一種人轉鐵蛋白乳腺特異性表達載體的構建及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用轉基因動物的乳腺生產(chǎn)人轉鐵蛋白的方法及其表達載體。本發(fā)明的方法包括利用含有人轉鐵蛋白基因表達盒的載體將人轉鐵蛋白基因表達盒轉入哺乳動物基因組中獲得轉基因動物，從轉基因動物乳汁中獲得人轉鐵蛋白，其中，該表達盒從5’到3’依次包括啟動子、人轉鐵蛋白基因和牛生長激素基因終止子，所述啟動子是山羊β-酪蛋白基因，其序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述人轉鐵蛋白基因是序列表中SEQ?ID?NO.2所示，所述的載體是真核表達載體pcDNA3.1，所述的哺乳動物不包括人。本發(fā)明的方法，在動物的乳汁中人轉鐵蛋白的濃度至少可達到5g/L，比現(xiàn)有的方法提高了160倍以上，具有巨大的商業(yè)利用價值。
【專利說明】一種人轉鐵蛋白乳腺特異性表達載體的構建及應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術領域】，特別涉及一種人轉鐵蛋白乳腺特異性表達載體的構建及應用。
【背景技術】
[0002]人轉鐵蛋白(Human transferrin, hTF)是一種非血紅素的鐵結合糖蛋白，能使得鐵離子與之緊密結合，并將其有選擇地釋放到特定部位與靶細胞上的特異受體結合以行使生理功能[1]，是先天性無轉鐵蛋白血癥等多種疾病治療必備的藥物，同時它還參與呼吸、細胞增殖和免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)[2]。最近幾年的研究發(fā)現(xiàn)轉鐵蛋白還是胚胎干細胞和神經(jīng)干細胞生長非常重要的一種調(diào)節(jié)因子。
[0003]目前人轉鐵蛋白主要從血漿中提取并純化，不僅步驟繁瑣、效率低下，而且原料容易受HIV、HBV等病毒的感染，給制備和使用帶來潛在的風險。轉基因動物乳腺生物反應器是近些年發(fā)展起來的一項生物制藥新方法，具有廣泛的應用前景。2006年，美國GTC生物制藥公司通過轉基因動物乳汁生產(chǎn)的重組藥物人抗凝血酶III已率先上市，另外尚有多種重組藥物蛋白正處于各期臨床試驗中。因此采用轉基因動物乳腺生物反應器來生產(chǎn)諸如人轉鐵蛋白這樣重要的生物蛋白具有很好市場價值。
[0004]經(jīng)過二十余年的研究，人們已經(jīng)在轉基因動物乳腺生物反應器研制方面積累了一定的經(jīng)驗。研究發(fā)現(xiàn)乳蛋白(即可在乳汁中表達的蛋白)在轉基因動物乳汁中的表達水平明顯高于非乳蛋白，而這些蛋白由于用量較大，只有當其表達水平超過lg/L時，該轉基因動物才有商業(yè)利用價值。
[0005]但是，到目前為止，根據(jù)已有文獻報道尚無可在哺乳動物乳汁中高效表達人轉鐵蛋白的載體，有文獻通過兔轉鐵蛋白基因啟動子和增強子指導人轉鐵蛋白，獲得的轉基因小鼠乳汁中hTF表達水平亦不超過0.7g/L，尚無法滿足乳腺生物反應器的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術問題是針對現(xiàn)有的利用轉基因動物的乳腺生產(chǎn)人轉鐵蛋白的方法中人轉鐵蛋白的表達水平低下的不足，提供一種人轉鐵蛋白的表達水平達5g/L以上的動物乳腺生產(chǎn)人轉鐵蛋白的方法以及其中所用到的表達載體。
[0007]為此，本發(fā)明解決上述問題的技術方案之一是:一種利用轉基因動物的乳腺組織生產(chǎn)人轉鐵蛋白的方法，包括利用含有人轉鐵蛋白基因表達盒的載體將人轉鐵蛋白基因表達盒轉入哺乳動物基因組中獲得轉基因動物，使該轉基因動物分泌乳汁，從乳汁中獲得人轉鐵蛋白，其中，所述的人轉鐵蛋白基因表達盒從5’到3’依次包括啟動子、人轉鐵蛋白基因和終止子，其中所述的啟動子是山羊β-酪蛋白基因啟動子，其長度為6.5Kb，序列如SEQID N0.1所示，其中包括啟動子近端成分、遠端長達4Kb的上游調(diào)控區(qū)和山羊β_酪蛋白第一內(nèi)含子，第一外顯子和第二外顯子。
[0008]本發(fā)明中，所述的人轉鐵蛋白基因如常規(guī)，較佳的是人轉鐵蛋白的編碼序列，更佳的是序列表中SEQ ID N0.2所示。
[0009]本發(fā)明中，所述的終止子是本領域常規(guī)。本發(fā)明中較佳的是牛生長激素基因的終止子,更佳的其序列如SEQ ID N0.3所示。
[0010]本發(fā)明中，所述的含有人轉鐵蛋白基因表達盒的載體可以是本領域的各種能夠轉染哺乳動物細胞的表達載體，比如慢病毒載體、腺病毒載體等，較佳的是常規(guī)的真核表達載體，優(yōu)選質(zhì)粒pcDNA3.1。
[0011]本發(fā)明中，所述將人轉鐵蛋白基因表達盒轉入哺乳動物基因組中獲得轉基因動物的方法是常規(guī)，較佳的包括將真核表達載體原核顯微注射入哺乳動物的受精卵中，然后移植入假受孕動物中，從而得到轉基因動物；或者是慢病毒載體顯微注射哺乳動物受精卵的卵周隙，將感染的受精卵移植入假受孕動物中，從而得到轉基因動物。
[0012]本發(fā)明中所述的哺乳動物是常規(guī)，較佳的是小鼠或奶牛，不包括人。
[0013]本發(fā)明的技術方案之二是:一種用于制備轉基因哺乳動物使其乳腺組織高表達人轉鐵蛋白的載體，其含有人轉鐵蛋白基因表達盒，其中，所述的人轉鐵蛋白基因表達盒從5’到3’依次包括啟動子、人轉鐵蛋白基因和終止子，其中所述的啟動子是山羊β_酪蛋白基因啟動子，其長度為6.5Kb，序列如SEQID N0.1所示，其中包括啟動子近端成分、遠端長達4Kb的上游調(diào)控區(qū)和山羊酪蛋白第一內(nèi)含子，第一外顯子和第二外顯子。
[0014]該人轉鐵蛋白基因表達盒的其它優(yōu)選方式如上所述。
[0015]在符合本領域常識的基礎上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實例。
[0016]本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0017]本發(fā)明的積極進步效果在于:本發(fā)明中采用的山羊β_酪蛋白基因啟動子序列同時保留了啟動子近端成分、遠端長達4Kb的上游調(diào)控區(qū)和β-酪蛋白第一內(nèi)含子，第一外顯子和第二外顯子。這些區(qū)域含有GRE、STAT等結合位點，這類結合位點是決定乳蛋白表達水平的重要因子。本發(fā)明通過調(diào)整酪蛋白基因啟動子中的不同元件，使人轉鐵蛋白基因(hTF基因)在轉基因小鼠中獲得了理想的表達水平，平均表達水平達到了 5g/L以上，所述基因的蛋白表達水平提高了至少160倍。
[0018]乳腺生物反應器產(chǎn)業(yè)的特點是成本固定化，即在原料一致的情況下其成本是不變的。所以當提高了乳汁中的蛋白表達量時，提高量獲得的將會是藥品的凈利潤。所以業(yè)界一般認為只要有50%的蛋白提高，利潤就能翻倍。本發(fā)明使乳汁中人轉鐵蛋白的表達水平提高了 160倍以上，則利潤提高 至少160倍。這是極其高的利潤，具有廣闊的商業(yè)前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為pcDNA3.1-P1A3-TFN表達載體構建線路圖。
[0020]圖2為4種不同人轉鐵蛋白(hTF)表達載體不意圖。
[0021]圖3為不同載體在乳腺細胞中表達人轉鐵蛋白的比較。
[0022]圖4為不同轉基因小鼠乳汁中人轉鐵蛋白的表達水平比較。
[0023]圖5為不同類型人血小板生成素轉基因小鼠乳汁中外源蛋白表達水平對比圖。
【具體實施方式】[0024]下面通過實施例的方式進一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。
[0025]實施例1
[0026]1、載體構建
[0027]pcDNA3.1-TFN (pcDNA3.1為購自invitrogen公司的商業(yè)化真核表達載體，貨號為V795-20)。TFN為克隆的人TF小基因，包括了 hTFcDNA和內(nèi)含子I，全長約4.1Kb，序列見后)。
[0028]pcDNA3.1-TFN的構建過程如下:
[0029]采用長片段PCR擴增山羊基因組DNA，PCR引物序列分別為:5，-AAGCAGGAATCACAGCATCTAC-3，；5，-AGGATCCTTCATGGCTCTC GAT-3，。采用 Apa I+Xho I雙酶切通過PCR方法克隆得到的人TF小基因TFN，而pcDNA3.1載體同樣采用Apa I+Xho I進行酶切。隨后采用連接酶進行連接反應，即得到pcDNA3.1-TFN載體。
[0030]pcDNA3.1-P1A3 (P1A3為克隆的山羊β酪蛋白基因啟動子，參考文獻可見“山羊β-酪蛋白基因啟動子指導的轉基因小鼠乳汁高效表達人凝血因子IX”，序列見后)。
[0031]pcDNA3.1-Ρ1Α3的構建過程如下:
[0032]采用長片段PCR擴增山羊基因組DNA，PCR引物序列分別為:5’ -AAGCAGGAATCACAGCATCTAC-3’ ；5’ -AGGATCCTTCATGGCTCTCGAT-3’，得到的山羊 β -酪蛋白基因啟動子(命名為Ρ1Α3)，用Apa I和BamH I進行酶切，而pcDNA3.1載體同樣采用這兩種酶進行酶切。隨后采用連接酶進行連接反應，并將連接產(chǎn)物進行感受態(tài)細胞轉化、挑取陽性克隆，即得到pcDNA3.1-P1A3載體。
[0033]限制性內(nèi)切酶、T4DNA聚合酶和堿性磷酸酶的反應體系均為:
【權利要求】
1.一種利用轉基因動物的乳腺組織生產(chǎn)人轉鐵蛋白的方法，包括利用含有人轉鐵蛋白基因表達盒的載體將人轉鐵蛋白基因表達盒轉入哺乳動物基因組中獲得轉基因動物，使該轉基因動物分泌乳汁，從乳汁中獲得人轉鐵蛋白，其特征在于，所述的人轉鐵蛋白基因表達盒從5’到3’依次包括啟動子、人轉鐵蛋白基因和PCDNA3.1載體中攜帶的牛生長激素基因終止子，其中所述的啟動子是山羊酪蛋白基因啟動子，其長度為6.5Kb，序列如SEQIDN0.1所示，其中包括啟動子近端成分、遠端長達4Kb的上游調(diào)控區(qū)和山羊β-酪蛋白第一內(nèi)含子，第一外顯子和第二外顯子，所述的人轉鐵蛋白基因是序列表中SEQ ID Ν0.2所示，所述的終止子的序列為牛生長激素基因終止子，所述的含有人轉鐵蛋白基因表達盒的載體是真核表達載體pcDNA3.1，所述的哺乳動物不包括人。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述將人轉鐵蛋白基因表達盒轉入哺乳動物基因組中獲得轉基因動物的方法包括將真核表達載體原核顯微注射入哺乳動物的受精卵中，然后移植入假受孕動物中，從而得到轉基因動物。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的哺乳動物是小鼠或奶牛。
4.一種用于制備轉基因哺乳動物使其乳腺組織高表達人轉鐵蛋白的載體，其含有人轉鐵蛋白基因表達盒，其特征在于，所述的人轉鐵蛋白基因表達盒從5’到3’依次包括啟動子、人轉鐵蛋白基因和終止子，其中所述的啟動子是山羊β_酪蛋白基因啟動子，其長度為.6.5Kb，序列如SEQ ID N0.1所示，其中包括啟動子近端成分、遠端長達4Kb的上游調(diào)控區(qū)和山羊酪蛋白第一內(nèi)含子，第一外顯子和第二外顯子，所述的人轉鐵蛋白基因是序列表中SEQID N0.2，所述的終止子為牛生長激素基因終止子，所述的含有人轉鐵蛋白基因表達盒的載體是真核表達載體pcDNA3.1。
【文檔編號】A01K67/027GK103911393SQ201210594330
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2012年12月31日 優(yōu)先權日:2012年12月31日
【發(fā)明者】曾凡一, 顏景斌, 曾溢滔 申請人:上海滔滔轉基因工程股份有限公司, 上海市兒童醫(yī)院