rd29啟動子或其片段用于棉花中轉(zhuǎn)基因的脅迫誘導(dǎo)型表達的用途
【專利摘要】在一個方面，本申請披露了一種嵌合基因，該嵌合基因包含（a）一個第一核酸序列，該第一核酸序列包含SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:2的至少400個連續(xù)核苷酸或與其具有至少80%序列一致性的一個核酸序列，這些序列中的任一項賦予所述嵌合基因脅迫誘導(dǎo)性；（b）一個第二核酸序列，該第二核酸序列編碼一種感興趣的表達產(chǎn)物，該感興趣的表達產(chǎn)物參與棉花植株對脅迫的響應(yīng)；以及任選地（c）一個轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列。在另一方面，本申請披露了一種棉花植株細胞，該棉花植株細胞包含（a）一種嵌合基因，該嵌合基因包含一個第一核酸序列，該第一核酸序列包含SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:2的至少400個連續(xù)核苷酸或與其具有至少80序列一致性的一個核酸序列，這些序列中的任一項賦予所述嵌合基因脅迫誘導(dǎo)性；（b）一個第二核酸序列，該第二核酸序列編碼一種感興趣的表達產(chǎn)物；以及任選地（c）一個轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列。另外，本申請披露了如在權(quán)利要求書中所表征的一種棉花植株、一種在脅迫條件下在棉花中表達轉(zhuǎn)基因的方法、一種產(chǎn)生棉花植株的方法、一種檢測轉(zhuǎn)基因在脅迫條件下的表達的方法以及一種調(diào)節(jié)棉花植株對脅迫的抗性的方法。
【專利說明】rd29啟動子或其片段用于棉花中轉(zhuǎn)基因的脅迫誘導(dǎo)型表達的用途
[0001]在一個方面，本申請披露了一種嵌合基因，該嵌合基因包含(a) —個第一核酸序列，該第一核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的至少400個連續(xù)核苷酸或與其具有至少80%序列一致性的一個核酸序列，這些序列中的任一項賦予所述嵌合基因脅迫誘導(dǎo)性；(b) —個第二核酸序列，該第二核酸序列編碼一種感興趣的表達產(chǎn)物，該感興趣的表達產(chǎn)物參與棉花植株對脅迫的響應(yīng)；以及任選地(c) 一個轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列。在另一方面，本申請披露了一種棉花植株細胞，該棉花植株細胞包含(a) —種嵌合基因，該嵌合基因包含一個第一核酸序列，該第一核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的至少400個連續(xù)核苷酸或與其具有至少80%序列一致性的一個核酸序列，這些序列中的任一項賦予所述嵌合基因脅迫誘導(dǎo)性；(b) —個第二核酸序列，該第二核酸序列編碼一種感興趣的表達產(chǎn)物；以及任選地(c)一個轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列。另外，本申請披露了如在權(quán)利要求書中所表征的一種棉花植株、一種在脅迫條件下在棉花中表達轉(zhuǎn)基因的方法、一種產(chǎn)生棉花植株的方法、一種檢測轉(zhuǎn)基因在脅迫條件下的表達的方法以及一種調(diào)節(jié)棉花植株對脅迫的抗性的方法。
[0002]在本說明書中，引用了包括專利申請和制造商手冊的多種文獻。這些文獻的披露雖然不被視為與本發(fā)明的專利性相關(guān)但通過引用以其全文結(jié)合在此。更確切地說，所有參考的文獻均在相同程度上通過引用結(jié)合，就如同每一單獨文獻特別地并且獨立地被指示通過引用結(jié)合一樣。
[0003]近年來，全球變暖的現(xiàn)象和它對作物生產(chǎn)的影響已變成一個至關(guān)緊要的問題。在植物科學(xué)水平上解決這個問題幾乎完全是一個處理植物脅迫的問題。國際農(nóng)業(yè)和環(huán)境研究機構(gòu)現(xiàn)在再次發(fā)現(xiàn)植物脅迫是全球變暖對地區(qū)和全球糧食生產(chǎn)的影響的一個主要組成部分。應(yīng)對這些挑戰(zhàn)的研究涉及在廣泛發(fā)散的學(xué)科的學(xué)習(xí)，這些學(xué)科如大氣科學(xué)、土壤科學(xué)、植物生理學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)、植物育種、分子生物學(xué)以及農(nóng)業(yè)工程。
`[0004]非生物植物環(huán)境脅迫構(gòu)成了對作物生產(chǎn)的一個主要限制。在世界范圍內(nèi)具有當代經(jīng)濟重要性的主要植物環(huán)境脅迫是包括干旱和洪水的水分脅迫、冷(低溫和冷凍)、熱、鹽度、潰水、土壤礦物質(zhì)缺乏、土壤礦物質(zhì)毒性以及氧化脅迫。這些因素不是孤立的，而是相關(guān)的并且彼此影響。
[0005]脫落酸(ABA)是一種植物激素，它在許多植物發(fā)育過程(包括芽休眠)中起作用。此外，ABA介導(dǎo)植物中對水分脅迫、高鹽脅迫、冷脅迫(曼斯菲爾德(Mansfield) 1987、Yamaguch1-Shinozaki 1993、Yamaguch1-Shinozaki 1994)以及植物病原體(勢雄(Seo)和小柴(Koshiba)，2002)的反應(yīng)的脅迫響應(yīng)。ABA是一種倍半萜(15-碳)，它部分地通過甲羥戊酸途徑產(chǎn)生于葉綠體和其他質(zhì)體中。它部分地合成于葉綠體中，并且因此,生物合成主要發(fā)生于葉子中。ABA的產(chǎn)生因脅迫(如水分流失和冷凍溫度)而增加。相信生物合成間接地通過產(chǎn)生類胡蘿卜素而發(fā)生。
[0006]已知與脫落酸有關(guān)的生理響應(yīng)包括了刺激氣孔閉合、抑制莖生長、誘導(dǎo)種子中的儲存蛋白合成以及抑制赤霉素對刺激α-淀粉酶從頭合成的作用。[0007]不同植物之間的基礎(chǔ)ABA水平可能顯著不同。舉例來說，未受脅迫的擬南芥葉子中的ABA的基礎(chǔ)濃度是每克鮮重2到3ng (洛佩茲-卡博內(nèi)爾(Lopez-Carbonell)和郝勒吉(Jdiuregui), 2005)。在水分脅迫條件下，ABA濃度達到每克鮮重10到21ng。另一方面，在未受脅迫的棉花中，葉子中的ABA濃度在每克鮮重145到2490ng之間變化(?？松?Ackerson), 1982)。
[0008]參與響應(yīng)于非生物脅迫的基因以及介導(dǎo)脅迫響應(yīng)的啟動子在本領(lǐng)域中已有描述。
[0009]早在1994年,Yamaguch1-Shinozaki和Shinozaki已描述并且分析了調(diào)節(jié)擬南芥中的rd29a基因的一種啟動子，這種啟動子響應(yīng)于脫水、低溫、高鹽或用外源性脫落酸處理而被誘導(dǎo)。
[0010]當今農(nóng)業(yè)實踐和研究中的一項主要挑戰(zhàn)是如何以經(jīng)濟并且環(huán)境可持續(xù)的方法處理植物環(huán)境脅迫。鑒于世界上已經(jīng)存在的暴露于非生物脅迫條件的地區(qū)和正在進行的氣候變化，提供賦予對至少一個種類非生物脅迫抗性的轉(zhuǎn)基因植株仍是一個主要目標，以便在世界上暴露于這類非生物脅迫的地區(qū)中也實現(xiàn)令人滿意的營養(yǎng)狀況。
[0011]因此，在一個實例中，本申請披露了一種嵌合基因，該嵌合基因包含(a) —個第一核酸序列，該第一核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的至少400個連續(xù)核苷酸或與其具有至少80%序列一致性的一個核酸序列，這些序列中的任一項賦予所述嵌合基因脅迫誘導(dǎo)性；(b) —個第二核酸序列，該第二核酸序列編碼一種感興趣的表達產(chǎn)物，該感興趣的表達產(chǎn)物參與棉花植株對脅迫的響應(yīng)；以及任選地(c) 一個轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列。
[0012]除非另外指明，否則下文針對在此所披露的嵌合基因所描述的實施例也適用于在此所披露的其他方面的對應(yīng)實施例。
[0013]如在此所用的術(shù)語“包含”應(yīng)解釋為規(guī)定所陳述的特征、完整的事物、步驟或組分的存在是指但并不排除存在或增加一種或多種特征、完整的事物、步驟或組分或其群組。因此，例如包含一個核苷酸或氨基酸序列的一種核酸或蛋白質(zhì)可以包含比實際引用的序列更多的核苷酸或氨基酸，即，被包埋在一個更大的核酸或蛋白質(zhì)中。包含在功能上或結(jié)構(gòu)上被定義的一個DNA區(qū)的一種嵌合基因可以包含額外的DNA區(qū)等。然而，在本披露的情形下，術(shù)語“包含”也包括“由……組成”。
[0014]一種嵌合基因是一種人造基因，它由不相關(guān)的基因或其他核酸序列的可操作連接的片段構(gòu)筑。換句話說，“嵌合基因”表示并非正常見于植物物種中的一種基因或指代基因的啟動子或一個或多個其他調(diào)節(jié)區(qū)與所轉(zhuǎn)錄的核酸的一部分或全部在自然界中并不相關(guān)(即，相對于所轉(zhuǎn)錄的核酸為異源的)的任何基因。更具體地說，一種嵌合基因是一種人造(即，非天然存在的)基因，這種基因通過以下方式產(chǎn)生:將包含SEQ ID N0:1或SEQ ID NO:2的至少400個連續(xù)核苷酸的第一核酸序列或與其具有至少80%序列一致性的一個核酸序列(這些序列中的任一項賦予所述嵌合基因脅迫誘導(dǎo)性)與并非天然地可操作地連接于所述核酸序列的編碼一種感興趣的表達產(chǎn)物的一個第二核酸序列可操作地連接。天然地可操作地連接于所述第一核酸序列的這一核酸序列是rd29A基因的編碼序列。
[0015]術(shù)語“異源”是指來源于不同來源的兩種或更多種核酸或蛋白質(zhì)序列之間的關(guān)系。舉例來說，一個啟動子相對于一個可操作地連接的核酸序列(如一個編碼序列)在這種組合并非正常見于自然界中時是異源的。另外，一個特定序列相對于它插入的細胞或有機體可以是“異源”的(即，在那個特定細胞或有機體中并非天然存在)。舉例來說，在此所披露的嵌合基因是一種異源核酸。
[0016]核酸可以是單鏈或雙鏈的DNA或RNA。核酸可以是化學(xué)合成的或通過體外或甚至體內(nèi)生物表達產(chǎn)生。
[0017]核酸可以使用受適當保護的核糖核苷亞磷酰胺和一臺常規(guī)的DNA/RNA合成器以化學(xué)方式合成。RNA合成試劑的供應(yīng)商是普羅利高公司(Pix)Iig0 ;德國漢堡(Hamburg, Germany))、達爾馬康研究公司(Dharmacon Research ;美國科羅拉多州拉斐特(Lafayette, CO, USA))、皮爾斯化學(xué)品公司(Pierce Chemical ；美國伊利諾伊州羅克福德的佩爾生物科學(xué)公司成員(part of Perbio Science, Rockford, IL, USA))、哥倫研究公司(Glen Research ;美國弗吉尼亞州斯特林(Sterling, VA, USA))、凱姆基因公司(ChemGenes ;美國馬薩諸塞州亞什蘭(Ashland, MA, USA))以及克魯凱姆公司(Cruachem ;英國格拉斯哥(Glasgow, UK))。
[0018]與本披露的嵌合基因結(jié)合，DNA包括cDNA和基因組DNA。
[0019]所述第一核酸序列賦予在此所披露的嵌合基因脅迫誘導(dǎo)性。同樣地，所述第一核酸序列賦予在下文中進一步描述的編碼一種感興趣的表達產(chǎn)物的第二核酸序列的表達響應(yīng)于非生物脅迫條件的誘導(dǎo)性。換句話說，所述嵌合基因的表達在包含所述嵌合基因的一種植株暴露于脅迫時被誘導(dǎo)。在這點上，脅迫包括非生物脅迫，如水分脅迫、干旱脅迫、冷脅迫、高鹽脅迫以及施用ΑΒΑ。
[0020]選擇第一核酸序列的長度以及它在SEQ ID NO:1或SEQ ID Ν0:2內(nèi)的位置，使得它足夠長并且被定位以使得包含它的嵌合基因的表達在暴露于脅迫時被誘導(dǎo)。評估一個第一核酸序列(它在本申請中代表一個啟動子序列)在暴露于脅迫時是否能夠誘導(dǎo)將它包含在內(nèi)的嵌合基因(或具體地說，與它可操作地連接的核酸序列)的表達的方法是熟練的人員所已知的。舉例來說，可以執(zhí)行報告基因研究，以便評估所述第一核酸在脅迫條件下的誘導(dǎo)功能。這包括使所述第一核酸序列可操作地連接于一個報告基因(如GUS ( β -葡萄糖醛酸酶)或GFP (綠色熒光蛋白))，將所`得核酸構(gòu)建體或嵌合基因轉(zhuǎn)化到一種植株或植株細胞(在此情況下為一種棉花植株)中，并且評估在植株或植株細胞暴露于脅迫(如水分脅迫(如干旱脅迫)、冷脅迫、高鹽脅迫或暴露于ABA)時與不包含所述構(gòu)建體的一種植株或植株細胞相比所述報告基因的表達的誘導(dǎo)。
[0021]因此，在一些實例中，賦予脅迫誘導(dǎo)性的所述第一核酸序列可以包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的至少400、至少450、至少500、至少550、至少600、至少650、至少700、至少800或至少900個連續(xù)核苷酸。在另一個實例中，所述第一核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID Ν0:2的核苷酸序列。在又另一個實例中，所述第一核酸序列由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2 組成。
[0022]在一個方面，提供了能夠賦予一種嵌合基因脅迫誘導(dǎo)性的啟動子的核酸序列，具體地說包含與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2具有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%序列一致性的一個核苷酸序列的核酸序列。此類核酸序列還包括以人造方式獲得的核酸序列，如例如通過使用SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的定點誘變而產(chǎn)生的那些核酸序列?？傮w而言，在此所披露的核苷酸序列變異體可以與SEQ ID NO:1或SEQ ID Ν0:2的核酸序列具有至少70%、如72%、74%、76%、78%、至少80%、例如81%到84%、至少85%、例如86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97% 到 98% 以及 99% 序列一致性。序列一致性是基于更短核苷酸序列計算的。在此所披露的核酸序列也可以包括但不限于序列的缺失、單點或多點突變、在一個特定限制酶識別位點處的改變、功能元件的添加或者可以增強或以其他方式改變啟動子表達的分子修飾的其他手段，只要基本上保留脅迫誘導(dǎo)性即可。用于獲得此類衍生物的技術(shù)在本領(lǐng)域中是熟知的(參見例如J.F.薩布魯克(J.F.Sambrook),D.W.拉塞爾(D.W.Russell)以及N.厄溫(N.1rwin)，2000)。舉例來說，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以在披露在此的這些啟動子中對這些功能元件進行定界并且使任何非必要元件缺失。功能元件可以被修飾或組合以增加本發(fā)明的這些序列用于任何特定應(yīng)用的效用和表達。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員對于描述用于構(gòu)筑、操作以及分離大分子(例如DNA分子、質(zhì)粒等)以及重組有機體的產(chǎn)生以及DNA分子的篩選和分離的特定條件和程序的標準來源材料是熟悉的。
[0023]如上文所描述的具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的至少400個連續(xù)核苷酸的啟動子序列和它們的變異體可以例如被改變以包含例如“增強子DNA”，從而有助于提高基因表達。如本領(lǐng)域中所熟知的，某些DNA元件可以用于增強DNA的轉(zhuǎn)錄。這些增強子經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)于在真核細胞中起作用的一個啟動子的轉(zhuǎn)錄起始的5’處，但是經(jīng)?？梢员徊迦刖幋a序列的上游(5’)或下游(3’)。在一些實例中，這些增強子DNA元件是內(nèi)含子。在這些內(nèi)含子中，作為增強子DNA有用的是來自水稻肌動蛋白I基因的5’內(nèi)含子(參見US5641876)、水稻肌動蛋白2基因、擬南芥組蛋白4內(nèi)含子、玉米乙醇脫氫酶基因、玉米熱激蛋白70基因(參見US5593874)、玉米皺縮I基因、馬鈴薯(Solanum tuberosum)的光敏I基因以及矮牽牛(Petunia hybrida)的熱激蛋白70基因(參見US5659122)。因此，如在此所涵蓋，一個啟動子或啟動子區(qū)包括通過插入或缺失調(diào)節(jié)區(qū)、使啟動子經(jīng)受隨機或定點誘變等而獲得的啟動子的變異體。一個啟動子的活性或強度可以根據(jù)它產(chǎn)生的RNA的量或一種細胞或組織中蛋白質(zhì)累積的量相對于已預(yù)先評估轉(zhuǎn)錄活性的如上文所描述的一個啟動子來測量。
[0024]如在此所用的術(shù)語“序列一致性百分比”是指經(jīng)最佳比對的DNA的一個窗口的兩個區(qū)段之間的一致的核苷酸的百分比。用于比對一個比較窗口的序列的最佳比對為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知，并且可以通過如史密斯(Smith)和沃特曼(Waterman)的局部同源算法(沃特曼M.S.,倫敦的查普曼和霍爾出版社(Chapman&Hall.London), 1995)、尼德曼(Needleman)和翁施(W unsch) (1970)的同源比對算法、皮爾森(Pearson)和利普曼(Lipman) (1988)的相似性搜索方法的工具,并且優(yōu)選地通過這些算法的計算機化的實施(如可作為GCG (注冊商標)，威斯康星程序包(Wisconsin Package ;來自加利福尼亞州圣地亞哥的艾可塞利斯公司(Accelrys Inc., San Diego, Calif.)的注冊商標)的一部分獲得的GAP、BESTFIT、FASTA以及TFASTA)來執(zhí)行。一個測試序列與一個參考序列的比對的區(qū)段的“一致性分數(shù)”是由兩個比對的序列共有的相同組分數(shù)除以參考序列區(qū)段中的總組分數(shù)，即，該全部參考序列或該參考序列的一個更小定義的部分。序列一致性百分數(shù)以一致性分數(shù)乘以100表示。一個或多個DNA序列可以與一個全長DNA序列或其一部分或與一個更長DNA序列比較。
[0025]本發(fā)明僅涵蓋第一核酸，這些第一核酸具有具備上文所指示程度的序列一致性的核苷酸序列，它們賦予在此所描述的嵌合基因脅迫誘導(dǎo)性。
[0026]在一個實例中，如上文所描述的第一核酸包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的3’末端。所述3’端包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的至少最后100個堿基、至少最后200個喊基、至少最后300個喊基或至少最后400個喊基。
[0027]在另一個實例中，第一核酸序列包含選自以下的已知響應(yīng)元件中的至少一項:來自SEQ ID NO:1中的位置796到803和SEQ ID NO: 2中的位置797到804的ABA響應(yīng)元件(ABRE)以及兩個干旱響應(yīng)元件(來自SEQ ID NO:1中的位置637到645和SEQ ID NO: 2中的位置637到645的DREl以及來自SEQ ID NO:1中的位置694到702和SEQ ID NO: 2中的位置694到702的DRE2)。在又另一個實例中，所述第一核酸序列包含以上響應(yīng)元件中的至少兩項，如ABRE和DREl、ABRE和DRE2或DREl和DRE2。所述第一核酸也可以包含所有三種響應(yīng)元件。在另一個實例中，包含至少一種、至少兩種或所有三種響應(yīng)元件的一個第一核酸序列的任何以上實例另外包含如剛才上文所描述的SEQ ID NO:1或SEQ ID N0:2的3’末端。
[0028]一個表達產(chǎn)物表示由編碼這種產(chǎn)物的核酸、DNA或RNA的轉(zhuǎn)錄和任選地翻譯而產(chǎn)生的中間物或最終產(chǎn)物。在轉(zhuǎn)錄過程中，在調(diào)節(jié)區(qū)控制下的一個DNA序列(特別是啟動子)被轉(zhuǎn)錄成一個RNA分子。一個RNA分子可以自身形成一種表達產(chǎn)物并且接著例如能夠與另一個核酸或蛋白質(zhì)相互作用?？商娲兀粋€RNA分子在它能夠被翻譯成一種肽或蛋白質(zhì)時可以是一種中間產(chǎn)物。當一個RNA是一種基因的表達的最終產(chǎn)物并且能夠與另一個核酸或蛋白質(zhì)相互作用時，該基因被認為編碼作為表達產(chǎn)物的該RNA分子。RNA表達產(chǎn)物的實例包括抑制性RNA，如正義RNA (共抑制)、反義RNA、核糖酶、miRNA或siRNA、mRNA、rRNA以及tRNA。當一種基因的表達的最終產(chǎn)物是一種蛋白質(zhì)或肽時，該基因被認為編碼作為表達產(chǎn)物的該蛋白質(zhì)。
[0029]術(shù)語“參與棉花植株對脅迫的響應(yīng)”與感興趣的表達產(chǎn)物結(jié)合表示在天然地包含如上文所描述的編碼一種表達產(chǎn)物的一種基因的一種植株暴露于脅迫條件時，所述基因的表達開啟或增加或消除或減少，表明它們在植株對脅迫的響應(yīng)中的作用。評估一種表達產(chǎn)物是否也參與棉花植株對脅迫的響應(yīng)的方法是本領(lǐng)域中已 知的。舉例來說，可以使用上文另外描述的報告基因檢驗，并且報告基因可以可操作地連接于啟動子，該啟動子天然可操作地連接于編碼該表達產(chǎn)物的核酸序列。在轉(zhuǎn)化到棉花植株或棉花植株細胞中之后，可以評估該報告基因的表達。如果與可操作地連接于一個組成性活性啟動子的如控制一個管家基因的報告基因相比，在植株或植株細胞暴露于脅迫之后觀測到在所述報告基因的表達方面的一個差異，那么這指示了所述啟動子以及相應(yīng)地編碼該表達產(chǎn)物的核酸的表達是可由脅迫誘導(dǎo)的。在這點上，應(yīng)注意，這類產(chǎn)物的表達不需要由所有種類的脅迫誘導(dǎo)。相反地，它可由適用于如本申請中其他地方所描述的植株的至少一個種類的脅迫誘導(dǎo)即足夠。另一個實例包括例如通過施加微陣列對參與脅迫響應(yīng)的基因進行轉(zhuǎn)錄組分析。
[0030]例如使用包含可操作地連接于一個容易評分的標志物(如在此進一步解釋的一種β -葡萄糖醛酸酶(GUS)報告基因)的啟動子序列的一個啟動子-報告子構(gòu)建體，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以對一個啟動子序列或一個功能啟動子片段的啟動子活性的確認進行測定。在此描述的所鑒別或產(chǎn)生的啟動子的片段或變異體賦予將它們包含在內(nèi)的嵌合基因脅迫誘導(dǎo)性的能力可以方便地通過以下方式測試:使此類核酸序列可操作地連接于編碼一種容易評分的標志物(例如一種葡萄糖醛酸酶基因)的一個核苷酸序列，將這一嵌合基因引入一種植株中并且分析與不暴露于脅迫的植株中該標志物的表達模式相比在該植株暴露于脅迫時該標志物的表達模式。一種標志物(或報告基因)的其他候選物是氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT)、β -半乳糖苷酶(β -GAL)以及具有熒光或磷光性質(zhì)的蛋白質(zhì)(如來自水母(Aequora Victoria)的綠色熒光蛋白(GFP)或熒光素酶)。為了界定一個最小啟動子，通過本領(lǐng)域所熟知的重組DNA技術(shù)使代表啟動子的一個核酸序列可操作地連接于一種標志物(報告子)基因的編碼序列。報告基因可操作地連接于啟動子的下游，使得在啟動子處引發(fā)的轉(zhuǎn)錄通過報告基因進行。包含在啟動子控制下的報告基因的表達盒可以通過在本領(lǐng)域中所熟知并且在本申請中其他地方所描述的轉(zhuǎn)化技術(shù)而引入一個適當細胞類型中。為了檢驗報告子蛋白，制備細胞溶解物并且針對報告子蛋白執(zhí)行本領(lǐng)域中所熟知的適當檢驗。舉例來說，如果CAT是所選擇的報告基因，那么將來自用包含在研究中的一個啟動子控制下的CAT的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細胞的溶解物與同位素標記的氯霉素和乙?；?輔酶A(乙?；?CoA)混合。該CAT酶將乙?；鶑囊阴；?CoA轉(zhuǎn)移到氯霉素的2-或3-位上。通過使乙?；穆让顾嘏c未反應(yīng)的材料分離的薄層色譜法監(jiān)測反應(yīng)。接著，通過放射自顯影法使反應(yīng)產(chǎn)物顯影。酶活性水平對應(yīng)于所制備的酶的量，這又揭露了啟動子或其片段或變異體在植株的脅迫暴露時的表達水平。也可以將這一表達水平與其他啟動子相比，以測定研究中的啟動子的相對強度。一旦確認了活性和功能性，就可以使用額外的突變和/或缺失分析來測定例如為引發(fā)轉(zhuǎn)錄所需的最小區(qū)域和/或序列。因此，序列可以在啟動子區(qū)的5’末端處和/或在啟動子區(qū)的3’末端處或在啟動子序列內(nèi)缺失和/或可以引入核苷酸取代。接著，這些構(gòu)建體再次被引入細胞中并且測定它們的活性和/或功能性。
[0031]代替測 量一個報告子酶的活性，也可以通過測量所產(chǎn)生的RNA的水平來測定轉(zhuǎn)錄啟動子活性(和功能性)?？梢栽趩我粫r間點或在多個時間點測量這一 RNA (如mRNA)的水平，并且像這樣，成倍增加可以是平均成倍增加或從以實驗方式測量的值獲得的一個外推值。由于它是水平的比較，所以可以使用測量mRNA水平的任何方法。在一個實例中，將在暴露于脅迫的一種植株的至少一種組織中的表達與在不暴露于脅迫的一種植株的至少一種組織中的表達比較。在另一個實例中，比較多種組織或器官。如在此所使用，植株器官的實例是種子、葉、根等，而組織的實例是葉原基、莖尖、維管組織等。一個啟動子的活性或強度可以相對于mRNA或蛋白質(zhì)的總量根據(jù)它具體產(chǎn)生的mRNA或蛋白質(zhì)累積的量來測量。作為替代方案，一個啟動子的活性或強度可以相對于一個充分表征的啟動子(它的轉(zhuǎn)錄活性已被事先評估)來表示。
[0032]在本披露的范圍內(nèi)，也可以使用與上文所描述的第一和第二核酸序列組合其他調(diào)節(jié)序列，這些調(diào)節(jié)序列位于包含一個啟動子的所述第一核酸序列與包含表達產(chǎn)物的編碼序列的所述第二核酸序列之間。此類調(diào)節(jié)序列的非限制性實例包括轉(zhuǎn)錄激活子(“增強子”)，例如申請W087/07644中所描述的煙草花葉病毒(TMV)或由卡林頓(Carrington)和弗雷德(Freed) 1990，病毒學(xué)雜志(J.Virol.> 64:1590-1597描述的煙草蝕紋病毒(TEV)的翻譯激活子或如本申請中其他地方所描述的內(nèi)含子。其他適合的調(diào)節(jié)序列包括多個5’UTR。如在此所使用，一個5’ UTR (也稱為前導(dǎo)序列)是一個信使RNA (mRNA)的一個特定區(qū)域，該特定區(qū)域定位于轉(zhuǎn)錄起始位點與編碼區(qū)的起始密碼子之間。它涉及mRNA穩(wěn)定性和翻譯效率。舉例來說，可以利用35S轉(zhuǎn)錄起始位點的一個矮牽牛葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因下游的5’非翻譯前導(dǎo)子來增加報告基因表達的穩(wěn)定狀態(tài)水平(哈普斯特爾(Harpster)等人，1988，分子與普通遺傳學(xué)雜志(Mol Gen Genet.)212 (I): 182-90)。W095/006742描述了使用來源于編碼熱激蛋白的基因的5’非翻譯前導(dǎo)子序列來增加轉(zhuǎn)基因表達。[0033]嵌合基因還可以包含在一種植株細胞(特別是一種棉花植株細胞)中可操作的一個轉(zhuǎn)錄終止或聚腺苷酸化序列。作為轉(zhuǎn)錄終止或聚腺苷酸化序列，可以使用具有以下來源的任何相對應(yīng)的序列:細菌來源,如根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的nos終止子；病毒來源，如CaMV35S終止子；或植株來源，如公開的專利申請EP0633317A1中所描述的一種組蛋白終止子。
[0034]SEQ ID NO:1的核苷酸序列代表具有一個缺失的rd29A基因的啟動子，而SEQ ID勵:2代表不具有修飾的 294基因的啟動子&(1294在此以下也稱為 29)。該啟動子包含至少兩個順式作用元件，這兩個順式作用元件中的一項參與對脫水的ABA相關(guān)的響應(yīng)(ABA響應(yīng)元件ABRE)，而另一項通過滲透勢的改變而被誘導(dǎo)。
[0035]已展示對應(yīng)于缺失一個堿基對的rd29啟動子的一個核酸序列SEQ ID NO:1足以將棉花葉子中可操作地連接的基因的轉(zhuǎn)錄激活。
[0036]在轉(zhuǎn)化到特定植株中并且所述植株隨后暴露于不同類型的非生物脅迫時，包含與一種異源基因可操作地連接的rd29啟動子的一種嵌合基因可以被表達。這可以展示于轉(zhuǎn)基因擬南芥、煙草(Yamaguch1-Shinozaki和Shinozaki, 1992,分子與普通遺傳學(xué)雜志，第331-340頁)、馬鈴薯(貝楠(Behnam)等人，2007，植物細胞報告(Plant Cell Rep)；第1275-1282頁)、菊花(洪(Hong)等人，2006，中國科學(xué)C輯生命科學(xué)(Sci China C LifeSci)，第436-45頁)以及小麥(佩萊格里內(nèi)斯基(Pellegrineschi)等人，2004，基因組(Genome),第 493-500 頁)中。
[0037]將可操作地連接于報告基因⑶S的另一個啟動子(ABA響應(yīng)性稻米啟動子rabl6A)轉(zhuǎn)化到煙草中，在煙草中甚至在用ABA處理之后在營養(yǎng)組織中仍不可以檢測到啟動子活性。
[0038]存在轉(zhuǎn)移到異源或(當偶合到一個轉(zhuǎn)基因上時)甚至同源植株系統(tǒng)中的啟動子并非必需產(chǎn)生如在它們的天然背景中發(fā)現(xiàn)的它們的功能和表達特征曲線并且可操作地連接于它們的天然基因的實例。舉例來說，已顯示來自番茄的屬于Asr家族的一種ABA響應(yīng)性啟動子在番茄中在它的天然背景中具有功能性并且可由ABA誘導(dǎo)。然而，當偶合到GUS上并且轉(zhuǎn)化到馬鈴薯中時，誘導(dǎo)性消除。另一方面，在番木瓜和煙草中均可以觀測到ABA可誘導(dǎo)的表達。出人意料地，與在它的天然基因環(huán)境中的啟動子不同，在番茄中轉(zhuǎn)化的Asr-GUS構(gòu)建體不再可被ABA誘導(dǎo)。因此，響應(yīng)于脅迫條件(特別是由ABA介導(dǎo)的脅迫條件)的異源啟動子的行為是不可預(yù)測的。換句話說，在一種植株中具有功能性的一個ABA響應(yīng)性啟動子在一個轉(zhuǎn)基因植株中未必發(fā)揮這種功能。
[0039]除此以外，ABA在一些植株中的豐富濃度可能引起一個ABA響應(yīng)性啟動子的組成性誘導(dǎo)，由此防止一種脅迫特異性響應(yīng)。
[0040]在未受脅迫的擬南芥葉子中ABA的基礎(chǔ)濃度是每克鮮重2_3ng (洛佩茲-卡博內(nèi)爾和郝勒吉，2005)。在干旱脅迫條件下，ABA濃度達到每克鮮重(f.w.) 10-21ng并且激活rd29a基因的啟動子(rd29啟動子)。然而，在未受脅迫的棉花植株中，葉子中的ABA濃度已在每克f.w.145到2490ng之間變化(?？松?982)。棉花中的這個濃度范圍將預(yù)期當在棉花中引入擬南芥rd29啟動子時永久地激活該啟動子。因此，熟練的人員將不考慮將rd29擬南芥啟動子用于棉花中的干旱可誘導(dǎo)的激活。
[0041]諸位發(fā)明人使用在包含一個ABA響應(yīng)元件(ABRE)以及兩個干旱響應(yīng)元件DREl和DRE2的擬南芥rd29啟動子控制下的GUS報告子產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因棉花植株。在本發(fā)明過程中，出人意料地發(fā)現(xiàn)這個啟動子區(qū)在水分脅迫條件下觸發(fā)GUS表達，盡管在未受脅迫的棉花植株的葉子中存在高ABA濃度。出人意料地，盡管在棉花葉子中ABA的內(nèi)源性水平高，但rd29啟動子的活性僅在干旱脅迫之后被誘導(dǎo)并且在再澆水之后返回到零。
[0042]此外，產(chǎn)生包含一種嵌合基因的棉花植株，該嵌合基因包含PNCl基因、NMAl基因或編碼針對PARPl的一種微RNA的一個核酸作為一個第二核酸，這些棉花植株生長良好并且能育，與包含在rd29的控制下的包含CBF3/CREB1A編碼序列作為第二核酸的一種嵌合基因的植株(艾倫(Alien)，2010)形成對照。在暴露于干旱脅迫的植株中，在rd29啟動子控制下的PNCl表達也得以增加。
[0043]下文將描述上文所描述的嵌合基因以及在此所披露的不同的其他方面的效用。舉例來說，本申請的披露可以用于調(diào)節(jié)棉花植株對脅迫的響應(yīng)，例如以便在棉花植株在它們的生存期中暴露于一個或多個種類的非生物脅迫至少一次的地區(qū)中促進種植棉花植株。
[0044]在另一方面，本申請披露了一種棉花植株細胞，該棉花植株細胞包含一種嵌合基因，該嵌合基因包含(a)—個第一核酸序列，該第一核酸序列包含SEQ ID N0:1或SEQ IDNO: 2的至少400個連續(xù)核苷酸或與其具有至少80%序列一致性的一個核酸序列，這些序列中的任一項賦予所述嵌合基因脅迫誘導(dǎo)性；(b)編碼一種感興趣的表達產(chǎn)物的一個第二核酸序列；以及任選地(c) 一個轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列。
[0045]—種棉花植株細胞可以是基本上包含為界定一種棉花植株所必需的基因信息的任何細胞，除在此所披露的嵌合基因之外，該基因信息還可以補充有一種或多種另外的轉(zhuǎn)基因。細胞可以來源于形成一種棉花植株的不同的器官和/或組織，包括但不限于果實、種子、胚、生殖組織、分生組織區(qū)域、愈傷組織、葉子、根、莖、花、維管組織、配子體、孢子體、花粉以及花粉粒。
[0046]如在此所使用的“棉花”或“棉花植株”包括陸地棉(Gossypium hirsutum)、海島棉(Gossypium barbad ense)、木本棉(Gossypium arboreum)以及草本棉(Gossypiumherbaceum)或來自此類種與其他種雜交或此類種之間雜交的子代。
[0047]在一個方面,如上文所描述的棉花植株細胞包含如在此所描述的嵌合基因。
[0048]在一個方面，本發(fā)明的棉花植株細胞可以再生成一個能成活的并且能育的棉花植株(參見表I)。此外，下文進一步描述的棉花植株是能成活的并且能育的。換句話說，包含本發(fā)明的嵌合基因的植株與野生型植株相比顯示出正?；盍湍苡浴?br> [0049]盡管根據(jù)本發(fā)明的某些植株細胞可以能夠再生成完整植株，但在一些實施例中，所述植株細胞不能進一步發(fā)育或再生成一個完整植株。
[0050]在描述在此的嵌合基因的一個實例中，所述感興趣的表達產(chǎn)物是(i) 一種蛋白質(zhì)或肽，或(ii) 一種RNA分子，它能夠調(diào)節(jié)所述棉花植株中所包含的一種基因的表達。所述蛋白質(zhì)或肽或所述棉花植株中所包含的所述基因優(yōu)選地參與棉花植株對脅迫的響應(yīng)。一種棉花植株中所包含的一種基因?qū)υ撁藁ㄖ仓陙碚f可以是內(nèi)源性的或已引入所述棉花植株中。后者尤其適用于對棉花植株來說不是內(nèi)源性的目標表達產(chǎn)物或來自其他有機體的在棉花植株中具內(nèi)源性但參與棉花植株對脅迫的響應(yīng)的表達產(chǎn)物的同源物。
[0051]在如在此所描述的棉花植株細胞的一個實例中，所述感興趣的表達產(chǎn)物是(i) 一種蛋白質(zhì)或肽，它任選地參與棉花植株對脅迫的響應(yīng)，或(ii) 一種RNA分子，它能夠調(diào)節(jié)所述棉花植株中所包含的一種基因的表達，其中任選地所述基因參與棉花植株對脅迫的響應(yīng)。
[0052]如在此所使用的術(shù)語“蛋白質(zhì)”描述了由超過30個氨基酸組成的分子的群組，而術(shù)語“肽”描述了由至多30個氨基酸組成的分子。蛋白質(zhì)和肽可以進一步形成二聚體、三聚體以及更高的寡聚物，即，由一個以上(聚)肽分子組成。形成此類二聚體、三聚體等的蛋白質(zhì)或肽分子可以是相同或不同的。因此，相對應(yīng)的更高級結(jié)構(gòu)被稱為同源二聚體或異源二聚體、同源三聚體或異源三聚體等。術(shù)語“蛋白質(zhì)”和“肽”也指天然修飾的蛋白質(zhì)或肽，其中修飾是例如通過糖基化、乙?；?、磷酸化等來實現(xiàn)的。此類修飾在本領(lǐng)域中是眾所周知的。
[0053]適合作為表達產(chǎn)物的任選地參與棉花植株對脅迫的響應(yīng)的示例性蛋白質(zhì)和核酸(如基因)包括:
[0054]在NAD+生物合成的補救路徑中起作用的NPTl (煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶)和編碼它的基因。該蛋白質(zhì)為rDNA和端粒處的沉默所需并且在交配型基因座處的沉默中具有作用。關(guān)于在本發(fā)明中適合的所有其他基因，可以用于本發(fā)明中的編碼NPTl的序列可以來自動物、植株或真菌來源。編碼NPTl的示例性核酸序列編碼包括具有以下登錄號的那些氨基酸序列的氛基酸序列:CAA85352 (釀酒酵母(Saccharomyces cerevisae))、XP_448893 (光滑念珠菌(Candida glabrata))、XP_453357 (乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis))、NP_983562 (棉假囊酵母(Eremothecium gossypii))> XP_462577 (漢森德巴利酵母(Debaromyces hansenii))、XP_889008 (白色念珠菌(Candida albicans))>XP_500338 (解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica))、XP_746744 (煙曲霉(Aspergillus fumigatus))、BAE64333 (米曲霉(Aspergillus oryzae))、XP_965789 (粗糖鏈抱霉(Neurosporacrassa))、EAQ93453 (球毛殼霉(Chaetomium globosum))、XP_682385 (構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans))、AAN74808 (串珠狀赤霉(Gibberella moniliformis))、Q9UTK3、XP_361075 (稻痕病菌(Magnaporthe grisea))、EAL18922 (新型隱球菌(Cryptococcusneoformans))、XP_56803 9 (新型隱球菌)以及 XP_760597 (玉蜀黍黑粉菌(Ustilagomaydis))。釀酒酵母(S.cerevisiae)NPTl完整cDNA和所編碼的蛋白質(zhì)分別由基因庫登錄號NC_001147和AAB59317提供。大腸桿菌(E.coli)NPTl是以基因庫登錄號J05568提供。人類核苷酸和氨基酸序列分別由基因庫登錄號BC006284和AAH06284以及分別X71355和CAA50490.AAH32466 和 BC032466 提供，并且在莊(Chong)等人(1993)基因組學(xué)(Genomics)18:355中有描述。小鼠NPTl核苷酸和氨基酸序列是由基因庫登錄號X77241和CAA54459提供并且在莊等人(1995)美國生理學(xué)雜志(Am.J.Physiol.) 5268:1038中有描述。
[0055]PNCl (吡嗪酰胺酶/煙酰胺酶I)(作為NAD+補救路徑的一部分將煙酰胺轉(zhuǎn)化為煙酸的一種煙酰胺酶)和編碼它的基因。該酶通過卡路里限制為壽命延長所需。編碼PNCl的示例性核酸序列編碼包括具有以下登錄號的那些氨基酸序列的氨基酸序列:Q06178、XP_444815 (光滑念珠菌)、NP_986687 (棉假囊酵母)、XP_453005 (乳酸克魯維酵母)、XP_458184 (漢森德巴利酵母)、XP_718656 (白色念珠菌)、XP_504391 (解脂耶氏酵母)、NP_592856 (粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、XP_762639 (玉蜀泰黑粉菌)、XP_571297 (新型隱球菌)、BAE57070 (米曲霉)、XP_750776 (煙曲霉)、XP_659349 (構(gòu)巢曲霉)、XP_389652 (玉蜀黍赤霉菌(Giberella zeae))、XP_957634 (粗糙鏈孢霉)、XP_363364(稻瘟病菌)、XP_758179 (玉蜀黍黑粉菌)以及EAQ85219 (球毛殼霉)。編碼釀酒酵母PNCl的一種核苷酸序列和由此所編碼的蛋白質(zhì)分別以基因庫登錄號NC_001139和NP_011478代表。一種落花生(Arachis hypogaea) PNCl的核苷酸和氨基酸序列是由基因庫登錄號M37636和AAB06183提供，并且在巴菲爾德(Buffard)等人(1990)美國國家科學(xué)院院刊(PNAS) 87:8874中有描述。一種人類同源物的核苷酸和氨基酸序列分別由基因庫登錄號BC017344 和 AAH17344 ;分別 AK027122 和 NP_078986 ;分別 XM_041059 和 XP_041059 ；以及分別NM_016048和NP_057132提供。人類PNCl的核苷酸和氨基酸序列是以基因庫登錄號BC017344 表示。
[0056]參與NAD+補救路徑的NMAl (煙酸單核苷酸腺苷酰基轉(zhuǎn)移酶I)和編碼它的基因。編碼NMAl的示例性核酸序列編碼包括具有以下登錄號的那些氨基酸序列的氨基酸序列:Q06178、XP_444815 (光滑念珠菌)、NP_986687 (棉假囊酵母)、XP_453005 (乳酸克魯維酵母)、XP_458184 (漢森德巴利酵母)、XP_718656 (白色念珠菌)、XP_504391 (解脂耶氏酵母)、NP_592856 (粟酒裂殖酵母)、XP_762639 (玉蜀黍黑粉菌)、XP_571297 (新型隱球菌)、BAE57070 (米曲霉)、XP_750776 (煙曲霉)、XP_659349 (構(gòu)巢曲霉)、XP_389652 (玉蜀黍赤霉菌)、XP_957634 (粗糙鏈孢霉)、XP_363364 (稻瘟病菌)、XP_758179 (玉蜀黍黑粉菌)以及EAQ85219 (球毛殼霉)。編碼釀酒酵母NMAl的一種核苷酸序列和由此所編碼的蛋白質(zhì)分別以基因庫登錄號NC_001144.2和NP_013432代表。人類同源物的核苷酸和氨基酸序列分別由基因庫登錄號 NM_022787 和 NP_073624 ;分別 AK026065 和 BAB15345 ;分別 AF459819 和AAL76934 ;分別 XM_087387 和 XP_087387 ；以及分別 AF345564 和 AAK52726 以及 NP_073624 ；AAL76934 ;NP_073624 ;以及AF314163提供。細菌同源物例如在張(Zhang)等人(2002)結(jié)構(gòu)(Structure) 10:69 中有描述。
[0057]參與NAD+的從頭合成和補救合成的NMA2 (煙酸單核苷酸腺苷?；D(zhuǎn)移酶2)和編碼它的基因。
[0058]關(guān)于以上四種蛋白質(zhì)和編碼它們的基因的實例，還參見W02006/032469。編碼NMA2的示例性核酸序列編碼 包括具有以下登錄號的那些氨基酸序列的氨基酸序列:NP_011524、XP_444815 (光滑念珠菌)、NP_986687 (棉假囊酵母)、XP_453005 (乳酸克魯維酵母)、XP_458184 (漢森德巴利酵母)、XP_718656 (白色念珠菌)、XP_504391 (解脂耶氏酵母)、NP_592856 (粟酒裂殖酵母)、XP_762639 (玉蜀黍黑粉菌)、XP_571297 (新型隱球菌)、BAE57070 (米曲霉)、XP_750776 (煙曲霉)、XP_659349 (構(gòu)巢曲霉)、XP_389652 (玉蜀黍赤霉菌)、XP_957634 (粗糙鏈孢霉)、XP_363364 (稻瘟病菌)、XP_758179 (玉蜀黍黑粉菌)以及EAQ85219 (球毛殼霉)。編碼釀酒酵母NMA2的一種核苷酸序列和由此所編碼的蛋白質(zhì)分別以基因庫登錄號NC_001139和NP_011524表示。人類同源物的核苷酸和氨基酸序列分別由基因庫登錄號NM_015039和NP_055854提供。編碼釀酒酵母NMA2的一種核苷酸序列和由此所編碼的蛋白質(zhì)分別以基因庫登錄號NC_001139和NP_011524表示。人類同源物的核苷酸和氨基酸序列分別由基因庫登錄號NM_015039和NP_055854提供。
[0059].參與氧化脅迫的蛋白質(zhì)(如膽堿氧化酶(C0D)、過氧化物歧化酶(SOD)以及抗壞血酸過氧化物酶(APX))和編碼它們的基因。(艾哈邁德(Ahmad)等人，2010)。
[0060]包括G1073 (atHRCl)的轉(zhuǎn)錄因子以及如EP1668140中所披露的轉(zhuǎn)錄因子多肽的G1073進化枝中的等同物(equivalog)。[0061]參與脅迫響應(yīng)性基因表達和脅迫耐受性(熊(Xiong)等人，植物細胞(The PlantCell) (2001)，第13卷，2063-2083)的Los5 (ΑΒΑ生物合成的一種關(guān)鍵調(diào)節(jié)子)和編碼它的基因。
[0062]編碼一種感興趣的表達產(chǎn)物的任何基因可以對棉花植株來說是內(nèi)源性的或可以已引入一種棉花植株中。在后者情況下，所引入的基因可以是并非發(fā)現(xiàn)于棉花中的基因的一種基因同源物或在棉花中具有一種同源物的基因。舉例來說，編碼NPTl的一種基因可以來源于真菌，如酵母。
[0063]所述感興趣的表達產(chǎn)物也可以是能夠調(diào)節(jié)所述棉花植株中所包含的一種基因的表達的一種RNA分子，其中所述基因任選地參與棉花植株對脅迫的響應(yīng)。
[0064]參與棉花植株對脅迫的響應(yīng)的基因的實例包括PARP1、PARP2、FTA、FTB、NPTUPNCU NMAU ΝΜΑ2 以及 Los5。
[0065]FTA (法尼基轉(zhuǎn)移酶α )和FTB (法尼基轉(zhuǎn)移酶β )是信號傳導(dǎo)基因，這些信號傳導(dǎo)基因被鑒別為在植株對環(huán)境脅迫(如干旱)作出響應(yīng)的能力中起作用(還參見王(Wang)等人，2005)。法尼基轉(zhuǎn)移酶催化法尼基化的第一步驟，在該第一步驟中一個15-碳法尼基部分被加入目標序列CaaX的半胱氨酸殘基中。FTA和FTB相關(guān)的表達產(chǎn)物的示例性用途也可見于 ΕΡ1534842 中。
[0066]對于RNA分子的 情況，將清楚的是每當RNA分子的核苷酸序列參考相對應(yīng)的DNA分子的核苷酸序列來定義時，核苷酸序列中的胸腺嘧啶(T)應(yīng)由尿嘧啶(U)代替。由本申請的上下文將清楚是參考RNA分子還是DNA分子。
[0067]術(shù)語“能夠調(diào)節(jié)一種基因的表達”是指一種RNA分子(如在此所描述的一種抑制性RNA分子)以不同方式影響目標基因的表達水平的作用。這可以通過抑制一種目標基因的表達來實現(xiàn)，該抑制通過與以下直接相互作用來進行:驅(qū)使所述表達的組分(如該基因本身或被轉(zhuǎn)錄的mRNA),這引起表達減少；或參與抑制一種基因的表達的另一種基因(其中所述后一種基因任選地參與棉花植株對脅迫的響應(yīng))，這引起表達增加。
[0068]抑制性RNA分子使它們的目標表達產(chǎn)物(如目標蛋白質(zhì))的可供翻譯成所述目標蛋白質(zhì)使用的多種mRNA的水平降低。以此方式，蛋白質(zhì)(例如參與不需要的對脅迫條件的響應(yīng)的那些蛋白質(zhì))的表達可以被抑制。這可以通過公認的技術(shù)來實現(xiàn)，包括共抑制(正義RNA 抑制)、反義 RNA、雙鏈 RNA (dsRNA)或微 RNA (miRNA)。
[0069]如在此所披露的作為表達產(chǎn)物的一種RNA分子包含編碼一種目標表達產(chǎn)物(如目標蛋白質(zhì)或RNA)的一個核苷酸序列或一個同源序列的一部分以使所述目標表達產(chǎn)物的表達下調(diào)。用于使表達下調(diào)的作為表達產(chǎn)物的一種RNA分子的另一個實例是反義RNA分子，這些反義RNA分子包含與編碼一種表達產(chǎn)物(如一種感興趣的蛋白質(zhì)或RNA)的一個核苷酸序列或一個同源序列的至少一部分互補的一個核苷酸序列。在此，可以例如通過引入這種反義RNA或編碼此類RNA分子的一種嵌合DNA來實現(xiàn)下調(diào)。在又另一個實例中，一種感興趣的表達產(chǎn)物(如一種感興趣的蛋白質(zhì)或RNA)的表達通過引入一種雙鏈RNA分子而下調(diào)，該雙鏈RNA分子包含與編碼所述感興趣的表達產(chǎn)物的一個基因序列的至少一部分相對應(yīng)并且對應(yīng)地互補的一個正義RNA區(qū)和一個反義RNA區(qū)，該正義和反義RNA區(qū)能夠彼此形成一個雙鏈RNA區(qū)。這種雙鏈RNA分子可以由如上文所描述的正義和反義分子以及由被加工以形成siRNA (如例如在EP1583832中所描述)或miRNA的單鏈分子兩項編碼。[0070]在一個實例中，可以通過引入一種嵌合DNA構(gòu)建體來使一種目標蛋白質(zhì)的表達下調(diào)，該嵌合DNA構(gòu)建體產(chǎn)生能夠通過共抑制而使表達下調(diào)的一種正義RNA分子。被轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)在轉(zhuǎn)錄時將以轉(zhuǎn)錄或后轉(zhuǎn)錄方式在目標植株或植株細胞中產(chǎn)生一種所謂的正義RNA分子，該正義RNA分子能夠使編碼一種目標表達產(chǎn)物(如一種目標蛋白質(zhì)或RNA)的一種基因的表達減少。被轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)(和所得RNA分子)包含與編碼植株細胞或植株中所存在的目標表達產(chǎn)物(如一種目標蛋白質(zhì))的核苷酸序列的相對應(yīng)部分具有至少95%序列一致性的至少20個連續(xù)核苷酸。
[0071]作為替代方案，用于下調(diào)一種目標表達產(chǎn)物(如一種目標蛋白質(zhì)或RNA)的表達的一種表達產(chǎn)物是一種反義RNA分子。使目標棉花植株或植株細胞中的一種感興趣的表達產(chǎn)物的表達下調(diào)或減少是以轉(zhuǎn)錄或后轉(zhuǎn)錄方式實現(xiàn)的。被轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)(和所得RNA分子)包含與編碼植株細胞或植株中所存在的所述目標表達產(chǎn)物的核酸序列的相對應(yīng)部分的互補序列具有至少95%序列一致性的至少20個連續(xù)核苷酸。
[0072]然而，編碼一種目標表達產(chǎn)物的核酸序列的約20nt的反義或正義RNA區(qū)的最小核苷酸序列可以包含在一個更大的RNA分子內(nèi)，尺寸從20nt到等于該目標基因的尺寸的長度變化。因此，所提到反義或正義核苷酸區(qū)的長度可以是約從約21nt到約5000nt長，如21nt、40nt、50nt、100nt、200nt、300nt、500nt、1000nt、2000nt 或甚至約 5000nt 或更長。此外，為了本發(fā)明的目的，不需要所使用的抑制性RNA分子或轉(zhuǎn)基因的編碼區(qū)域的核苷酸序列與目標基因完全相同或互補，該目標基因?qū)χ仓陙碚f可以是內(nèi)源性的或已被引入，編碼在植株細胞中表達被靶向以減少的目標表達產(chǎn)物。序列越長，對總體序列一致性的要求越不嚴格。因此，正義或反義區(qū)可以與目標基因的核苷酸序列或其互補序列具有約40%或50%或60%或70%或80%或90%或100%的總體序列一致性。然而，如所提到，反義或正義區(qū)應(yīng)包含具有與編碼目標基因的核苷酸序列具有約95%到約100%序列一致性的20個連續(xù)核苷酸的一個核苷酸序列。具有約95%到約100%序列一致性的鏈段可以是約50、75或lOOnt。
[0073]上述嵌合基因?qū)τ诜戳xRNA或正義RNA介導(dǎo)的基因表達水平下調(diào)的效率可以通過包含會引起異常的非聚腺苷 酸化的抑制性RNA分子的表達的DNA元件來進一步增強。適用于該目的的一個這種DNA元件是編碼一種自剪接核糖核酸酶的一個DNA區(qū)，如W000/01133中所描述。該效率也可以通過提供使用如W003/076619中所描述的核定位或滯留信號產(chǎn)生的RNA分子來增強。
[0074]另外，如在此所描述的一種表達產(chǎn)物可以是一種核酸序列，該核酸序列產(chǎn)生能夠使編碼一種目標表達產(chǎn)物的一種基因的表達下調(diào)的一種雙鏈RNA分子。在DNA區(qū)轉(zhuǎn)錄時，該RNA能夠通過在一個正義和反義區(qū)之間的常規(guī)堿基配對而形成dsRNA分子，由此該正義和反義區(qū)是如上文所描述的核苷酸序列。根據(jù)W099/53050的披露，作為根據(jù)本發(fā)明的dsRNA的表達產(chǎn)物可以另外包含位于例如正義和反義RNA區(qū)之間的間隔序列中的一個內(nèi)含子，如一個異源內(nèi)含子。為了實現(xiàn)這種轉(zhuǎn)基因的構(gòu)筑，可以使用W002/059294A1中所描述的載體。
[0075]在一個實例中，所述RNA分子包含一個第一和第二 RNA區(qū)，其中1.所述第一 RNA區(qū)包含具有與所述內(nèi)源性基因的核苷酸序列具有至少約94%序列一致性的至少19個連續(xù)核苷酸的一個核苷酸序列；2.所述第二 RNA區(qū)包含與所述第一 RNA區(qū)的所述19個連續(xù)核苷酸互補的一個核苷酸序列；3.所述第一和所述第二 RNA區(qū)能夠堿基配對以在所述第一和所述第二區(qū)的至少所述19個連續(xù)核苷酸之間形成一個雙鏈RNA分子。[0076]感興趣的產(chǎn)物的另一種示例性表達是能夠引導(dǎo)從編碼目標表達產(chǎn)物(如一種蛋白質(zhì)或一種RNA)的DNA轉(zhuǎn)錄的mRNA的裂解的一種微RNA分子(mirRNA，它可以從一種前微RNA分子加工而來)，該mRNA將被翻譯成所述目標表達產(chǎn)物。miRNA分子或前miRNA分子可以通過從如在此所描述的一種嵌合基因表達而被方便地引入植株細胞中，該嵌合基因包含編碼一種感興趣的表達產(chǎn)物(如miRNA、前miRNA或初級miRNA轉(zhuǎn)錄物)的一個(第二)核酸序列。
[0077]miRNA是調(diào)節(jié)植物以及其他真核生物中的基因表達的小型內(nèi)源性RNA。如在此所使用，一種“miRNA”是長度為約19到22個核苷酸的一種RNA分子，該RNA分子可以被裝載到一種RISC復(fù)合物中并且引導(dǎo)一種目標RNA分子的裂解，其中目標RNA分子包含與miRNA分子的核苷酸序列基本上互補的一個核苷酸序列。在一個實例中，在miRNA分子的基本上互補的序列中可能出現(xiàn)以下錯配中的一項或多項:
[0078]-所述miRNA的5’末端處的核苷酸與目標RNA分子中相對應(yīng)的核苷酸序列之間的一個錯配；
[0079]-所述miRNA的位置I到位置9中的核苷酸中的任一項與目標RNA分子中相對應(yīng)的核苷酸序列之間的一個錯配；
[0080]-所述miRNA的位置12到位置21中的核苷酸中的任一項與目標RNA分子中相對應(yīng)的核苷酸序列之間的三個錯配，其條件是存在不超過兩個連續(xù)錯配；
[0081]-miRNA的位置10和11處不允許有錯配(所有miRNA位置均從miRNA分子的5’末端開始來指定)。
[0082]如在此所使用，一種“前miRNA”分子是具有約100到約200個核苷酸、優(yōu)選地約100到約130個核苷酸的一種RNA分子，該RNA分子可以采用包含一個dsRNA莖干和一個單鏈RNA環(huán)的一個二級結(jié)構(gòu)并且在雙鏈RNA莖干中另外包含miRNA的核苷酸序列和它的miRNA *的互補序列。優(yōu)選地，miRNA和它的互補序列位于距離miRNA dsRNA莖干的游離末端約10到約20個核苷酸處。單 鏈環(huán)區(qū)的長度和序列并不關(guān)鍵并且長度可以例如在30與50nt之間顯著變化。優(yōu)選地，未配對和配對的RNA結(jié)構(gòu)的自由能之間的差異在_20與-60千卡/摩爾之間，尤其為約-40千卡/摩爾。miRNA與miRNA *之間的互補不需要完美并且可以容許未配對的核苷酸的約I到3個突起。一種RNA分子所采用的二級結(jié)構(gòu)可以通過本領(lǐng)域中常規(guī)的計算機算法(如mFold、UNAFold以及RNAFold)來預(yù)測。通過DCL活動釋放并且被裝載到RISC復(fù)合物上的前miRNA的dsRNA莖干的特定鏈是由5’末端處的互補程度決定，由此在5’末端處最少參與被裂解的dsRNA莖干的不同鏈的核苷酸之間的氫鍵結(jié)的鏈被裝載到RISC復(fù)合物上并且將決定目標RNA分子降解的序列特異性。然而，如果憑經(jīng)驗來自一個特定合成的前miRNA分子的miRNA分子因為“錯誤”鏈被裝載到RISC復(fù)合物上而不具有功能性，那么將立即明顯可見的是這個問題可以通過將miRNA分子和它的互補序列在前miRNA分子的dsRNA莖干的相應(yīng)鏈上的位置交換而得以解決。如本領(lǐng)域中已知,涉及兩個氫鍵的A與U或涉及兩個氫鍵的G與U之間的結(jié)合與涉及三個氫鍵的G與C之間的結(jié)合相比強度更小。
[0083]miRNA分子可以被包含在它們的天然存在的前miRNA分子內(nèi)，但它們也可以通過將通常由這種現(xiàn)有的前miRNA分子加工的miRNA分子的核苷酸序列換成另一種感興趣的miRNA的核苷酸序列而被引入現(xiàn)有的前miRNA分子骨架中。前miRNA的骨架也可以完全是合成的。同樣，合成的miRNA分子可以被包含在現(xiàn)有的前miRNA分子骨架或合成的前miRNA骨架內(nèi)，并且從現(xiàn)有的前miRNA分子骨架或合成的前miRNA骨架加工而來。
[0084]示例性表達產(chǎn)物還可以是催化自身裂解或其他RNA裂解的核酶。
[0085]在披露在此的嵌合基因的一個實例中，調(diào)節(jié)是增加，并且所述第二核酸序列編碼一種RNA，該RNA在被轉(zhuǎn)錄時1.產(chǎn)生一種RNA分子，該RNA分子能夠例如通過靶向參與使這些蛋白質(zhì)的表達下調(diào)的基因而使對所述棉花植株來說為內(nèi)源性的一種基因的表達增加，所述基因選自NPTl、PNCl、Los5、NMAl以及NMA2，或者2.產(chǎn)生一種RNA分子，該RNA分子能夠例如通過直接靶向此基因而使對所述棉花植株來說為內(nèi)源性的一種基因的表達降低，所述基因選自 PARP1、PARP2、FTA 以及 FTB。
[0086]在披露在此的嵌合基因的另一個實例中，調(diào)節(jié)是降低，并且所述第二核酸序列編碼一種RNA，該RNA在被轉(zhuǎn)錄時1.產(chǎn)生一種RNA分子，該RNA分子能夠例如通過靶向參與使這些蛋白質(zhì)的表達下調(diào)的基因而使對所述棉花植株來說為內(nèi)源性的一種基因的表達增加，所述基因選自PARPl、PARP2、FTA以及FTB，或者2.產(chǎn)生一種RNA分子，該RNA分子能夠例如通過直接靶向此基因而使對所述棉花植株來說為內(nèi)源性的一種基因的表達降低，所述基因選自 NPTl、PNCl、Los5、NMAl 以及 NMA2。
[0087]示例性的基于RNA的表達產(chǎn)物包括抑制性RNA，如miRNA、siRNA、反義RNA或靶向PARP (聚(ADP-核糖)聚合酶)家族的酶的核酶，它們的實例還披露于國際專利申請PCT/EP2010/003438 中。
[0088]當前，已描述兩類PARP蛋白。第一類，如在此所定義，包括所謂的經(jīng)典的包含Zn指的PARP蛋白(ZAP)或由相對應(yīng)的p arpl基因編碼的PARPl蛋白。這些蛋白質(zhì)的尺寸在從113到120kDa范圍內(nèi)并且特征進一步為存在定位于該蛋白質(zhì)的N末端域中、特別是定位于該蛋白質(zhì)的約355到約375個最初的氨基酸內(nèi)的至少一個、優(yōu)選地兩個Zn指域。Zn指被定義為能夠絡(luò)合一個Zn原子的具有序列CxxCxnHxxC的肽序列(由此η可以從26到30變化)。可以用作用于設(shè)計根據(jù)本發(fā)明的表達產(chǎn)物的基礎(chǔ)的來自ZAP類的PARP蛋白質(zhì)的氨基酸序列的實例包括可以按以下登錄號發(fā)現(xiàn)于PIR蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的序列:Ρ18493(牛(Bos taurus))、P26466 (原雞(Gallus gallus))、P35875 (黑腹果妮(Drosophilamelanogaster))、P09874 (智人(Homo sapiens))、P11103 (小家鼠(Mus musculus))、Q08824(馬蘇大麻哈魚(Oncorynchus masou))、P27008 (褐家鼠(Rattus norvegicus))、Q11208 (掠尾別麻蜆(Sarcophaga peregrina))以及 P31669 (非洲爪蟾(Xenopus laevis))。相對應(yīng)的cDNA的核苷酸序列可以按以下登錄號發(fā)現(xiàn)于EMBL數(shù)據(jù)庫中:D90073 (牛)、X52690 (原雞)、D13806 (黑腹果蠅)、M32721 (智人)、X14206 (小家鼠)、D13809 (馬蘇大麻哈魚)、X65496(褐家鼠)、D16482 (棕尾別麻蠅)以及D14667 (非洲爪蟾屬)。已描述玉米中的PARPl蛋白質(zhì)(TO00/04173)。在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中，具有 AGI 號 At2g31320 的一種parpl基因被報導(dǎo)于TAIR8蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中。
[0089]如在此所定義的第二類包括所謂的非經(jīng)典PARP蛋白(NAP)或由相對應(yīng)的parp2基因編碼的PARP2蛋白。這些蛋白質(zhì)更小(72-73kDa)并且其特征進一步為在該蛋白質(zhì)的N-末端不存在一個Zn指域，并且存在包含氨基酸的鏈段的與DNA結(jié)合蛋白具有相似性的一個N末端域。已報導(dǎo)了玉米(W000/04173)和棉花(W02006/045633)中的PARP2蛋白。已在擬南芥的基因組中鑒別出兩種parp2基因(At4g02390和At5g22470)。[0090]以下是鑒別以實驗方式證實的和假定的植株P(guān)ARP蛋白序列的數(shù)據(jù)庫條目的一個非限制性清單，這些序列可以被鑒別并且可以被視為用于設(shè)計根據(jù)本發(fā)明的表達產(chǎn)物的一個基礎(chǔ):AAN12901、AAMl3882, CAA10482、AAD20677、BAB09119、CAB80732、CAA88288、AAC19283、Q9ZP54、Q9FK91、Q11207、NP_850165、NP_197639、NP_192148 (擬南芥)；CA070689、CAN75718、CA048763、CA040033、A7QVS5、A5AIW8、A7Q0E8、A5AUF8、A7QFD4 (葡萄(Vitis vinifera)) ;BAF21367、BAC84104、EAZ0360U EAZ39513、BAF08935、EAZ23301、EAY86124、BAD25449、BAD53855、BAD52929、EAZl 1816、BAF04898、BAF04897、EAY73948、EAY73947、EAZl1816、EAZl1815、Q7EYV7、Q0E0Q3、A2YKJ0、A2X5L4、A2WPQ2、A2WPQ1、A3BIX4、A3A7L2、A2ZSW9、Q5Z8Q9、QOJMYU A2ZSW8、ΝΡ_001059453, ΝΡ_00104702 K NP_001042984、NP_001042983 (水稻(Oryza sativa)) ;AAC79704、CAA10889, CAA10888, Q9ZSV1、050017、B4FCJ3 (玉米(Zea mays)) ;EDQ65830、EDQ52960、A9SSX0、A9TUE0、A9S9P7 (小立碗蘚(Physcomitre I la patens)) ;AAD51626、Q9SWB4 (大丑(Glycine max))> QlSGFl (蔡黎首猜(Medicago truncatula)) ；ABK93464> A9PAR1 (毛果楊(Populus trichocarpa))。
[0091]清楚的是，編碼PARPl或PARP2蛋白或其多個部分的其他基因或cDNA可以從其他真核物種或品種、特別是從其他植物物種或品種分離。此外，一些氨基酸已換成其他化學(xué)上類似的氨基酸(所謂的保守取代)的編碼PARPl蛋白的parpl或parp2基因或合成的parpl基因(它們基于遺傳密碼的簡并性編碼與天然parpl基因類似但具有一個不同核苷酸序列的蛋白質(zhì))和其多個部分也適合于本發(fā)明的方法。
[0092]在描述在此的嵌合基因和棉花植株細胞的一個實例中，所述第一核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的核苷酸序列或與其具有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%序 列一致性并且賦予所述嵌合基因脅迫誘導(dǎo)性的一個核酸序列。
[0093]在描述在此的嵌合基因和棉花植株的另一個實例中，所述第一核酸序列由SEQ IDNO:1或SEQ ID NO: 2或與其具有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%序列一致性并且賦予所述嵌合基因脅迫誘導(dǎo)性的一個核酸序列組成。
[0094]在披露在此的嵌合基因和棉花植株的一個實例中,所述脅迫是水分脅迫、冷脅迫、高鹽脅迫或施用ΑΒΑ。
[0095]這些脅迫因素以術(shù)語“非生物植物環(huán)境脅迫”概述。這些因素不是孤立的，而是相關(guān)的并且彼此影響。
[0096]水分脅迫包括對于植物引起缺水的干旱。
[0097]干旱是最嚴重的世界范圍的農(nóng)業(yè)問題之一。世界農(nóng)業(yè)土地中的十分之四位于干旱或半干旱地區(qū)中。短暫的干旱可以造成牲畜死亡、饑荒以及社會混亂。其他農(nóng)業(yè)地區(qū)具有持續(xù)低降雨量并且依賴于灌溉來維持產(chǎn)量。在這兩種情況下，可以最有效使用水并且維持可接受的產(chǎn)量的作物將處于優(yōu)勢。
[0098]在本申請的實例中已顯示一種轉(zhuǎn)基因或嵌合基因可以在暴露于干旱脅迫時在棉花植株細胞中在rd29啟動子的控制下有效表達。這使得通過提供編碼表達產(chǎn)物的序列能夠減輕干旱條件對植株的作用，這使與其相關(guān)的如關(guān)于降低PARP的表達的表達產(chǎn)物所描述的缺點減少。
[0099]如本申請中所使用的干旱是指缺少或不存在可供一種植株使用一段指定時間的水。這種缺少或不存在水可以持續(xù)僅幾天，如至少或至多2天、至少或至多3天、至少或至多4天、至少或至多5天、至少或至多6天、至少或至多7天、至少或至多8天、至少或至多9天、至少或至多10天、至少或至多15天或至少或至多20天。也可以持續(xù)一段更長的時間，如至少或至多3周、至少或至多4周、至少或至多5周、至少或至多6周、至少或至多2個月、至少或至多3個月、至少或至多4個月、至少或至多5個月或至少或至多6個月。在世界上的一些地區(qū)中，干旱可以甚至持續(xù)比6個月更長，如7、8、9、10、11、12、15、18或24個月。
[0100]與本申請結(jié)合的術(shù)語“冷脅迫”表示小于12° C、小于11° C、小于10° C、小于9° C、小于8° C、小于7° C、小于6° C、小于5° C、小于4° C、小于3° C、小于2° C、小于1° C或甚至小于0° C，如小于-2° C、小于-4° C、小于-6° C、小于-8° C、小于-10° C，如-15° C、-20° C或-25° C的溫度持續(xù)一段指定的時間，如至少5h、至少或至多6h (與這個方面結(jié)合的術(shù)語“至多”還包括“至少5h)、至少7h、至少8h、至少9h、至少10h、至少15h、至少20h、至少I天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少10天、至少14天、至少21天或至少28天。以上兩個清單的任何組合充分定義冷脅迫。舉例來說，冷脅迫是在小于10° C的溫度下存在至少6h、至少12h、至少I天、至少2天、至少4天、至少I周或至少2周。
[0101]鹽脅迫已被報導(dǎo)在敏感物種中造成生長和發(fā)育的抑制；光合成、呼吸作用以及蛋白質(zhì)合成的減少(波伊爾(Boyer)，1982 ;梅洛尼(Meloni)等人，2003 ;帕耳(Pal)等人，2004)。植株中鹽度脅迫的一個重要后果是反應(yīng)性氧物質(zhì)(ROS)的過度產(chǎn)生，如過氧化物陰離子(0_2)、過氧化氫(H2O2)以及羥基自由基(0H.)，特別是在葉綠體和線粒體中(米特勒(Mittler), 2002 ;馬蘇德(Masood)等人，2006)。
[0102]術(shù)語“高鹽脅迫”表示在圍繞一種植株(特別是一種棉花植株)的土壤中至少80mM、至少90mM、至少100mM、至少120mM、至少130mM、至少140mM、至少150mM或至少200mM的鹽濃度。鹽的種類可以不同，取決于在其中發(fā)現(xiàn)的區(qū)域和土壤。示例性的鹽是NaCl、CaCl2、MgCl2 以及 MgSO4。
[0103]施用ABA可以 在實驗設(shè)置中使用以模擬非生物環(huán)境脅迫，因為ABA觸發(fā)干旱可誘導(dǎo)的基因的表達。在這點上，可以例如用包含在從至少20 μ M到500 μ M范圍內(nèi)的適當濃度的ABA的溶液噴灑這些植株。也可以使植株在包含50 μ M ABA的固體培養(yǎng)基上生長(劉紅霞(Hongxia Liu)，植物細胞 2010)。
[0104]在另一方面，本申請披露了一種包含以下的棉花植株或其種子或棉花植株部分:
(a)—種嵌合基因，該嵌合基因包含a.—個第一核酸序列，該第一核酸序列包含SEQ IDNO:1或SEQ ID NO: 2的至少400個連續(xù)核苷酸或與其具有至少80%序列一致性的一個核酸序列，這些序列中的任一項賦予所述嵌合基因脅迫誘導(dǎo)性；b.—個第二核酸序列，該第二核酸序列編碼一種感興趣的表達產(chǎn)物；以及任選地c.一個轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列；或
(b)在此所描述的棉花植株細胞。(a)中所描述的嵌合基因可以是如在此以上所描述的嵌合基因，包括與其相關(guān)的所有變化形式。
[0105]嵌合基因可以通過在可以衍生出胚性愈傷組織的棉花植株中轉(zhuǎn)化而引入，這些棉花植株如珂字棉(Coker) 312、珂字棉310、珂字棉5愛字棉(Acala) SJ-5、GSC25110、大纖維(FIBERMAX) 819、斯歐科拉(Siokra) 1-3、T25、GSA75、愛字棉 SJ2、愛字棉 SJ4、愛字棉SJ5、愛字棉SJ-C1、愛字棉B1644、愛字棉B1654-26、愛字棉B1654-43、愛字棉B3991、愛字棉GC356、愛字棉GC510、愛字棉GAM1、愛字棉Cl、愛字棉羅亞爾(Acala Royale)、愛字棉馬克撒(Acala Maxxa)、愛字棉普利瑪(Acala Prema)、愛字棉B638、愛字棉B1810、愛字棉B2724、愛字棉B4894、愛字棉B5002、非愛字棉“采棉者(picker)”斯歐科拉、“摘棉者(stripper)” 品種 FC2017、珂字棉 315、斯字棉(STONEVILLE) 506、斯字棉 825、DP50、DP61、DP90、DP77、DESl 19、McN235、HBX87、HBX191、HBX107、FC3027、凱姆布雷德(CHEMBRED) Al、凱姆布雷德A2、凱姆布雷德A3、凱姆布雷德A4、凱姆布雷德B1、凱姆布雷德B2、凱姆布雷德B3、凱姆布雷德Cl、凱姆布雷德C2、凱姆布雷德C3、凱姆布雷德C4、佩字棉(PAYMASTER)145、HS26、HS46、斯卡拉(SICALA)、皮馬 S6 歐羅布朗科皮馬(PIMA S60R0 BLANCO PIMA)、大纖維FM5013、大纖維FM5015、大纖維FM5017、大纖維FM989、大纖維FM832、大纖維FM966、大纖維FM958、大纖維FM989、大纖維FM958、大纖維FM832、大纖維FM991、大纖維FM819、大纖維FM800、大纖維FM960、大纖維FM966、大纖維FM981、大纖維FM5035、大纖維FM5044、大纖維FM5045、大纖維FM5013、大纖維FM5015、大纖維FM5017或大纖維FM5024以及具有其衍生的基因型的植株。
[0106]種子是由與儲存的養(yǎng)分一起被一個種皮密封的一個胚植物形成。種子是裸子植物和被子植物的成熟的胚珠的產(chǎn)物，棉花屬于后者，它在受精之后出現(xiàn)并且在母體植株內(nèi)生長到一定程度。
[0107]在此所披露或通過在此所描述的方法獲得的轉(zhuǎn)化的棉花植株細胞和棉花植株除上文所描述的嵌合基因之外還可以包含至少一種其他嵌合基因，該至少一種其他嵌合基因包含編碼一種感興趣的表達產(chǎn)物的一種核酸。這種表達產(chǎn)物的實例包括RNA分子或蛋白質(zhì)，如對一種除草劑具有抗性的一種酶，如對基于草銨膦的除草劑具有耐受性的bar或pat酶(EP0257542、W087/05629以及EP0257542，懷特(White)等人1990)、對基于草甘膦的除草劑具有耐受性的EPSPS酶(如一種雙突變玉米EPSPS酶(US6，566，587和W097/04103))或?qū)PI3D抑制劑除草劑(如異噁唑)具有耐受性的HPI3D酶(W096/38567)。
[0108]通過在此所描述的方法獲得的轉(zhuǎn)化的植株細胞和植株可以進一步用于在本領(lǐng)域中眾所周知的育種程序，如雜交、自交以及回交。育種程序可以涉及雜交以產(chǎn)生一個Fl (第一子代)代，隨后為自交的若干代(產(chǎn)生F2、F3等)。育種程序還可以涉及回交(BC)步驟，由此后代與稱為輪回親本的親本 株系中的一項回交。
[0109]因此，在此還披露了一種用于制造植株的方法，這些植株包含在此所披露的嵌合基因，該方法包括以下步驟:使在此所披露的棉花植株與另一種植株或與自身雜交，并且針對包含所述嵌合基因的后代進行選擇。
[0110]通過在此所披露的方法獲得的轉(zhuǎn)化的植株細胞和植株也可以進一步用于后續(xù)轉(zhuǎn)化程序，例如用于引入另一種嵌合基因。
[0111]在此所披露的或通過在此所披露的方法獲得的包含嵌合基因的棉花植株或種子可以進一步用以下處理:棉花除草劑，如敵草隆(Diuron)、伏草隆(Fluometuron)、MSMA> 乙氧氟草醚(Oxyfluorfen)、撲草凈(Prometryn)、氟樂靈(Trifluralin)、唑草酮(Carfentrazone)、烯草酮(Clethodim)、丁基批氟禾草靈(Fluazifop-butyl )、草甘膦、達草滅(Norf lurazon)、二甲戍樂靈(Pendimethalin)、卩密硫草醚(Pyrithiobac-sodium)、三氟唳磺隆(Trifloxysulfuron)、卩比喃草酮(Tepraloxydim)、草銨膦(Glufosinate)、丙炔氟草胺(Flumioxazin)、噻苯隆(Thidiazuron);棉花殺蟲劑，如乙酰甲胺磷(Acephate)、涕滅威(Aldicarb)、毒死蝶(Chlorpyrifos)、氯氰菊酯(Cypermethrin)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、阿巴汀(Abamectin)、卩定蟲脈(Acetamiprid)、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽(Emamectin Benzoate)、卩比蟲啉(Imidacloprid)、卻蟲威(Indoxacarb)> λ -氯氟氰菊酯(Lambda-Cyhalothrin)、多殺菌素(Spinosad)、硫雙威(Thiodicarb)、Y -氯氟氰菊酯(Gamma-Cyhalothrin)、螺甲螨酯(Spiromesifen)、卩定蟲丙醚(Pyridalyl )、氟唳蟲酰胺(Flonicamid)、氟蟲雙酰胺(Flubendiamide)、殺鈴脲(TrifIumuron)、氯蟲苯甲酰胺(Rynaxypyr)、β -氟氯氰菊酯(Beta-Cyfluthrin)、螺蟲乙酯(Spirotetramat)、可尼丁(Clothianidin)、噻蟲嗪(Thiamethoxam)、噻蟲啉(Thiacloprid)、呋蟲胺(Dinetofuran)、氟蟲雙酰胺、溴氰蟲酰胺(Cyazypyr)、多殺霉素、乙基多殺菌素(Spinotoram)、Y氯氟氰菊酯、4_[[(6_氯卩比卩定-3-基)甲基](2，2- 二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)_酮、硫雙威、阿維菌素(Avermectin)、氟唳蟲酰胺、唳蟲丙醚、螺甲螨酯、氟唳蟲胺腈(Sulfoxaflor)；以及棉花殺真菌劑，如喃菌酯(Azoxystrobin)、聯(lián)苯批菌胺(Bixafen)、唳酰菌胺(Boscalid)、多菌靈(Carbendazim)、百菌清(Chlorothalonil)、銅、環(huán)丙唑醇(Cyproconazole)、苯醚甲環(huán)唑(Difenoconazole)、醚菌胺(Dimoxystrobin)、氟環(huán)唑(Epoxiconazole)、咪唑菌酮(Fenamidone)、氟唳胺(Fluazinam)、氟批菌酰胺(Fluopyram)、氟卩密菌酯(Fluoxastrobin)、氟唑菌酰胺(Fluxapyroxad)、異菌脲(Iprodione)、卩比唑萘菌胺(Isopyrazam)> 異噻菌胺(Isotianil)、代森猛鋅(Mancozeb)、代森猛(Maneb)、苯氧菌胺(Metominostrobin)、卩比噻菌胺(Penthiopyrad)、卩定氧菌酯(Picoxystrobin)、丙森鋒(Propineb)、丙硫菌唑(Prothioconazole)、卩比唑醚菌酯(Pyraclostrobin)、五氯硝基苯(Quintozen e)、戍唑醇(Tebuconazole)、氟醚唑(Tetraconazole)、甲基硫菌靈(Thiophanate-methyl )、月虧菌酉旨(Trifloxystrobin)0
[0112]在另一方面,披露了一種在脅迫條件下在棉花中表達一種轉(zhuǎn)基因的方法,該方法包括:(al)將一種嵌合基因引入或基因滲入一種棉花植株中，該嵌合基因包含:一個第一核酸序列，該第一核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的至少400個連續(xù)核苷酸或與其具有至少80%序列一致性的一個核酸序列，這些序列中的任一項賦予所述嵌合基因脅迫誘導(dǎo)性；一個第二核酸序列，該第二核酸序列編碼一種感興趣的表達產(chǎn)物；以及任選地一個轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列，并且使該植株生長；或(&2)使在此所描述的棉花植株生長或使來自在此所描述的種子的一種植株生長；(b)使所述植株暴露于脅迫。(al)中所描述的嵌合基因可以是如在此以上所描述的嵌合基因，包括與其相關(guān)的所有變化形式。
[0113]與本申請結(jié)合的“引入”是指通過人工手段將基因信息置入一種植株細胞或植株中。這可以通過本領(lǐng)域中已知的用于將RNA或DNA引入植株細胞、組織、原生質(zhì)體或完整植株中的任何方法來實現(xiàn)。
[0114]多種方法可供將DNA轉(zhuǎn)移到植株細胞中使用。棉花的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化已在例如美國專利5，004，863、美國專利6，483，013以及W02000/71733中有描述。
[0115]也可以通過粒子轟擊來轉(zhuǎn)化植株:用DNA涂布金或鎢的粒子并且接著射入年輕植株細胞或植株胚胎中。這種方法還允許植株質(zhì)體的轉(zhuǎn)化。通過粒子轟擊進行的棉花轉(zhuǎn)化在例如W092/15675中有報導(dǎo)。
[0116]可以使用病毒轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)導(dǎo))來進行瞬時或穩(wěn)定的基因表達，這取決于病毒基因組的性質(zhì)。所希望的基因材料被封裝到一個適合的植物病毒中并且使被修飾的病毒感染植株。被感染的植株的子代是無病毒的并且也不含被插入的基因。適合用于病毒轉(zhuǎn)化的方法在例如 TO90/12107、W003/052108 或 W02005/098004 中有描述或進一步詳述。
[0117]“基因滲入”意味著通過天然手段(S卩，通過使包含在此所描述的嵌合基因的一種植株與不包含所述嵌合基因的一種植株雜交)將一種基因整合于一種植株基因組中?？梢赃x擇后代中那些包含嵌合基因的后代。
[0118]另外的轉(zhuǎn)化和基因滲入方案也可見于美國專利7，172,881中。
[0119]在由在此所披露的嵌合基因編碼的所選擇的轉(zhuǎn)基因表達的過程中，植株必須暴露于天然或人工產(chǎn)生的脅迫條件。這包括使植株暴露于至少一個種類的非生物環(huán)境脅迫，如水分脅迫(尤其是干旱脅迫)、冷脅迫、高鹽脅迫或由施用ABA所誘導(dǎo)的脅迫。
[0120]呈干旱脅迫形式的水分脅迫可以僅通過剝奪或減少植株的供水(通過將它們置放在一個天然干旱暴露區(qū)域中或通過減少溫室或田間的供水)而施加到植株上。舉例來說，供水可以減少至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或甚至100%，持續(xù)落入上文結(jié)合干旱脅迫所描述的那些所希望的時間內(nèi)的一段所希望的時間。
[0121 ] 冷脅迫可以通過將植株置放在與它習(xí)慣的相比一個更低的溫度下來施加。舉例來說，可以將棉花植株置放在低于12° C、低于10° C、低于7° C或甚至低到4° C或2° C的溫度下持續(xù)落入上文結(jié)合冷脅迫所描述的那些所希望的時間內(nèi)的一段所希望的時間。
[0122]高鹽脅迫可以通過以下方式施加:將植株置放在包含一定總鹽濃度的土壤中持續(xù)一段所希望的時間，如上文針對高鹽脅迫所描述；或用包含一定鹽濃度的水對植株進行澆水，引起鹽在土壤中的富集。示例性濃度范圍在25mM與200mM之間，例如在30與180mM之間、50 與 150mM 之間，包括 60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM 以及 140mM。
[0123]由ABA誘導(dǎo)的脅迫可以通`過用包含濃度在約10 μ M與約200 μ M之間(如在20與150之間或50到100)的ABA的一種溶液噴灑這些植株來施加。
[0124]在另一方面，本申請披露了一種產(chǎn)生棉花植株的方法，該方法包括:引入或基因滲入一種嵌合基因，該嵌合基因包含:一個第一核酸序列，該第一核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的至少400個連續(xù)核苷酸或與其具有至少80%序列一致性的一個核酸序列，這些序列中的任一項賦予所述嵌合基因脅迫誘導(dǎo)性；一個第二核酸序列，該第二核酸序列編碼一種感興趣的表達產(chǎn)物；以及任選地一個轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列；或使在此所描述的植株生長或使來自在此所披露的種子的一種植株生長。所引入或基因滲入的嵌合基因可以是如在此以上所描述的嵌合基因，包括與其相關(guān)的所有變化形式。包含在所述嵌合基因中的由所述第二核酸序列編碼的感興趣的表達產(chǎn)物可能參與棉花植株對如上文所描述的脅迫的響應(yīng)。
[0125]在此還披露了一種檢測轉(zhuǎn)基因在脅迫條件下的表達的方法，該方法包括(a)提供在此所披露的棉花植株細胞或植株，其中所述感興趣的表達產(chǎn)物是該轉(zhuǎn)基因；(b)使該植株暴露于脅迫；以及(C)檢測該轉(zhuǎn)基因的表達。
[0126]術(shù)語“一種轉(zhuǎn)基因的表達”是指使用在棉花細胞中起作用的適當?shù)谋磉_控制元件來轉(zhuǎn)錄并且任選地翻譯在此所披露的嵌合基因。如上文所描述，在此所披露的第一核酸序列具有啟動子功能并且是可由非生物植物脅迫誘導(dǎo)的，并且因此適合于在脅迫條件下在棉花中表達一種所選擇的表達產(chǎn)物(與第二核酸序列相對應(yīng))。
[0127]與這種方法結(jié)合的使一種植株暴露于脅迫可以如上文所描述來實現(xiàn)。[0128]“檢測轉(zhuǎn)基因的表達”可以按多種方式實現(xiàn)。在轉(zhuǎn)基因是一種報告基因的情況下，所述報告基因的表達取決于使它成為一種報告基因的特征是可容易檢測的。舉例來說，如果報告基因是能夠?qū)⒁环N底物轉(zhuǎn)化成一種可目測偵測的產(chǎn)物的一種酶，那么所述產(chǎn)物可以通過適當?shù)氖侄蝸頇z測，該適當?shù)氖侄稳Q于所述產(chǎn)物的顏色或由所述產(chǎn)物發(fā)射的光的波長。在轉(zhuǎn)基因不是一種常規(guī)的報告基因但具有酶促活性的情況下，可以由知道所述酶促活性的技術(shù)人員設(shè)計檢驗以使用適合的方法來對它進行追蹤和定量。此外，可以通過以下方式來測量具有已知核酸序列的一種轉(zhuǎn)基因的表達:PCR方法，包括扎諾尼(Zanoni)等人(自然(Nature) 2009,460,第 264-269 頁，也參見自然.實驗手冊(Nature Protocols):通過實時 PCR 進行 mRNA 表達分析(mRNA expression analysis by Real-Time PCR)；ISSN: 1754-2189)和洛根(Logan)，愛德華茲(Edwards)以及桑德斯(Saunders)(編者；實時 PCR:現(xiàn)代技術(shù)和應(yīng)用(Real-Time PCR:Current Technology and Applications),凱斯特學(xué)術(shù)出版社(Caister Academic Press) 2009，ISBN: 978-1-904455-39-4)中所披露的 PCR 方法；測序技術(shù)，包括在 http: //www.1llumina.com/documents/products/datasheets/datasheet_mrn a_expression.pdf 處可供使用的伊路米那數(shù)據(jù)表(Illuminadatasheet) “mRNA 表達分析(mRNA expression analysis)”(2010)中所披露的測序技術(shù)；以及雜交技術(shù)，如喬杜里(Chaudhary)等人(進化和發(fā)育(EVOLUT10N&DEVEL0PMENT) 2008 ；10:5, 567-582)中所披露的雜交技術(shù)。
[0129]在此還披露了一種調(diào)節(jié)棉花植株對脅迫的抗性的方法，該方法包括:將一種嵌合基因引入或基因滲入一種棉花植株中，該嵌合基因包含:a.—個第一核酸序列，該第一核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的至少400個連續(xù)核苷酸或與其具有至少80%序列一致性的一個核酸序列，這些序列中的任一項賦予所述嵌合基因脅迫誘導(dǎo)性；b.—個第二核酸序列，該第二核酸序列編碼一種感興趣的表達產(chǎn)物，該感興趣的表達產(chǎn)物任選地參與棉花植株對脅迫的響應(yīng)；以及任選地c.一個轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列；以及使所述嵌合基因在脅迫條件下表 達。用于這種方法中的嵌合基因可以是如在此以上所描述的嵌合基因，包括與其相關(guān)的所有變化形式。
[0130]如果由所述嵌合基因的第二核酸序列編碼的表達產(chǎn)物參與棉花植株對如上文所描述的非生物環(huán)境脅迫的響應(yīng)，那么一種植株對脅迫的抗性可以在描述在此的嵌合基因在脅迫條件下表達時被修改。
[0131]在描述在此的所有方法中，脅迫應(yīng)如上文結(jié)合在此所披露的嵌合基因解釋。因此，在披露在此的方法中，所述脅迫是水分脅迫、冷脅迫、高鹽脅迫或施用ΑΒΑ。水分脅迫可以是干旱脅迫。
[0132]在用于調(diào)節(jié)一種棉花植株對脅迫的抗性的方法的一個實例中，調(diào)節(jié)是增加，并且所述第二核酸序列編碼一種RNA，該RNA在被轉(zhuǎn)錄時1.產(chǎn)生一種RNA分子，該RNA分子能夠例如通過靶向參與使這些蛋白質(zhì)的表達下調(diào)的基因而使所述棉花植株中所包含的一種基因的表達增加，所述基因選自ΝΡΤ1、PNC1、Los5、NMAl以及NMA2 ;或者2.產(chǎn)生一種RNA分子，該RNA分子能夠例如通過直接靶向此基因而使所述棉花植株中所包含的一種基因的表達降低，所述基因選自PARP1、PARP2、FTA以及FTB。
[0133]在用于調(diào)節(jié)一種棉花植株對脅迫的抗性的方法的另一個實例中，調(diào)節(jié)是降低，并且所述第二核酸序列編碼一種RNA，該RNA在被轉(zhuǎn)錄時1.產(chǎn)生一種RNA分子，該RNA分子能夠例如通過靶向參與使這些蛋白質(zhì)的表達下調(diào)的基因而使所述棉花植株中所包含的一種基因的表達增加，所述基因任選地選自PARP1、PARP2、FTA以及FTB ;或者2.產(chǎn)生一種RNA分子，該RNA分子能夠例如通過直接靶向此基因而使所述棉花植株中所包含的一種基因的表達降低，所述基因選自NPTl、PNCl、Los5、NMAl以及NMA2。
[0134]在此還披露了以下用于在脅迫條件下在棉花中表達一種轉(zhuǎn)基因的用途:(a)在此所披露的棉花植株或種子；(b) —種嵌合基因，該嵌合基因包含:一個第一核酸序列，該第一核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的至少400個連續(xù)核苷酸或與其具有至少80%序列一致性的一個核酸序列，這些序列中的任一項賦予所述嵌合基因脅迫誘導(dǎo)性；b.—個第二核酸序列，該第二核酸序列編碼一種感興趣的表達產(chǎn)物；以及任選地c.一個轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列；或(c)一種核酸序列，該核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的至少400個連續(xù)核苷酸或與其具有至少80%序列一致性的一個核酸序列，這些序列中的任一項賦予與它可操作地連接的一種轉(zhuǎn)基因脅迫誘導(dǎo)性。用于這種用途的嵌合基因可以是如在此以上所描述的嵌合基因，包括與其相關(guān)的所有變化形式。另外，定義本發(fā)明用途的所有術(shù)語具有如在本申請中其他地方所描述的含義。舉例來說，術(shù)語“脅迫”被定義為并且包括如其他地方所描述的所有變化形式。
[0135]在此還披露了以下用于使一種棉花植株對脅迫的耐受性增加或用于檢測棉花纖維中的一種轉(zhuǎn)基因的用途:(a)—種核酸序列，該核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的至少400個連續(xù)核苷酸或與其具有至少80%序列一致性的一個核酸序列，這些序列中的任一項賦予與它可操作地連接的一種轉(zhuǎn)基因脅迫誘導(dǎo)性；或(10 —種嵌合基因，該嵌合基因包含:一個第一核酸序列，該第一核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID N0:2的至少400個連續(xù)核苷酸或與其具有至少80%序列一致性的一個核酸序列，這些序列中的任一項賦予所述嵌合基因脅迫誘導(dǎo)性；b.—個第二核酸序列，該第二核酸序列編碼一種感興趣的表達產(chǎn)物；以及任選地c.一個轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列。
[0136]一種棉花植株對脅迫的耐受性的增加可以通過一種方法來實現(xiàn)，該方法包括使Ca)的核酸可操作地連接于編碼參與棉花植株對脅迫的響應(yīng)的一種感興趣的表達產(chǎn)物的一個核酸序列，并且將所得 嵌合基因引入一種棉花植株中。舉例來說，如果，包含在此所描述的嵌合基因的一種棉花植株與不包含所述嵌合基因的一種棉花植株相比在如上文所描述的脅迫條件下存活得更久或具有提高的產(chǎn)量，那么存在一種棉花植株的耐受性的增加。
[0137]在此進一步披露的是從在此披露的植株可獲得或已獲得的棉花纖維和棉花籽油。在此披露的棉花纖維可以通過應(yīng)用在W02010/015423中披露的檢測方法，并且檢查纖維中Ca)的核酸或(b)的嵌合基因的存在而與其他纖維區(qū)分開來。
[0138]在此還披露的是由在此披露的纖維制成的紗線和紡織品以及包括在此披露的棉籽油或由在此披露的棉籽油組成的食物和飼料。一種用于獲得棉籽油的方法包括從在此披露的棉花植株收獲棉花籽并且也被披露的是從所述籽中提取所述油。另外，一種用于制造棉花纖維的方法包括使在此披露的棉花植株生長并且也被披露的是從所述棉花植株中收獲棉花。
[0139]在此還披露了一種保護棉田不受脅迫影響的方法:包括(a)獲得棉花植株，這些棉花植株包含:(i) 一種嵌合基因，該嵌合基因包含
[0140]a.一個第一核酸序列，該第一核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID N0:2的至少400個連續(xù)核苷酸或與其具有至少80%序列一致性的一個核酸序列，這些序列中的任一項賦予所述嵌合基因脅迫誘導(dǎo)性；b.第二核酸序列，該第二核酸序列編碼一種感興趣的表達產(chǎn)物；以及任選地c.一個轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列此處描述的棉花植株細胞；或其子代；和6)在所述田間種植所述棉花植株。
[0141]圖式展示:
[0142]圖1:在水分脅迫條件(相對土壤含水量(rswc) 10%)下rd29::⑶S轉(zhuǎn)基因棉花植株和野生型對照的照片。
[0143]圖2:與野生型植株相比包含rd29::⑶S的植株的表達特征曲線。在水分脅迫條件下，測定來自指定為8901和6301的兩種獨立的rd29::⑶S轉(zhuǎn)基因棉花植株以及野生型對照的GUS基因的表達水平。在水分脅迫的過程中，在野生型對照中未檢測到GUS基因，而在這兩種rd29: AUS棉花植株中檢測到表達。在對這兩種rd29: AUS棉花植株進行再澆水之后，⑶S表達水平回到O。
[0144]圖3:包含rd29a::PNC1構(gòu)建體的植株的葉子組織在施加干旱脅迫之前和之后的表達分析。
[0145]序列表
[0146]SEQ ID NO:1:具有一個缺失的RD29啟動子
[0147]SEQ ID NO:2:RD29 啟動子
[0148]SEQ ID NO:3:引物 naste8
[0149]SEQ ID N0:4:引物 naste9
[0150]SEQ ID N0:5:載 體 pGEM-T
[0151]SEQ ID N0:6:載體 pNVSlO
[0152]SEQ ID NO:7:載體 pNVSll
[0153]SEQ ID N0:8:引物 pNVSllFW
[0154]SEQ ID N0:9:引物 pNVSllRV
[0155]SEQ ID NO: 10:載體 pNVS122
[0156]SEQ ID NO: 11:引物 naste79
[0157]SEQ ID NO: 12:載體 pNVS123
[0158]SEQ ID NO: 13:引物 naste75
[0159]SEQ ID NO: 14:引物 naste80
[0160]SEQ ID N0:15:載體 pNVS124
[0161]SEQ ID N0:16:包含了具有一個缺失的RD29啟動子的載體pTIBElO
[0162]SEQ ID NO: 17:包含 RD29 啟動子的載體 pTIBE28
[0163]SEQ ID NO: 18:具有內(nèi)含子的⑶S報告基因
[0164]SEQ ID NO: 19:3’ CaMV35S 終止子的核酸序列
[0165]SEQ ID NO:20:編碼2mepsps選擇標記盒的核酸序列
[0166]SEQ ID N0:21:包含CaMV3’ 35S終止子的具有內(nèi)含子的⑶S基因的核酸序列
[0167]SEQ ID NO:22:編碼PNCl蛋白的核酸序列
[0168]SEQ ID NO:23:編碼NMAl蛋白的核酸序列
[0169]SEQ ID NO: 24:編碼針對PARPl的一種微RNA的核酸[0170]SEQ ID NO:25:編碼針對PARP2的一種發(fā)夾RNA的核酸
[0171]SEQ ID NO:26:編碼針對法尼基轉(zhuǎn)移酶a (FTA)的一種發(fā)夾RNA的核酸
[0172]SEQ ID NO:27:編碼針對法尼基轉(zhuǎn)移酶β (FTB)的一種發(fā)夾RNA的核酸
[0173]SEQ ID NO:28:編碼Los5蛋白的核酸序列
[0174]以下實例說明本發(fā)明。應(yīng)了解，這些實例不限制在此所披露的主題的精神和范圍。
[0175]實例
[0176]材料
[0177]除非另外指明，否則這些實例中的化學(xué)品和試劑是獲自西格瑪化學(xué)公司(SigmaChemical Company),限制性核酸內(nèi)切酶是來自富酶泰斯公司(Fermentas)或羅氏-勃林格公司(Roche-Boehringer),而關(guān)于生物化學(xué)品和分子生物學(xué)檢驗的其他修飾酶或試劑盒是來自凱杰公司(Qiagen)、英杰公司(Invitrogen)以及Q-拜歐基因公司(Q-B10gene)。細菌菌株是來自英杰公司。所進行的克隆步驟，如例如限制性裂解、瓊脂糖凝膠電泳、DNA片段的純化、連接DNA片段、大腸桿菌細胞的轉(zhuǎn)化、使細菌生長、使噬菌體增殖以及重組DNA的序列分析是如由薩布魯克(1989)所描述般進行的。重組DNA分子的測序是使用ABI激光熒光DNA測序儀遵循桑格(Sanger)的方法進行的。
[0178]實例1:分別產(chǎn)生具有可操作地連接于⑶S報告基因的來自rd29啟動子的933bp區(qū)(包含一個缺失)和來自rd29啟動子的934bp區(qū)的表達構(gòu)建體
[0179]將使用以下引物從基因組擬南芥DNA擴增的擬南芥(A.thaliana)的rd29a基因的934bp啟動子區(qū)
[0180]naste85，GCCCGGGCCATAGATGCAATTCAATCAAAC (SEQ ID NO:3)和
[0181]naste95’GCGCTAGCCTCGAGTTAATTAAGATTTTTTTCTTTCCAATA (SEQ ID NO:4)
[0182]克隆到pGEM-T 載體(SEQ ID NO:5)中，產(chǎn)生質(zhì)粒 pNVSlO (SEQ ID N0:6)。
[0183]這一質(zhì)粒與Yamaguch1-Shinozaki 和 Shinozaki (1994)相比在 rd29a 啟動子區(qū)中包含I個缺失:在bp3748處一個A缺失。
[0184]在啟動子區(qū)(B卩，在5’ UTR中)的3’末端處，將TCTTTGGAAA改變成TCTTAATTAA，從而為了克隆原因建立一個PacI位點。
[0185]將CaMV35S增強子添加到pNVSlO中的啟動子區(qū)的3’，產(chǎn)生pNVSll(SEQ ID N0:7)。
[0186]為了促進具有Ncol/Nhel的GOI的克隆，將rd29啟動子的5’末端處的一個NcoI位點消除，并且在rd29啟動子的3’末端處引入一個新的NcoI位點。這是使用以下引物進行的
[0187]包含一個BspHI 位點的 pNVSl IFW (5’ CCTCATGACCATAGATGCAATTCAATCAAAC) (SEQID NO:8)和
[0188]包含一個NcoI 和 NheI 位點的 pNVSl 1RV( 5’ CCGCTAGCGCATCCATGGTCCAAAGATTTTTTTCTTTCAAT AG) (SEQ ID N0:9)，并且 pNVSll 作為一個 PCR 模板。
[0189]用切去rd29a啟動子區(qū)的Ncol、NheI消化pNVSll。用BspHI (與NcoI相容)和NheI切割rd29PCR產(chǎn)物。將BspHI位點連接到載體的NcoI位點中使原始NcoI位點缺失。由于pNVSllRv引物的序列，在rd29a啟動子后方、在3’CaMV35S前方引入一個NcoI和一個NheI 位點。所得質(zhì)粒是 pNVS122 (SEQ ID N0:10)。
[0190]為了檢查在rd29啟動子中檢測到的缺失是否由TAIR數(shù)據(jù)庫(擬南芥信息資源；http://www.arabidopsis.0rg/)序列中的測序錯誤所引起或者它是否歸因于被引入用
來制備pNVSlO的原始PCR片段中的錯誤，使用校正聚合酶Phusion?用引物naSte8和
naste9對基因組CTAB (西曲溴銨)DNA進行2次獨立的PCR反應(yīng)。對PCR產(chǎn)物的測序顯示
它們并不具有缺失。為了從PNVS122中去除該缺失，將一個新的引物
[0191]naste79 (5'CCGCTAGCGCATCCATGGTCCAAAGATTTTTTTCTTTCCAATAGAAGT) (SEQ ID
N0:11)
[οι92] 用于一個pcr反應(yīng)中，以代替弓I物pNVSlirv。使用Phusion?聚合酶，使用基因組CTAB DNA作為一個模板,用引物PnvSIIF1Wp naste79產(chǎn)生一種PCR產(chǎn)物。PNVS122和PCR產(chǎn)物兩者都用SpeI和NcoI切割，并且將正確的PCR片段引入PNVS122中，產(chǎn)生質(zhì)粒PNVS123(SEQ ID NO:12)。
[0193]為了促進在T-DNA載體中的進一步克隆，將MCS-接頭(多克隆位點)引入rd29a啟動子的5’。將引物
[0194]naste75
[0195]5’-CATGCCCGGGCGCGCCTGTACAGCGGCCGCGAATTCGT TAACTCTAGAGCGATCGC-3’(SEQ IDNO:13)
[0196]和
[0197]naste80
[0198]5’-CCGGGCGATCGCTCTAGAGTTAACGAATTCGCGGCCGC TGTACAGGCGCGCCCGGG-3’ (SEQID NO: 14)退火，產(chǎn)生具有粘性末端的接頭。在pNVSll的一個Pst1-NcoI片段+粘性末端接頭+pNVS123的一個Eag1-PstI片段之間進行3點連接。接頭的5’末端處的粘性末端是一個CATG(C)突出端，這個CATG(C)突出端退火到NcoI位點上，但這種連接消除了所得質(zhì)粒 PNVS124 (SEQ ID NO: 15)中的 NcoI 位點。
[0199]表汰載體的產(chǎn)牛:
[0200]從pNVSll擴增包含一個缺失的rd29a啟動子并且進行關(guān)于在一個中間載體中的
一步克隆的克隆。
[0201]將具有一個缺失的rd29啟動子片段(SEQ ID NO:1)、具有內(nèi)含子的⑶S基因(SEQID N0:18)以及3’CaMV35S終止子(SEQ ID NO: 19)組裝在包含2m印sps選擇標記盒的一個骨架載體(SEQ ID N0:20)中，從而產(chǎn)生表達載體pTIBElO (SEQ ID N0:16)。
[0202]表達載體pTIBE28 (SEQ ID NO: 17)包含與具有內(nèi)含子和CaMV3’35S終止子的Nhe1-NcoI⑶S基因(SEQ ID NO: 21)連接的沒有缺失的Spe1-NcoI rd29a啟動子(包含SEQ ID N0:2)。將兩個片段(即，⑶S-3’35S終止子和Spe1-NcoI rd29a啟動子)組裝在包含2mepsps選擇標記的一個載體中，產(chǎn)生pTIBE28 (SEQ ID NO: 17)。
[0203]實例2:包含rd29_GUS的轉(zhuǎn)基因植株的產(chǎn)生
[0204]在下一個步驟中，使用胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化方案，將包含實例I的表達盒的重組載體(即，載體pTIBElO和pTIBE28)用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化陸地棉珂字棉312。
[0205]對照植株是陸地棉珂字棉312rd29_GUS轉(zhuǎn)基因植株的無效分離子。
[0206]實例3:rd29::⑶S的干旱脅迫誘導(dǎo)性
[0207]在相應(yīng)的活性檢測過程中，用發(fā)色底物X_Gluc(5-溴-4-氯_3_吲哚基_ β -D-葡萄糖醛酸)植物原位監(jiān)測用ΡΤΙΒΕ 28轉(zhuǎn)化的植株的β-葡萄糖醛酸酶活性(杰佛森RA(Jefferson RA)等人(1987)歐洲分子生物學(xué)學(xué)會雜志(EMBO J.) 20; 6 (13): 3901-7)。為了測定啟動子活性，如所描述(例如皮恩S.(Pien S.)等人(2001)美國國家科學(xué)院院刊98(20):11812-7)對植株組織進行切割、包埋、染色以及分析。因此，通過因底物X-Gluc的酶促代謝所引起的藍色的存在而證實在被轉(zhuǎn)化的植株中的β-葡萄糖醛酸酶的活性。
[0208]在使植株在充分供水的情況下生長約30天之后，通過不再對植株進行澆水而使它們經(jīng)受干旱脅迫。
[0209]監(jiān)測經(jīng)過5天的⑶S報告基因的表達，在第5天進行再澆水。
[0210]在干旱脅迫五天之后，受脅迫的植株明顯小于未受脅迫的植株(參見圖1)。
[0211]圖2展示了包含來自ΡΤΙΒΕ28的rd29::⑶S的兩個植株株系與野生型植株相比的表達譜。
[0212]如由該圖清楚的，在干旱脅迫條件下兩個轉(zhuǎn)基因株系在rd29啟動子的控制下均表達⑶S報告基因。在對植株進行再澆水后表達被消除。因此，rd29啟動子可以用于在脅迫條件下表達基因。
[0213]實例4:包含rd29的嵌合基因的表達不損傷能育力和植株活力
[0214]將PNCl (SEQ ID N0:22)、NMA1 (SEQ ID N0:23)以及 Los5 (SEQ ID NO:28)基因以及編碼針對PARPl基因的微RNA (miPARPl)的一種核酸(SEQ ID NO: 24)以及針對PARP2基因的發(fā)夾構(gòu)建體(SEQ ID NO: 25)置于rd29a啟動子的控制之下。將所得構(gòu)建體單獨地轉(zhuǎn)化到棉花中并且使植株再生。包含嵌合基因的棉花TO植株是能育的并且產(chǎn)生有活力的Tl種子。用Tl種子的發(fā)芽試驗給出在90%與100%之間的發(fā)芽(播種20個種子并且針對發(fā)芽進行評分，所有Tl植株均具有正?；盍?。從Tl植株未觀測到能育性問題，純合和不成對的植株每植株產(chǎn)生超過400個T2種子。用T2種子的發(fā)芽試驗給出在80%與100%之間的發(fā)芽(播種15到20個種子并且針對發(fā)芽進行評分，所有T2植株均具有正?；盍?
[0215]a
[0216]
【權(quán)利要求】
1.一種嵌合基因，包含 (a)一個第一核酸序列，該第一核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID N0:2的至少400個連續(xù)核苷酸或與其具有至少80%序列一致性的一個核酸序列，這些序列中的任一項賦予所述嵌合基因脅迫誘導(dǎo)性； (b)一個第二核酸序列，該第二核酸序列編碼一種感興趣的表達產(chǎn)物，該感興趣的表達產(chǎn)物參與棉花植株對脅迫的響應(yīng)；以及任選地 (c)一個轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列。
2.—種包含嵌合基因的棉花植株細胞，該嵌合基因包含 (a)一個第一核酸序列，該第一核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的至少400個連續(xù)核苷酸或與其具有至少80%序列一致性的一個核酸序列，這些序列中的任一項賦予所述嵌合基因脅迫誘導(dǎo)性； (b)一個第二核酸序列，該第二核酸序列編碼一種感興趣的表達產(chǎn)物；以及任選地· (c)一個轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列。
3.如權(quán)利要求1所述的嵌合基因或如權(quán)利要求2所述的棉花植株細胞，其中所述感興趣的表達產(chǎn)物是 (i)一種蛋白質(zhì)或肽，該蛋白質(zhì)或肽當被包含在所述棉花植株細胞中所包含的一種嵌合基因中時任選地參與棉花植株對脅迫的響應(yīng)或 (ii)一種RNA分子，該RNA分子能夠調(diào)節(jié)被包含在所述棉花植株中的一種基因的表達，其中當所述RNA分子被包含在所述棉花植株細胞中所包含的一種嵌合基因中時，任選地，被包含在所述棉花植株中的所述基因參與所述棉花植株對脅迫的響應(yīng)。
4.如權(quán)利要求1或3所述的嵌合基因或如權(quán)利要求2或3所述的棉花植株細胞，其中任選地參與棉花植株對脅迫的響應(yīng)的所述蛋白質(zhì)選自NPTl、PNC1、NMA1、NMA2、Los5、以及參與氧化脅迫的多種蛋白質(zhì)，如膽堿氧化酶、過氧化物歧化酶以及抗壞血酸過氧化物酶。
5.如權(quán)利要求3所述的嵌合基因或棉花植株細胞，其中任選地參與棉花植株對脅迫的響應(yīng)的所述基因選自NPTl、PNCl、NMAl、NMA2、PARPl、PARP2、Los5、FTA、FTB、以及參與氧化脅迫的多種基因，如膽堿氧化酶、過氧化物歧化酶以及抗壞血酸過氧化物酶。
6.如權(quán)利要求3或5所述的嵌合基因或棉花植株細胞，其中調(diào)節(jié)是增加，并且所述第二核酸序列編碼一種RNA,該RNA在被轉(zhuǎn)錄時1.產(chǎn)生能夠使所述棉花植株中所包含的一種基因的表達增加的一種RNA分子，所述基因選自NPTl、PNCl、Los5、NMAl以及NMA2，或者2.產(chǎn)生能夠使所述棉花植株中所包含的一種基因的表達減少的一種RNA分子，所述基因選自 PARP1、PARP2、FTA 以及 FTB。
7.如權(quán)利要求3或5所述的嵌合基因或棉花植株細胞，其中調(diào)節(jié)是減少，并且所述第二核酸序列編碼一種RNA，該RNA在被轉(zhuǎn)錄時1.產(chǎn)生能夠使所述棉花植株中所包含的一種基因的表達增加的一種RNA分子，所述基因選自PARP1、PARP2、FTA以及FTB，或者2.產(chǎn)生能夠使所述棉花植株中所包含的一種基因的表達減少的一種RNA分子，所述基因選自NPT1、PNCl、Los5、NMAl 以及 NMA2。
8.如權(quán)利要求3和5到7中任一項所述的嵌合基因或棉花植株細胞，其中所述RNA分子包含一個第一和第二 RNA區(qū)，其中 ·1.所述第一 RNA區(qū)包含與所述棉花植株中所包含的所述基因的核苷酸序列具有至少約94%序列一致性的至少19個連續(xù)核苷酸的一個核苷酸序列；. 2.所述第二RNA區(qū)包含與所述第一 RNA區(qū)的所述19個連續(xù)核苷酸互補的一個核苷酸序列；并且. 3.所述第一和所述第二RNA區(qū)能夠堿基配對以在所述第一和所述第二區(qū)的至少所述19個連續(xù)核苷酸之間形成一個雙鏈RNA分子。
9.如權(quán)利要求1和3到8中任一項所述的嵌合基因或如權(quán)利要求2到8中任一項所述的棉花植株細胞，其中所述第一核酸序列包含SEQ IDN0:1或SEQ ID N0:2的核苷酸序列。
10.如權(quán)利要求1和3到9中任一項所述的嵌合基因或如權(quán)利要求2到9中任一項所述的棉花植株細胞，其中所述第一核酸序列由SEQ IDNO:l或SEQ ID NO:2組成。
11.如權(quán)利要求1和3到10中任一項所述的嵌合基因或如權(quán)利要求2到10中任一項所述的棉花植株細胞，其中所述脅迫是水分脅迫、冷脅迫、高鹽脅迫或施用ΑΒΑ。
12.如權(quán)利要求11所述的嵌合基因或棉花植株細胞，其中所述水分脅迫是干旱脅迫。
13.一種棉花植株或其種子或棉花植株部分，包含 (a)—種嵌合基因，該嵌合基因包含 a.一個第一核酸序列，該第一核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的至少400個連續(xù)核苷酸或與其具有至少80%序列一致性的一個核酸序列，這些序列中的任一項賦予所述嵌合基因脅迫誘導(dǎo)性； b.一個第二核酸序列，該第二核酸序列編碼一種感興趣的表達產(chǎn)物；以及任選地 c.一個轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列；或 (b)根據(jù)權(quán)利要求2到12中任一項所述的棉花植株細胞。
14.一種棉花纖維,該棉花纖維可由如權(quán)利要求13所述的棉花植株或其種子獲得。
15.—種在脅迫條件下在棉花中表達一種轉(zhuǎn)基因的方法，包括: (al)將一種嵌合基因引入或基因滲入一種棉花植株中，該嵌合基因包含:一個第一核酸序列，該第一核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的至少400個連續(xù)核苷酸或與其具有至少80%序列一致性的一個核酸序列，這些序列中的任一項賦予所述嵌合基因脅迫誘導(dǎo)性；一個第二核酸序列，該第二核酸序列編碼一種感興趣的表達產(chǎn)物；以及任選地一個轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列；并且使該植株生長或 (a2)使如權(quán)利要求13所述的棉花植株生長或使來自如權(quán)利要求13所述的種子的一種植株生長； (b)使所述植株暴露于脅迫。
16.—種產(chǎn)生棉花植株的方法,包括: -將一種嵌合基因引入或基因滲入,該嵌合基因包含:一個第一核酸序列，該第一核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的至少400個連續(xù)核苷酸或與其具有至少80%序列一致性的一個核酸序列，這些序列中的任一項賦予所述嵌合基因脅迫誘導(dǎo)性；一個第二核酸序列，該第二核酸序列編碼一種感興趣的表達產(chǎn)物；以及任選地一個轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列；或 -使如權(quán)利要求13所述的植株生長或使來自如權(quán)利要求13所述的種子的一種植株生長。
17.一種檢測轉(zhuǎn)基因在脅迫條件下的表達的方法，包括(a)提供如權(quán)利要求2到12中任一項所述的棉花植株細胞或如權(quán)利要求13所述的植株，其中所述感興趣的表達產(chǎn)物是該轉(zhuǎn)基因； (b)使該植株暴露于脅迫； (c)檢測該轉(zhuǎn)基因的表達。
18.—種調(diào)節(jié)棉花植株對脅迫的抗性的方法，包括 -將一種嵌合基因引入或基因滲入一種棉花植株中，該嵌合基因包含 a.一個第一核酸序列，該第一核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID N0:2的至少400個連續(xù)核苷酸或與其具有至少80%序列一致性的一個核酸序列，這些序列中的任一項賦予所述嵌合基因脅迫誘導(dǎo)性； b.一個第二核酸序列，該第二核酸序列編碼一種感興趣的表達產(chǎn)物，該感興趣的表達產(chǎn)物任選地參與棉花植株對脅迫的響應(yīng)；以及任選地 c.一個轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列； -使所述嵌合基因在脅迫條件下表達。
19.如權(quán)利要求1、3到12所述的棉花植株細胞、如權(quán)利要求2到12中任一項所述的棉花植株細胞或如權(quán)利要求 13所述的棉花植株，其中包含所述嵌合基因的植株與野生型植株相比顯示出正?；盍湍苡浴?br> 【文檔編號】A01H5/00GK103443279SQ201280006195
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2012年1月24日 優(yōu)先權(quán)日:2011年1月24日
【發(fā)明者】S·皮恩, B·登博爾 申請人:拜爾作物科學(xué)公司