專利名稱：建立人卵巢癌動物模型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及建立人卵巢癌動物模型用組織的處理方法及模型建立方法。
背景技術(shù)：
卵巢癌預(yù)后差，是導(dǎo)致女性因生殖系統(tǒng)惡性腫瘤病死率最高的癌癥，因卵巢位于盆腔內(nèi)位置深，發(fā)生腫瘤時無典型癥狀，確診時60% 70%已屬晚期，腫塊已固定，出現(xiàn)腹水，廣泛盆腔轉(zhuǎn)移且卵巢癌化療病情緩解后容易復(fù)發(fā)，5年生存率只有20% 30%。相比其他婦科腫瘤，卵巢癌早期診斷和治療近來并無重大進(jìn)展，患者生預(yù)后無明顯轉(zhuǎn)變。因此尋找和探索用于卵巢癌診斷和治療的新技術(shù)，新方法變得非常重要。 動物模型是對人體腫瘤進(jìn)行體內(nèi)研究必不可少的工具，在建立新的治療方法時尤為重要。目前建立的人卵巢癌裸鼠轉(zhuǎn)移瘤模型大多來源于腫瘤細(xì)胞株，由于腫瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)，離開了體內(nèi)環(huán)境，經(jīng)過長期傳代培養(yǎng)，消除了體內(nèi)細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用，不能完整模擬卵巢癌的生物學(xué)行為和自然生長過程，也會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞、生物學(xué)特性和遺傳學(xué)特征的改變，由其來源的小鼠腫瘤模型的自然病程和病理類型及腫瘤表型自然不能完全代表臨床患者，進(jìn)而影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和結(jié)論的可靠性，以及用于評估臨床療效與安全的權(quán)威性。國內(nèi)外也有把患者癌組織直接接種到裸鼠皮下或腹腔內(nèi)并形成腫瘤模型的報(bào)道。皮下接種的腫瘤雖然容易觀測，但未發(fā)現(xiàn)有其他部位的轉(zhuǎn)移灶，尤其是腹腔(廣泛腹腔播散是晚期卵巢癌臨床特點(diǎn)之一)，其應(yīng)用價值受到限制。已報(bào)道的腫瘤腹腔內(nèi)接種模型，雖然有腹腔內(nèi)的癌灶擴(kuò)散，但其卵巢本身并沒有發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移灶，也有一定局限。因此，當(dāng)前本領(lǐng)域急需一種能克服現(xiàn)有技術(shù)缺點(diǎn)的建立一種能真正重現(xiàn)臨床腫瘤發(fā)生發(fā)展的人卵巢癌的動物模型的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供人卵巢癌的動物模型建立方法。本發(fā)明提供了建立人卵巢癌動物模型用組織的處理方法，包括如下步驟I)人卵巢癌細(xì)胞凍存患者腹水置于無菌離心管中，300g離心5min，用凍存液重懸，_80°C保存24h后轉(zhuǎn)入液氮中長期保存；2)人卵巢癌凍存細(xì)胞復(fù)蘇取凍存的腫瘤細(xì)胞在37°C水浴中解凍，解凍時間(30s，用高糖DMEM培養(yǎng)基(糖含量為4. 5g/L)洗滌細(xì)胞I次，300g離心5min，PBS (磷酸鹽緩沖液)重懸并調(diào)整細(xì)胞濃度至f2X IOVmL ；前述所有操作均在無菌條件完成。其中，所述的凍存液為含8%v/v DMSO (二甲基亞砜)的胎牛血清。進(jìn)一步的，步驟2)中PBS重懸并調(diào)整細(xì)胞濃度至107/mL。在操作開始前，患者腹水應(yīng)置于冰上。
本發(fā)明提供了建立人卵巢癌動物模型的方法，包括如下步驟在無菌條件下，將經(jīng)前述方法處理后的組織材料接種至小鼠腹部；接種后第30周開始傳代，第2代傳代時間為92 98天，第3代后生長周期逐漸縮短并穩(wěn)定，第3飛代傳代時間為36 42天。其中，上述方法中的接種采用注射器，行腹腔注射完成。本發(fā)明的建立人卵巢癌動物模型用組織的處理方法也可以用于在模型建立后傳代后腫瘤組織的處理。本發(fā)明所使用的小鼠為N0D/SCID小鼠，鼠齡4周，體重15 20克，雌性，飼養(yǎng)在四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF (無特定病原體)屏障系統(tǒng)內(nèi)，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明方法通過將組織材料進(jìn)行處理后再建立人卵巢癌動物模型，克服了目前人卵巢癌動物模型的種種問題，尤其是卵巢未見癌灶的難題。建立起了能穩(wěn)定傳代的人卵巢癌N0D/SCID小鼠動物模型，傳代時間穩(wěn)定，且每代的一次接種成功率達(dá)100%，鑒定結(jié)果迅速準(zhǔn)確，遠(yuǎn)優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，使用本發(fā)明方法所建立的N0D/SCID鼠移植瘤模型再現(xiàn)了人卵巢癌的重要生物學(xué)特征，從病理組織學(xué)、免疫表型、分子生物學(xué)特征以及分子遺傳學(xué)等方面均與供體病例基本一致，生長周期穩(wěn)定。不僅解決了該腫瘤研究材料異質(zhì)性的問題，同時由于模擬了該腫瘤在人體內(nèi)生長情況，對該腫瘤發(fā)病的分子機(jī)制、腫瘤的演進(jìn)的研究、治療手段的探索、治療藥物的篩選及評價都有重要的實(shí)用價值，具有很好的應(yīng)用前
旦
ο


圖f 5為人卵巢癌腹水瘤模型形態(tài)學(xué)觀察圖1、右側(cè)為荷瘤鼠，可見腹部明顯脹大，左邊為正常鼠圖2、腹腔內(nèi)充滿淡黃色腹水圖3、橫膈及肝表面有轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)圖4、腸系膜表面有轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)圖5、腹膜上有轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)圖6、荷瘤鼠生殖系統(tǒng)-子宮，輸卵管，卵巢(右側(cè))與正常小鼠(左側(cè))比較圖7、為人卵巢癌動物模型卵巢轉(zhuǎn)移。箭頭所示可見卵巢里腫瘤組織占位明顯，失去正常形態(tài)組織結(jié)構(gòu)圖8、為人卵巢癌動物模型腹水細(xì)胞學(xué)涂片HE染色(蘇木精-伊紅染色)?？梢娂?xì)胞多數(shù)聚集成團(tuán)，核深染，核質(zhì)比增大圖9、為人卵巢癌動物模型核型分析。可見人類腫瘤染色體特征(小鼠核型以端著絲粒為主，二者差異明顯)圖10、為人卵巢癌腹水瘤模型免疫細(xì)胞化學(xué)檢測，EMA可見胞漿陽性。圖11、為人卵巢癌腹水瘤模型免疫細(xì)胞化學(xué)檢測，Pan-cytokeatin可見胞漿陽性。圖12、為人卵巢癌腹水瘤模型免疫細(xì)胞化學(xué)檢測，PCNA可見胞核陽性細(xì)胞較多，說明細(xì)胞繁殖速度較快
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1接種人卵巢癌細(xì)胞1、人卵巢癌腹水樣本的采集和鑒定收集四川大學(xué)華西第二醫(yī)院手術(shù)中人卵巢低分化乳頭狀漿液性腺癌一例。經(jīng)病理形態(tài)學(xué)檢查、免疫表型檢測，確診為臨床上常見的人卵巢低分化乳頭狀漿液性腺癌IIIC期。2、實(shí)驗(yàn)動物
N0D/SCID小鼠，鼠齡4周，體重15_20克，雌性，飼養(yǎng)在四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF屏障系統(tǒng)內(nèi)，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。3、腫瘤組織移植所有操作均在無菌條件完成。人卵巢癌細(xì)胞凍存患者腹水(在操作開始前，患者腹水應(yīng)置于冰上。)置于無菌離心管中，300g離心5min，用凍存液(含8%v/v DMSO的胎牛血清)重懸，_80°C保存24h后轉(zhuǎn)入液氣中保存；人卵巢癌凍存細(xì)胞復(fù)蘇取凍存的腫瘤細(xì)胞在37°C水浴中解凍30秒鐘內(nèi)，用高糖DMEM培養(yǎng)基(4. 5g/L)洗滌細(xì)胞I次，300g離心5min，PBS重懸并調(diào)整細(xì)胞濃度至107/mL ；酒精棉球消毒小鼠腹部皮膚，吸取細(xì)胞懸液于小鼠左下腹進(jìn)針皮下穿行約O. 4cm后進(jìn)入腹腔，回抽無液體后將懸液注入。每個樣本接種2只小鼠。所有操作在I小時內(nèi)完成，注意全程無菌操作。4、移植瘤觀察及鼠間傳代接種后逐日觀察鼠全身情況，移植部位有無感染，移植部位皮膚有無潰破等。當(dāng)見小鼠腹圍明顯變大時行鼠間傳代1)75%酒精消毒小鼠腹部皮膚后，用ImL注射器左下腹進(jìn)針。皮下穿行約O. 4cm后進(jìn)入腹腔，回抽吸取腹水(即腹腔穿刺術(shù))，直接進(jìn)行鼠間傳代，一只小鼠可傳Γ5只(視需要而定)。2)酒精棉球消毒擬傳代小鼠腹部皮膚，吸取細(xì)胞懸液于小鼠左下腹進(jìn)針。皮下穿行約O. 4cm后進(jìn)入腹腔，回抽無液體后將腹水注入。觀察該傳代荷瘤鼠全身情況，移植部位有無感染，移植部位皮膚有無潰破等。全程無菌操作。其它模型傳代方法是將小鼠處死之后，再取癌組織，進(jìn)行傳代。本模型與其它模型相比，其優(yōu)點(diǎn)在于原代鼠傳代時，不必處死，可繼續(xù)觀察，反復(fù)傳代，反復(fù)抽取腹水供研究用(一般可反復(fù)抽取3飛次/只)。5、移植瘤觀察及鼠間傳代原代移植瘤潛伏期長達(dá)26周，26周后腫瘤開始生長，第30周傳代。第2代傳代時間為92 98天，第3代后生長周期逐漸縮短并穩(wěn)定，第3飛代傳代時間為36 42天，現(xiàn)移植瘤已穩(wěn)定傳至第6代。6、接種結(jié)果一次接種成功率第6代接種5只，成功率100%。
注全程無菌操作。實(shí)施例二人卵巢癌凍存細(xì)胞復(fù)蘇傳代實(shí)驗(yàn)1、細(xì)胞凍存I)小鼠腹圍明顯變大后，同模型傳代步驟獲取腹水2) 75%酒精消毒小鼠腹部皮膚后，用ImL注射器左下腹進(jìn)針。皮下穿行約0. 4cm后進(jìn)入腹腔，回抽吸取腹水(即腹腔穿刺術(shù))，轉(zhuǎn)入15mL無菌離心管中3)300g 5min離心，用凍存液(含8%DMS0的胎牛血清)重懸，1mL分裝入凍存管(大約20管/只，細(xì)胞數(shù)約為107/管)4)放入程序降溫盒，在-80°C低溫冰箱中保存24小時后轉(zhuǎn)入液氮中保存2、細(xì)胞復(fù)蘇I)取動物模型的第I代、2代的凍存腫瘤細(xì)胞2)分別將上述凍存細(xì)胞在37°C水浴中迅速解凍(30秒鐘內(nèi))3)在超凈工作臺內(nèi)用高糖DMEM培養(yǎng)基(4. 5g/L)洗滌細(xì)胞I次，300g離心5min。4)PBS重懸并調(diào)整細(xì)胞濃度至107/ml，取0. 5ml接種于鼠齡為4周的健康N0D/SCID鼠腹腔內(nèi)。注意要在30分鐘內(nèi)完成傳代操作。復(fù)蘇N0D/SCID鼠移植瘤與原來源腫瘤生長周期及荷瘤情況相似。實(shí)施例三人卵巢癌動物模型的鑒定(一)鑒定實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目1、動物模型移植瘤種屬鑒定腹水細(xì)胞經(jīng)含02ug/mL秋水仙素的10% FBS (胎牛血清)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)2小時后收獲染色體并行G顯帶分析。2、病理形態(tài)學(xué)觀察及免疫表型檢測免疫組織化學(xué)染色采用SABC法(Strept Avidin-Biotin Complex,鏈酶親和素一生物素一過氧化物酶復(fù)合物)。所用第一抗體名稱、克隆號、來源及特異性見表I。EMA為上皮膜抗原，各種上皮細(xì)胞及其來源的腫瘤表達(dá)該蛋白；Pan Cytokeratin為廣譜細(xì)胞角蛋白，PCNA為增殖細(xì)胞核抗原。表I免疫表型檢測所用抗體及其特異性
權(quán)利要求
1.建立人卵巢癌動物模型用組織的處理方法，其特征在于包括如下步驟O人卵巢癌細(xì)胞凍存患者腹水置于無菌離心管中，300g離心5min，用凍存液重懸，_80°C保存24h后轉(zhuǎn)入液氮中長期保存；2)人卵巢癌凍存細(xì)胞復(fù)蘇取凍存的腫瘤細(xì)胞在37°C解凍，解凍時間< 30s，用高糖 DMEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞I次，300g離心5min，PBS重懸并調(diào)整細(xì)胞濃度至f 2 X 107/mL ;其中， 高糖DMEM培養(yǎng)基的含糖量為4. 5g/L ；前述所有操作均在無菌條件完成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立人卵巢癌動物模型用組織材料的處理方法，其特征在于所述的凍存液為含8%v/v DMSO的胎牛血清。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的建立人卵巢癌動物模型用組織材料的處理方法，其特征在于步驟2)中PBS重懸并調(diào)整細(xì)胞濃度至107/mL。
4.建立人卵巢癌動物模型的方法，其特征在于包括如下步驟在無菌條件下，將經(jīng)權(quán)利要求廣3任一項(xiàng)方法處理后的組織材料接種至小鼠腹部；接種后第30周開始傳代，第2 代傳代時間為92、8天，第3代后生長周期逐漸縮短并穩(wěn)定，第:Γ6代傳代時間為36 42天。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及建立人卵巢癌動物模型的方法。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供建立人卵巢癌動物模型用組織的處理方法及模型建立方法。本發(fā)明提供了建立人卵巢癌動物模型用組織的處理方法，包括如下步驟1)人卵巢癌細(xì)胞凍存；2)人卵巢癌凍存細(xì)胞復(fù)蘇。本發(fā)明還提供了建立人卵巢癌動物模型的方法。本發(fā)明方法可用于建立人卵巢癌動物模型，并解決卵巢未見癌灶的難題。
文檔編號A01K67/027GK103013923SQ201210590909
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月29日
發(fā)明者張建軍, 劉珊玲, 謝曉硯, 陳新蓮, 王和 申請人:四川大學(xué)華西第二醫(yī)院