專(zhuān)利名稱(chēng)：一種紫芝擔(dān)孢子萌發(fā)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種紫芝擔(dān)孢子萌發(fā)的方法。
技術(shù)背景紫芝，學(xué)名為Ganoderma sinense (Zhao, Xu et ) Zhang,屬于真菌門(mén)、擔(dān)子菌亞門(mén)、層菌綱、非褶菌目、靈芝科、靈芝屬。紫芝也稱(chēng)“中國(guó)靈芝”，野生主要分布在兩廣、福建和臺(tái)灣等地區(qū)。子實(shí)體木栓質(zhì)，多呈半圓形至腎形，少數(shù)近圓形，大型個(gè)體長(zhǎng)寬可達(dá)20cm，一般個(gè)體4. 7 X 4cm，小型個(gè)體2 X1. 4cm，表面紫黑色，具漆樣光澤，菌肉銹褐色。菌管管口與菌肉同色，管口圓形，每毫米5個(gè)。菌柄側(cè)生，長(zhǎng)可達(dá)15cm，直徑約2cm，黑色，有光澤。擔(dān)孢子頂端呈臍突形，或稍平截，雙層壁，外壁透明內(nèi)壁平滑，內(nèi)壁呈淡褐色有明顯小刺。掃描電鏡下觀(guān)察孢子表面有縱向的溝脊，脊上側(cè)邊可見(jiàn)整齊的孔洞結(jié)構(gòu)，成熟孢子大小約為10-12. 5 X 7-8. 5 μ m0紫芝作為一種傳統(tǒng)藥用菌被《中華人民共和國(guó)藥典》所收錄，其含有多種化學(xué)成分，主要為多糖，生物堿，留醇，有機(jī)酸及三萜類(lèi)化合物。紫芝氣味甘、性溫、無(wú)毒，具有治耳聾、利關(guān)節(jié)、保神、益精氣、久服輕身不老延年的功效。
隨著紫芝的保健功效不斷為人所知，紫芝需求量不斷加大。對(duì)與紫芝的種植栽培要求不斷提高，然而紫芝生產(chǎn)周期長(zhǎng)，產(chǎn)量低，給紫芝的生產(chǎn)栽培帶來(lái)很大的困難。另外由于紫芝抗病蟲(chóng)害能力弱，導(dǎo)致紫芝農(nóng)藥殘留現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，嚴(yán)重制約了紫芝產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。因此選育生產(chǎn)周期短，高產(chǎn)，抗病蟲(chóng)害的紫芝菌株勢(shì)在必行。現(xiàn)代蕈菌育種主要方式主要有一下幾種野生馴化、誘變育種、原生質(zhì)體融合育種和雜交育種等。野生馴化，主要從野外采集經(jīng)過(guò)組織分離而來(lái)，由于沒(méi)有發(fā)生遺傳變異所以不能獲得新的種性。誘變育種和原生質(zhì)體融合不僅需要篩選眾多的變異體和融合體，而且由于遺傳穩(wěn)定性較差，并未得到廣泛的應(yīng)用。雜交育種是一種有效的品種改良技術(shù)，并在香菇、雙孢蘑菇和金針菇等得到廣泛的應(yīng)用。其主要流程為(1)親本選擇；(2)親本單核菌株的獲得；(3)單核菌株配對(duì)雜交；[4]雜合子鑒定；(5)雜合子篩選，小試、大試和推廣。研究表明紫芝擔(dān)孢子為雙層細(xì)胞壁， 同紫芝一樣擔(dān)孢子不易萌發(fā)，也未見(jiàn)有關(guān)紫芝擔(dān)孢子萌發(fā)的研究。
紫芝擔(dān)孢子為雙層細(xì)胞壁，同紫芝一樣擔(dān)孢子不易萌發(fā)，無(wú)法進(jìn)行擔(dān)孢雜交育種，目前生產(chǎn)上使用的紫芝品種主要是通過(guò)野生菌株馴化而來(lái)。本方法解決了紫芝擔(dān)孢子萌發(fā)難的問(wèn)題，在紫芝雜交育種上具有重大意義
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種紫芝擔(dān)孢子萌發(fā)的方法，解決紫芝擔(dān)孢子不易萌發(fā)的難題， 為紫芝的雜交育種打下基礎(chǔ)。
本發(fā)明的一種紫芝擔(dān)孢子萌發(fā)的方法，包括以下步驟(I)紫芝擔(dān)孢子收集用于萌發(fā)的紫芝擔(dān)孢子應(yīng)選擇孢子釋放周期前10天釋放的，即待紫芝菌蓋分化形成， 菌蓋未完全呈紫色、邊緣O. 3-0. 8cm呈白色生長(zhǎng)圈時(shí)收集擔(dān)孢子；采用套袋收集的方法，套袋時(shí)選用滅菌的信封內(nèi)墊一張無(wú)菌的硫酸紙，用信封將紫芝菌蓋套住至菌柄，使有放硫酸紙的一面對(duì)著菌蓋背面，再用封條將信封固定在菌蓋上；擔(dān)孢子收集期間控制環(huán)境相對(duì)濕度80%-90%，溫度24°C _28°C，套袋收集的時(shí)間為20h_24h ；(3)紫芝擔(dān)孢子保存收集的紫芝擔(dān)孢子放在滅菌的信封內(nèi)，控制環(huán)境溫度18°C _28°C、相對(duì)濕度50%-75%， 或放置在4 °C冰箱，但放置時(shí)間不超過(guò)24h ；(4)擔(dān)孢子萌發(fā)處理取收集的紫芝擔(dān)孢子，在無(wú)菌操作下用無(wú)菌水稀釋至100倍顯微鏡視野中有15-30個(gè)孢子即可涂布紫芝擔(dān)孢子萌發(fā)培養(yǎng)基，然后在25V _27°C生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，至擔(dān)孢子萌發(fā)；使用的紫芝擔(dān)孢子萌發(fā)培養(yǎng)基為麥芽靈芝培養(yǎng)基，其配方為麥芽汁200ml，靈芝提取液 100 ml，瓊脂 20g，水 700ml，121°C滅菌 30 min ；所述麥芽汁取干麥芽粉15_20g加入300ml水中，在60—70°C浸潰60min，過(guò)濾取浸潰液，將殘?jiān)瑯釉俳?、過(guò)濾一次，將兩次浸潰液混合，過(guò)濾去除殘?jiān)⒓铀ㄈ葜罥L ；所述靈芝提取液取150-250g切碎的干紫芝或干赤芝，加入IL水煮沸30min，過(guò)濾去除殘?jiān)⒓铀ㄈ葜?L。
本發(fā)明選擇菌蓋帶有白邊剛開(kāi)始彈射孢子的紫芝子實(shí)體來(lái)收集擔(dān)孢子，通過(guò)子實(shí)體活體套袋收集擔(dān)孢子，將孢子涂布于萌發(fā)培養(yǎng)基中，獲得了紫芝單核菌株。解決了實(shí)驗(yàn)室條件下紫芝成熟擔(dān)孢子不易萌發(fā)，難以進(jìn)行紫芝雜交育種的難題。
本發(fā)明簡(jiǎn)單易行無(wú)需用到特殊的藥品及儀器設(shè)備，普通實(shí)驗(yàn)室即可通過(guò)本方法獲得所需的單核菌株用于雜交育種或紫芝的遺傳分析。擔(dān)孢子是擔(dān)子菌減數(shù)分裂的產(chǎn)物，存在廣泛的遺傳變異。由擔(dān)孢子萌發(fā)所獲得的單核菌株具有遺傳多樣性的特點(diǎn)，單核菌株雜交后，有利于獲得超親性狀，解決了紫芝不能單孢雜交的問(wèn)題。


圖1為紫芝擔(dān)孢在培養(yǎng)基中萌發(fā)形態(tài)。具體實(shí)施例
本發(fā)明的一種赤芝擔(dān)孢子萌發(fā)的方法，包括以下步驟1.紫芝擔(dān)孢子收集時(shí)期選擇用于萌發(fā)的紫芝擔(dān)孢子應(yīng)選 擇孢子釋放周期前10天釋放的，即待紫芝菌蓋分化形成， 菌蓋未完全呈紫色、邊緣O. 3-0. 8cm呈白色生長(zhǎng)圈時(shí)收集擔(dān)孢子；2.紫芝擔(dān)孢子收集方法采用套袋收集的方法，套袋材料選用透氣性、透光性好的信封，套袋時(shí)選用滅菌信封內(nèi)墊一張無(wú)菌的硫酸紙，用信封將紫芝菌蓋套住至菌柄，使有放硫酸紙的一面對(duì)著菌蓋背面，再用封條將信封固定在菌蓋上；擔(dān)孢子收集期間控制環(huán)境相對(duì)濕度80%-90%，溫度 240C _28°C，套袋收集的時(shí)間為20h-24h。
3.紫芝擔(dān)孢子保存收集的紫芝擔(dān)孢子放在無(wú)菌的信封內(nèi)，控制環(huán)境溫度18°C _28°C、相對(duì)濕度50%-75%， 或放置在4°C冰箱；但放置時(shí)間不超過(guò)24h。
4.擔(dān)孢子萌發(fā)處理取收集的紫芝擔(dān)孢子，在無(wú)菌操作下用無(wú)菌水稀釋至100倍顯微鏡視野中有15-30個(gè)孢子即可涂布紫芝擔(dān)孢子萌發(fā)培養(yǎng)基，然后在25°C _27°C生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，至擔(dān)孢子萌發(fā)；使用的紫芝擔(dān)孢子萌發(fā)培養(yǎng)基為麥芽靈芝培養(yǎng)基，其配方為麥芽汁200ml，靈芝提取液 100 ml，瓊脂 20g，水 700ml，121°C滅菌 30 min ；所述麥芽汁取干麥芽粉15_20g加入300ml水中，在60—70°C浸潰60min，過(guò)濾取浸潰液，將殘?jiān)瑯釉俳?、過(guò)濾一次，將兩次浸潰液混合，過(guò)濾去除殘?jiān)⒓铀ㄈ葜罥L ；所述靈芝提取液取150-250g切碎的干紫芝或干赤芝，加入IL水煮沸30min，過(guò)濾去除殘?jiān)⒓铀ㄈ葜?L。
為了充分公開(kāi)本發(fā)明的赤芝擔(dān)孢子萌發(fā)的方法，以下結(jié)合實(shí)施例加以說(shuō)明。
實(shí)施例1 :一種紫芝擔(dān)孢子萌發(fā)的方法選擇福建紫芝栽培品種紫芝S2作為親本，在PDA斜面進(jìn)行活化，長(zhǎng)滿(mǎn)斜面后轉(zhuǎn)接到木屑菌袋中。具體種植方法參見(jiàn)文獻(xiàn)鐘禮義，邱福平，陳體強(qiáng).闊葉樹(shù)邊材栽培紫芝示范試驗(yàn)[J].食用菌，2005，1:26-27。
2.擔(dān)孢子采集時(shí)期選擇紫芝孢子釋放周期大約30天，用于萌發(fā)的擔(dān)孢子應(yīng)選擇前10天釋放的。即待紫芝菌蓋分化形成，選擇選取朵型完整，長(zhǎng)勢(shì)健壯，菌管發(fā)育正常，子實(shí)體生長(zhǎng)至3-5cm、菌蓋邊緣 O. 3-0. 6cm呈白色生長(zhǎng)圈時(shí)收集擔(dān)孢子。
3.紫芝擔(dān)孢子收集方法用無(wú)菌的信封和硫酸紙采用紫芝活子實(shí)體套袋法收集孢子，將無(wú)菌的硫酸紙光面向上放入信封，再用信封將紫芝菌蓋套住至菌柄，使有放硫酸紙的一面對(duì)著菌蓋背面，用封條將信封固定在菌蓋上。孢子收集期間控制空間相對(duì)濕度85%-90%，溫度25°C -27°C，套袋收集的時(shí)間22h便可在硫酸紙收集到赤芝擔(dān)孢子。收集時(shí)間過(guò)短則收集的孢子量少，若時(shí)間過(guò)長(zhǎng)收集的擔(dān)孢子則不易萌發(fā)或不萌發(fā)。
4.紫芝擔(dān)孢子保存將收集的紫芝擔(dān)孢子裝入無(wú)菌的信封內(nèi)，于室溫下、相對(duì)濕度60%放置2h后進(jìn)行涂單孢。
5.擔(dān)孢子萌發(fā)處理取收集保存2h的紫芝孢子印，在無(wú)菌操作下用無(wú)菌水稀釋至100倍顯微鏡視野中有 10-20個(gè)孢子即可涂布平板，涂好的平板在28°C生化 培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)54h，可觀(guān)察到萌發(fā)的紫芝擔(dān)孢子，見(jiàn)圖1。使用的紫芝擔(dān)孢子萌發(fā)的平板培養(yǎng)基為麥芽靈芝培養(yǎng)基，其配方為 麥芽汁200ml，紫芝提取液100 ml，瓊脂20g，水700ml，121°C滅菌30 min ；麥芽汁取干麥芽粉15_20g加入300ml水中，在60— 70°C浸潰60min，濾取浸潰液，將殘?jiān)瑯釉俳⒁淮危瑢纱谓⒁夯旌?，過(guò)濾去除殘?jiān)⒓铀ㄈ葜罥L ；紫芝提取液取150-250g切碎的干紫芝，加入IL水煮沸30min，過(guò)濾去除殘?jiān)⒓铀ㄈ葜?L。
采用PDA培養(yǎng)基(配方200g馬鈴薯、20g葡萄糖、20g瓊脂、pH自然加水至IOOOmL) 或水瓊脂培養(yǎng)基(配方瓊脂20g，水1000ml)，紫芝擔(dān)孢子均不萌發(fā)，本發(fā)明經(jīng)麥芽靈芝培養(yǎng)基萌發(fā)處理54h后孢子萌發(fā)率為O. 91%。
6.單核菌株獲得及檢測(cè)選取觀(guān)察到有擔(dān)孢子萌發(fā)的平板，在100倍顯微鏡下觀(guān)察尋找萌發(fā)出芽管的擔(dān)孢子，用接種針無(wú)菌條件下連同培養(yǎng)基挑出萌發(fā)的擔(dān)孢子于斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當(dāng)菌落長(zhǎng)到Icm左右時(shí)即可在顯微鏡下鏡檢觀(guān)察是否有鎖狀聯(lián)合，無(wú)鎖狀聯(lián)合即為單核菌株。通過(guò)鏡檢純化后，共獲得了 31根紫芝單核菌株。
7.單孢菌株交配型測(cè)定以紫芝S2的一個(gè)單孢菌株記為T(mén)1，作為交配型測(cè)定的基準(zhǔn)菌株，其交配型定為AxBx。將余下30根紫芝S2單核菌株與T1在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行配對(duì)，待兩個(gè)單孢菌株的菌絲接觸3d 后，觀(guān)察鎖狀聯(lián)合，出現(xiàn)鎖狀聯(lián)合的表示與T1發(fā)生親和反應(yīng)，選出能與T1發(fā)生親和反應(yīng)的單孢菌株，將其定為測(cè)交菌株T2,其交配型定為AyBy。
將所有不與T1親和的單孢分離菌株與T2交配，能與T2發(fā)生親和反應(yīng)的單孢分離菌株的交配型則為AXBX。
將既不與T1發(fā)生親和，又不與T2發(fā)生親和的某一單孢菌株定為測(cè)交菌株T3，其交配型定為AxBy。將既不與T1發(fā)生親和，又不與T2發(fā)生親和的所有其他單孢菌株均與T3交配，交配中發(fā)生親和的菌株的交配型為AyBx，而不親和的菌株交配型為AxBy。
通過(guò)三輪交配反應(yīng)，可知31根紫芝S2單核菌株的交配型， 交配型為AxBx有11個(gè)單孢菌株，交配型為AyBy有7個(gè)單孢菌株，交配型為AxBy有8個(gè)單孢菌株，交配型為AyBx有 5個(gè)單孢菌株。獲得四種交配的單孢菌株。
擔(dān)孢子是減數(shù)分裂的產(chǎn)物，存在廣泛的變異，紫芝單孢菌株的獲得為紫芝的雜交育種提供了育種材料，同時(shí)也為紫芝的遺傳學(xué)分析打下基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.一種紫芝擔(dān)孢子萌發(fā)的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)紫芝擔(dān)孢子收集用于萌發(fā)的紫芝擔(dān)孢子應(yīng)選擇孢子釋放周期前10天釋放的，即待紫芝菌蓋分化形成， 菌蓋未完全呈紫色、邊緣O. 3-0. 8cm呈白色生長(zhǎng)圈時(shí)收集擔(dān)孢子；采用套袋收集的方法，套袋時(shí)選用滅菌的信封內(nèi)墊一張無(wú)菌的硫酸紙，用信封將紫芝菌蓋套住至菌柄，使有放硫酸紙的一面對(duì)著菌蓋背面，再用封條將信封固定在菌蓋上；擔(dān)孢子收集期間控制環(huán)境相對(duì)濕度80%-90%，溫度24°C _28°C，套袋收集的時(shí)間為20h_24h ；(2)紫芝擔(dān)孢子保存收集的紫芝擔(dān)孢子放在滅菌的信封內(nèi)，控制環(huán)境溫度18°C _28°C、相對(duì)濕度50%-75%， 或放置在4 °C冰箱，但放置時(shí)間不超過(guò)24h ；(3)擔(dān)孢子萌發(fā)處理取收集的紫芝擔(dān)孢子，在無(wú)菌操作下用無(wú)菌水稀釋至100倍顯微鏡視野中有15-30個(gè)孢子即可涂布紫芝擔(dān)孢子萌發(fā)培養(yǎng)基，然后在25V _27°C生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，至擔(dān)孢子萌發(fā)；使用的紫芝擔(dān)孢子萌發(fā)培養(yǎng)基為麥芽靈芝培養(yǎng)基，其配方為麥芽汁200ml，靈芝提取液 100 ml，瓊脂 20g，水 700ml，121°C滅菌 30 min ；所述麥芽汁取干麥芽粉15_20g加入300ml水中，在60—70°C浸潰60min，過(guò)濾取浸潰液，將殘?jiān)瑯釉俳?、過(guò)濾一次，將兩次浸潰液混合，過(guò)濾去除殘?jiān)⒓铀ㄈ葜罥L ；所述靈芝提取液取150-250g切碎的干紫芝或干赤芝，加入IL水煮沸30min，過(guò)濾去除殘?jiān)⒓铀ㄈ葜?L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種紫芝擔(dān)孢子萌發(fā)的方法。本發(fā)明選擇菌蓋帶有白邊剛開(kāi)始彈射孢子的紫芝子實(shí)體來(lái)收集擔(dān)孢子，通過(guò)子實(shí)體活體套袋收集擔(dān)孢子，將孢子涂布于萌發(fā)培養(yǎng)基(配方為麥芽汁200ml，靈芝提取液100ml，瓊脂20g，水700ml，121℃滅菌30min)中，獲得了紫芝單核菌株。解決了實(shí)驗(yàn)室條件下紫芝成熟擔(dān)孢子不易萌發(fā)，難以進(jìn)行紫芝雜交育種的難題。本發(fā)明簡(jiǎn)單易行無(wú)需用到特殊的藥品及儀器設(shè)備，普通實(shí)驗(yàn)室即可通過(guò)本方法獲得所需的單核菌株用于雜交育種或紫芝的遺傳分析。
文檔編號(hào)A01G1/04GK103026902SQ201210580138
公開(kāi)日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月28日
發(fā)明者吳小平, 柯斌榕, 劉新銳 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)