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物抗病相關(guān)蛋白的DNA分子。
10.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟:在出發(fā)植物中導(dǎo)入lc7基因，得到株高增加的轉(zhuǎn)基因植物；所述lc7基因?yàn)榫幋a如下(a)或(b)所述蛋白質(zhì)的基因: Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病相 關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
【文檔編號】A01H5/00GK103882052SQ201210558838
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月20日
【發(fā)明者】翟文學(xué), 江光懷, 陳紅霖 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所