新穎的抗真菌組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及新穎的抗真菌組合物，及其在處理農產品中的用途。
【專利說明】新穎的抗真菌組合物
【技術領域】
[0001]本發(fā)明公開了控制植物疾病和預防作物微生物腐敗(spoilage)的新穎的抗真菌組合物。
[0002]發(fā)明背景
[0003]據估計世界作物產量的約25%由于微生物腐敗而損失，其中真菌導致的腐敗是迄今為止最嚴重的原因。從經濟學觀點以及人道主義觀點(humane point)來看，預防食品腐敗都非常重要。畢竟世界上許多地方的人在遭受饑餓。
[0004]在抵抗植物和作物疾病以及減輕它們對產量和品質造成的損傷方面的成功大幅取決于殺真菌劑的及時應用。由于抗性現象的發(fā)生，許多殺真菌劑(例如苯并咪唑)的長期和頻繁使用促成了它們有效性的降低。
[0005] —類重要的新殺真菌劑是咪唑(imidazoles)。最公知的咪唑殺真菌劑是咪唑菌酮(fenamidone)(也稱作 RPA 407213 ;見 Mercer et al.1998)。在生物化學水平上，咪唑菌酮通過在酶泛氫醌:細胞色素C氧化還原酶(ubihydroquinone:cytochromec oxidoreductase)的水平上阻斷電子轉運,來抑制線粒體呼吸。咪唑菌酮由AventisCropScience開發(fā)，并于2001年首次出售。
[0006]另一種公知的咪唑殺真菌劑是抑霉唑(imazalil)。EP O 101 102 A2中描述了用于保護食品免受真菌腐敗的方法，其中食品被包裝在包含抑霉唑的膜中。EP O 748 588 Al公開了包含那他霉素和抑霉唑的聚乙烯乙酸酯包衣，及其在保護乳酪抵抗真菌生長中的用途。
[0007]盡管咪唑殺真菌劑已經顯示針對真菌的活性(見Mercer et al.1998),但是腐敗問題仍有發(fā)生。另外，若干研究顯示越來越多的真菌獲得了針對這些殺真菌劑的抗性(見例如 Kardin and Percich,1983)。
[0008]幾十年來,多烯大環(huán)內酯抗霉菌劑那他霉素(natamycin)已被用于預防食品如乳酪和香腸上的真菌生長。通過使用Streptomyces natalensis發(fā)酵生產的這一天然防腐劑在全世界被廣泛用作食物防腐劑，并且在食品工業(yè)中具有安全使用的悠久歷史。其針對所有已知的食物腐敗真菌都非常有效。盡管那他霉素在例如乳酪工業(yè)中被應用多年，但是迄今為止從未觀察到抗性真菌物種的發(fā)生。
[0009]因此可以得出結論:對更有效的、更加環(huán)境友好的、低毒性的和有害性更低的用于處理植物和作物中的真菌生長和植物和作物上的真菌生長的抗微生物組合物(例如抗真菌組合物)有嚴重的需求。

【發(fā)明內容】

[0010]本發(fā)明通過提供含有多烯抗真菌化合物和至少一種來自咪唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物的新的協同抗微生物(例如抗真菌)組合物，解決了上述問題。在本文中使用時，術語“協同的”表示組合使用時抗真菌化合物的組合效果大于他們各自使用時的效果之和。[0011 ] 通常，兩種活性成分的協同活性可以例如使用處理交互作用層(treatmentinteraction stratum,見Slinker, 1998)在方差分析模型中測試。相對有效性可以通過下式計算:((未經處理的對照的進化狀態(tài)值-組合物的進化狀態(tài)值)/ (未經處理的對照的進化狀態(tài)值))X 100。然后可以通過下式計算交互作用系數:((化合物A+化合物B的組合的相對有效性)/ (化合物A的相對有效性+化合物B的相對有效性))X 100。大于100的交互作用系數表示化合物之間的協同作用。
[0012]或者可以如下計算協同作用:可以通過計算與用對照組合物處理的產品上的霉菌生長相比，用活性成分處理的產品上觀察到的霉菌生長的減少，來測定個體活性成分的抗真菌活性(以％計)。可以根據Colby方程(Colby，1967)計算包含兩種活性成分的組合抗真菌組合物的預期抗真菌活性(E，以％計):E=X+Y - [ (X.Y) /100]，其中X和Y分別是個體活性成分X和Y的觀察到的抗真菌活性(以％計)。如果組合的觀察到的抗真菌活性(0，以％計)超出組合的預期抗真菌活性(E，以％計)并且因而協同因子0/Ε>1.0，那么活性成分的組合應用導致協同的抗真菌效應。 [0013]在本發(fā)明的一個實施方式中，至少一種來自咪唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物選自由氰霜唑(cyazofamid)、咪唑菌酮(fenamidone)、咪菌腈(fenapanil)、果綠P定(glyodin)、異瓦二酮(isovaledione)4S；iiJB(pefurazoate)和咪唑嗪(triazoxide)組成的組。在一個優(yōu)選的實施方式中，至少一種來自咪唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物選自由氰霜唑和咪唑菌酮組成的組。在一個實施方式中，組合物可還含有兩種或更多不同的來自咪唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物，例如組合物可包含氰霜唑和咪唑菌酮。應當理解，來自咪唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物的衍生物(包括但不限于來自咪唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物的鹽或溶劑合物)或來自咪唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物的經修飾的形式也可以應用在本發(fā)明的組合物中。含有咪唑殺真菌劑例如咪唑嗪的商業(yè)產品的例子是具有以下商品名的產品:Gaucho Orge⑩(吡蟲啉+戍唑醇+咪唑嗪)或Raxil S?(戍唑醇+咪唑嗪)。含有咪唑殺真菌劑如咪唑菌酮的商業(yè)產品的例子是具有以下商品名的產品:Censor ?(咪唑菌酮)、Reason ? (咪唑菌酮)、Consento ? (咪唑菌酮+霜霉威-HCI)或Verita ? (咪唑菌酮+三乙磷酸鋁)。含有咪唑殺真菌劑如氰霜唑的商業(yè)產品的例子是具有以下商品名的產品:Ranman ? 400SC (氰霜唑)。所述商業(yè)產品可以被并入本發(fā)明中。
[0014]在一個實施方式中，多烯抗真菌化合物選自由以下化合物組成的組:那他霉素、制霉菌素(nystatin)、兩性霉素B、三烯菌素(trienin)、意北霉素(etruscomycin)、菲律賓菌素(filipin)、欽氏菌素(chainin)、制皮菌素(dermostatin)、lymphosarcin、殺念珠菌素(candicidin)、金色制霉素(aureofungin)A、金色制霉素B、哈霉素(hamycin)A、哈霉素B和魯斯霉素(lucensomycin)。在一個優(yōu)選的實施方案中，多烯抗真菌化合物是那他霉素。在一個實施方案中，組合物也可含有兩種或更多種不同的多烯抗真菌化合物。應當理解，多烯抗真菌化合物的衍生物(包括但不限于多烯抗真菌化合物的鹽或溶劑合物)或經修飾形式的多烯抗真菌化合物也可以在本發(fā)明的組合物中應用。含有那他霉素的商業(yè)產品的一個例子是商品名為Delvocid⑧的產品。所述產品由DSM Food Specialties (荷蘭)生產，并且可以是含有例如50% (w/w)那他霉素的固體或是含有例如2-50% (w/v)那他霉素的液體。所述商業(yè)產品可以被并入本發(fā)明的組合物中。
[0015]本發(fā)明的組合物通常包含從約0.005g/l到約100g/l和優(yōu)選地從約0.01g/Ι到約50g/l的多烯抗真菌化合物。優(yōu)選地，所述量為0.01g/Ι到3g/l。[0016]本發(fā)明的組合物通常包含從約0.0001g/l到約2000g/l和優(yōu)選地從約0.0005g/l到約1500g/l的來自咪唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物。更優(yōu)選地，所述量為從0.001g/l到 1000g/l。
[0017]在一個實施方式中，本發(fā)明的組合物還包含至少一種選自下組的額外化合物，所述組由粘著劑(sticking agent)、載劑、著色劑、保護性膠體、粘合劑(adhesive)、除草劑、肥料、增稠劑、掩蔽劑、觸變劑、表面活性劑、其他抗微生物化合物、洗滌劑、防腐劑、鋪展劑、填充劑、噴霧油、流動添加劑、礦物質、溶劑、分散劑、乳化劑、濕潤劑、穩(wěn)定劑、消泡劑、緩沖劑、UV_吸收劑和抗氧化劑組成。其他抗微生物抗真菌化合物可以是抗真菌化合物(例如抑霉唑、噻苯達唑或百菌清)，或抵抗昆蟲、線蟲、螨蟲和/或細菌的化合物。當然，根據本發(fā)明的組合物也可以包含兩種或更多種任何上述額外的化合物。在兩種防抗真菌化合物被分別應用的情況下，任何上述額外的化合物也可以與多烯抗真菌化合物和/或至少一種來自咪唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物組合。在一個實施方式中，額外的化合物是特定用途(例如食物、飼料、藥物、化妝品或農業(yè))可接受的添加劑。適用于食物、飼料、藥物、化妝品或農業(yè)的額外的化合物是 本領域技術人員已知的。
[0018]在一個特定的實施方式中，其他抗微生物化合物是屬于亞磷酸鹽類的天然作物保護化合物，例如KH2PO3或K2HPO3或這兩種亞磷酸鹽的混合物。在本文中使用時，含亞磷酸根的化合物表示包含亞磷酸根即PO3 (以例如H2POpHPO廣或PO廣的形式)的化合物，或允許釋放亞磷酸根離子的任何化合物，包括化合物例如亞磷酸和膦酸及其衍生物如酯和/或堿金屬鹽或堿土金屬鹽。在本發(fā)明的組合物包含多烯抗真菌化合物(例如那他霉素)和至少一種含亞磷酸根的化合物的情況下，相對于每克多烯抗真菌化合物，它們優(yōu)選地包含0.1g或更少的木素磺酸鹽(Iignosulphonate),更優(yōu)選地0.1g或更少的多酹。優(yōu)選地，相對于每克多烯抗真菌化合物，它們包含0.01g或更少的木素磺酸鹽，更優(yōu)選地0.01g或更少的多酚。具體地，它們不含木素磺酸鹽，并優(yōu)選地不含多酚。含亞磷酸根的化合物的合適例子是亞磷酸及其(堿金屬或堿土金屬)鹽，例如亞磷酸鉀鹽例如KH2PO3和K2HPO3,亞磷酸鈉鹽和亞磷酸銨鹽，和亞磷酸的(C「C4)烷基酯及其鹽，例如乙基亞磷酸鋁(乙膦鋁(fosetyl-Al ))、乙基亞磷酸鈣、異丙基亞磷酸鎂、異丁基亞磷酸鎂、仲丁基亞磷酸鎂和正丁基亞磷酸鋁。當然，含亞磷酸根的化合物的混合物也包括在內。例如KH2PO3和K2HPO3的混合物可以通過例如向KH2PO3溶液中添加KOH或K2CO3至5.0 - 6.0的終pH來容易地獲得。如上文所指出的，作物或植物中被代謝成為亞磷酸鹽/酯化合物的前體-型化合物也可以包括在本發(fā)明的組合物中。其例子是膦酸酯，例如乙膦鋁復合物。在例如作物或植物中，該分子的膦酸乙基酯部分被代謝成為亞磷酸鹽/酯。這類化合物的一個例子是被稱作Aliette ? (Bayer，德國)的商業(yè)膦酸氫乙基酯(ethyl hydrogen phosphonate)。組合物中亞磷酸鹽/酯與那他霉素的比例(以重量計)一般在2:1到500:1 (w/w)之間,優(yōu)選地在3:1到300:1 (w/w)之間，更優(yōu)選地在5:1到200:1 (w/w)之間。
[0019]根據本發(fā)明的組合物可具有從I到10、優(yōu)選地從2到9、更優(yōu)選地從3到8、最優(yōu)選地從4到7的pH。它們可以是固體例如粉末組合物，或者可以是液體。本發(fā)明的組合物可以是水性或非水性的即用型組合物，但是也可以是水性或非水性的濃縮組合物/懸浮液，或在使用前必須用合適的稀釋劑例如水或緩沖體系稀釋的儲存組合物、懸浮液和/或溶液?；蛘撸景l(fā)明的組合物也可以被用于制備涂層乳液。本發(fā)明的組合物也可以具有濃縮干產品(例如粉末、顆粒和片劑)的形式。它們可以被用于制備用于對產品進行浸沒或噴霧的組合物，所述產品例如是農產品，包括植物、作物、蔬菜和/或水果。當然，當多烯抗真菌化合物和至少一種來自咪唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物作為獨立的組合物被施用時，以上也適用。
[0020]在另一個方面中，本發(fā)明涉及包含多烯抗真菌化合物和至少一種來自咪唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物的試劑盒。多烯抗真菌化合物和至少一種來自咪唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物可存在于兩個獨立的包裝(例如容器)中。試劑盒的組分可以是包裝中的干燥形式或是液體形式。需要時，試劑盒可包含用于溶解化合物的說明書。另外，試劑盒可含有用于應用化合物的說明書。
[0021]在另一方面，本發(fā)明涉及通過用多烯抗真菌化合物和至少一種來自咪唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物處理農產品來保護產品抵抗真菌的方法。另外，可以在用多烯抗真菌化合物和至少一種來自咪唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物處理產品之前、同時或之后，用其他抗真菌和/或抗微生物化合物處理產品?？梢酝ㄟ^多烯抗真菌化合物和至少一種來自咪唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物的順次應用來處理產品，或反之亦然?；蛘?，可以通過多烯抗真菌化合物和至少一種來自咪唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物的同時應用來處理產品。在同時應用的情況下，化合物可存在于被同時應用的不同的組合物中，或化合物可存在于單一組合物中。還在另一實施方式中，可以通過應用兩種抗真菌化合物的單獨模式或交替模式來處理產品。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及通過對產品應用多烯抗真菌化合物和至少一種來自咪唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物來處理產品的方法。通過應用化合物，能夠預防產品上或產品中的真菌生長。也就是說，化合物保護產品抵抗真菌生長和/或抵抗真菌感染和/或抵抗真菌腐敗?；衔镆部梢员挥糜谔幚硪呀浉腥菊婢漠a品。通過應用化合物，歸因于這些產品上或產品中真菌的疾病發(fā)生可以被減緩、停止，或產品甚至可以從疾病中痊愈。在本發(fā)明的一個實施方式中，用根據本發(fā)明的組合物或試劑盒處理產品。在一個實施方式中，產品是食物、飼料、藥物、化妝品或農產品。在一個優(yōu)選的實施方式中，產品是農廣品。
[0022]多烯抗真菌化合物和至少一種來自咪唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物、根據本發(fā)明的組合物和根據本發(fā)明的試劑盒可以通過噴霧被應用至產品。適用于將液體形式的這些化合物、組合物和試劑盒應用至產品的其他方法也是本發(fā)明的一部分。這些方法包括但不限于，浸潰(dipping)、燒水、浸透(drenching)、引入接收器(dump tank)中、蒸發(fā)、霧化(atomizing)、成霧(fogging)、熏蒸、涂抹、刷抹(brushing)、粉化(dusting)、起泡、鋪展、包裝和涂覆(例如借助于蠟或靜電)。另外，也可以將抗真菌化合物注射進土壤中。使用自動化系統的噴霧應用已知降低人力成本并且是成本有效的。為此目的可使用本領域技術人員公知的方法和設備。感染風險較高時，根據本發(fā)明的組合物也可以定期噴霧。感染風險較低時，噴霧間隔可以更長。取決于應用的類型，應用的多烯抗真菌化合物的用量可以從5ppm到10，OOOppm、優(yōu)選地從IOppm到5，OOOppm和最優(yōu)選地從20到1，OOOppm變化。取決于應用類型，被應用的至少一種來自咪唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物的用量可從IOppm到5，OOOppm、優(yōu)選地從20ppm到3，OOOppm和最優(yōu)選地從50到1，OOOppm變化。
[0023]在一個特定的實施方式中，可以在收獲后處理農產品。通過使用多烯抗真菌化合物和至少一種來自咪唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物，在較長的時間段中實現了收獲后和/或儲存疾病的控制，從而允許在長距離和在溫度與濕度方面具有不同的受控氣氛的多種儲存條件下運輸收獲的農產品。收獲后儲存病癥為例如皮孔斑點(lenticel spots)、枯萎(scorch)、衰老性分解(senescent breakdown)、苦陷癥(bitter pit)、褐斑(scald)、水核(water core)、褐化(browning)、維管分解(vascular breakdown)、CO2 損傷、CO2 或 O2不足、和軟化。真菌疾病可例如由以下真菌引起:Mycosphaerella spp.、Mycosphaerellamusae、Mycosphaerella fragariae、Mycosphaerella citri ;毛霉屬的物種(Mucor spp.)，例如 Mucor piriformis ；Monilinia spp.，例如 Monilinia fructigena、Monilinia Iaxa ；擬莖點霉屬的物種(Phomopsis spp.)、Phomopsis natalensis ；Colletotrichum spp.，例如 Colletotrichum musae、 Colletotrichum gloeosporioides、 Colletotrichumcoccodes ；Verticillium spp.， 例如 Verticillium theobromae ；Nigrospora spp.；Botrytis spp.，例如 Botrytis cinerea ；Diplodia spp.，例如 Diplodia citri ；Pezicula spp.；Alternaria spp.，例如 Alternaria citr1、Alternaria alternata ；Septoria spp.，例如 Septoria depressa ；Venturia spp.，例如 Venturia inaequalis、Venturia pyrina ；Rhizopus spp.， 例如 Rhizopus stolonifer、Rhizopus oryzae ；Glomerella spp.，例如 Glomerella cingulata ；Sclerotinia spp.，例如 Sclerotiniafruiticola ；Ceratocystis spp.，例如 Ceratocystis paradoxa ；Fusarium spp.，例如Fusarium semitectum、Fusarium moniliforme、Fusarium solan1、Fusarium oxysporum ；Cladosporium spp.， 例如 Cladosporium fulvum、 Cladosporium cladosporioides、Cladosporium cucumerinum、Cladosporium musae ;青霉菌屬的物種(Penicillium spp.)，例如繩狀青霉菌(Penicillium funiculosum)、擴展青霉菌(Penicillium expansum)、指狀青霉菌(Penicillium digitatum)、意大利青霉菌(Penicillium italicum)；Phytophthora spp.， 例如 Phytophthora citrophthora、Phytophthora fragariae、Phytophthora cactorum、Phytophthora parasitica ；Phacydiopycnis spp.， 例如Phacydiopycnis malirum ；Gloeosporium spp.，例如 Gloeosporium album、Gloeosporiumperennans、Gloeospor ium fructigenum、Gloeosporium singulata ；Geotrichum spp.，例如Geotrichum candidum ；Phlyctaena spp.，例如Phlyctaena vagabunda ；Cylindrocarponspp.，例如 Cylindrocarpon mali ；Stemphyllium spp.，例如 Stemphyllium vesicarium ；Thielaviopsis spp.，例如 Thielaviopsis paradoxy ;曲霉屬的物種(Aspergillus spp.),例如黑曲霉(Aspergillus niger)、Aspergillus carbonarius ；Nectria spp.，例如Nectria galligena ；Cercospora spp.，例如 Cercospora angrec1、Cercospora api1、Cercospora atrofiliformis、Cercospora musae、Cercospora zeae—maydis。
[0024]本發(fā)明的另一方面涉及多烯抗真菌化合物和至少一種來自咪唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物保護產品抵抗真菌的用途。如上文所述，化合物可以順次或同時使用(例如應用)。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及一種用途，其中根據本發(fā)明的組合物或試劑盒被應用至產品。在一個實施方式中，產品是食物、飼料、藥物、化妝品或農產品。在一個優(yōu)選的實施方式中，產品是農產品。
[0025]在一個特定的實施方式中，多烯抗真菌化合物和至少一種來自咪唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物可在藥物中被用于例如治療和/或預防真菌疾病。多烯抗真菌化合物和至少一種來自咪唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物可例如以藥物組合物的形式被使用。組合物可還包含藥物可接受的賦形劑?？拐婢衔锟煽诜┯没蚰c胃外施用。組合物的類型取決于施用途徑。
[0026]本發(fā)明的另一個方面涉及用多烯抗真菌化合物和至少一種來自咪唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物處理的產品。在一個實施方式中，用根據本發(fā)明的組合物或試劑盒處理產品。本發(fā)明因此涉及包含多烯抗真菌化合物和至少一種來自咪唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物的產品。經處理的產品的表面上和/或產品內可包含多烯抗真菌化合物和至少一種來自咪唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物?；蛘撸浱幚淼漠a品可包含涂層，所述涂層包含這些化合物。在一個實施方式中，經處理的產品表面上包含從0.000001到200mg/dm2、優(yōu)選地0.00001到100mg/dm2、更優(yōu)選地從0.00005到10mg/dm2的多烯抗真菌化合物。在另一個實施方式中，它們在表面上包含從0.000001到200mg/dm2、優(yōu)選地0.00001到100mg/dm2、更優(yōu)選地從0.00005到10mg/dm2的至少一種來自咪唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物。在一個實施方式中，產品是食物、飼料、藥物、化妝品或農產品。在一個優(yōu)選的實施方式中，產品是農產品。 [0027]在本文中使用時，術語“食品“應當被非常廣義地理解，包括但不限于，乳酪、奶油乳酪、碎乳酪、松軟干酪(cottage cheese)、經加工的乳酪、酸奶油、干燥的經發(fā)酵的肉制品，包括薩拉米香腸和其他香腸、葡萄酒、啤酒、酸乳、果汁和其他飲料、沙拉醬、松軟干酪醬(cottage cheese dressing)、蘸料、烘焙制品和烘焙填料、表面釉(surface glaze)和糖霜、涂抹醬、披薩餅餡料、糕餅和糕餅填料、橄欖、橄欖1?水(ο I i ve brine )、橄欖油、果汁、番茄泥和番茄糊、作料、和水果漿和其他類似的食品。
[0028]在本文中使用時，術語“飼料產品”也應當非常廣義地理解，包括但不限于寵物食物、肉雞飼料等等。
[0029]在本文中使用時，術語“藥物產品”也應當非常廣義地理解，包括包含活性分子例如藥物、藥劑或藥物化合物和任選地包含藥物可接受的賦形劑的產品，所述賦形劑即與活性分子組合用于制備合適或便利的劑型的任何惰性物質。
[0030]在本文中使用時，術語“化妝品產品”也應當非常廣義地理解，包括下述產品，所述產品被用于通過防止水分的蒸騰來保護或治療角質組織如皮膚和唇、頭發(fā)和指甲的干燥，并且護理組織以及給予這些組織良好的外觀。術語“化妝品組合物”涉及的產品包括但不限于保濕霜、個人清潔產品、閉合的藥物遞送貼片、指甲油、粉、擦拭片、護發(fā)素、皮膚處理乳液、剃須霜等等。
[0031]在本文中使用時，術語“農產品”也應當非常廣義地理解，包括但不限于谷物，例如小麥、大麥、裸麥、燕麥、水稻、高粱等等；甜菜，例如糖用甜菜(sugar beet)和飼料甜菜(fodder beet);梨果和核果和漿果，例如蘋果、梨、李子、杏、桃、杏仁、櫻桃、草莓、覆盆子和黑莓；豆科植物，例如豆子、扁豆、豌豆、大豆；油料植物，例如油菜、芥末、罌粟、橄欖、向日葵、椰子、蓖麻植物、可可、花生；葫蘆科，例如南瓜、小黃瓜(gherkins)、甜瓜、黃瓜、倭瓜、爺子；纖維植物，例如棉花、亞麻、大麻、黃麻；柑橘水果，例如橙、檸檬、葡萄柚、蜜桔、枸櫞；熱帶水果，例如木瓜、百香果、芒果、楊桃、菠蘿、香蕉、奇異果；蔬菜，例如菠菜、萵苣、蘆筍、十字花科如卷心菜和蕪菁、胡蘿卜、洋蔥、番茄、馬鈴薯、馬鈴薯種子(seed-potatoe)、尖辣椒(hot pepper)和甜椒；月桂樣植物,例如酪梨、肉桂、樟腦樹；或產品如玉米、煙草、堅果、咖啡、甘蔗、茶、葡萄藤、酒花、橡膠植物、以及觀賞植物例如切花、玫瑰、郁金香、百合、水仙花、藏紅花、風信子、大麗花、大丁草、康乃馨、倒掛金鐘(fuchsias)、菊花和球根花丼(f1wer buIbs )、灌木、落葉樹和常綠樹例如松柏植物、溫室植物和樹木。其包括但不限于植物及其部分、果實、種子、插條(cuttings)、栽培種、移植物、鱗莖、塊莖、根-塊莖、根莖、切花和蔬菜。
[0032]用于制備本文所述的組合物的方法是本發(fā)明的另一個方面。方法包括向至少一種來自咪唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物添加多烯抗真菌化合物?；衔锟衫绫粏为毜靥砑又了越M合物并混合，需要時隨后調節(jié)pH、粘度等等。如果單獨添加，則單獨的化合物中的一些或全部可以是粉末形式，但是替代性地，一些或全部也可以是液體形式。化合物也可例如以粉末形式被彼此添加并混合，以獲得粉末組合物。粉末狀的組合物可隨后被添加至水性組合物。
[0033]實施例
[0034]實施例1
[0035]收獲前應用
[0036]用真菌接種香蕉植物的葉。未經接種的葉被包括在內作為對照。接著，用組合物I (那他霉素)、組合物2 (氰霜唑)、組合物3 (咪唑菌酮)、組合物4 (咪菌腈)、組合物5 (果綠啶)、組合物6 (異瓦二酮)、組合物7 (稻瘟酯)、組合物8 (咪唑嗪)、組合物9 (那他霉素+氰霜唑)、組合物10 (那他霉素+咪唑菌酮)、組合物11 (那他霉素+咪菌腈)、組合物12 (那他霉素+果綠啶)、組合物13 (那他霉素+異瓦二酮)、組合物14 (那他霉素+稻瘟酯)或組合物15 (那他霉素+咪唑嗪)處理葉的確定部分。通過噴霧應用每種組合物。未經處理的葉也包括在內(未經處理的對照)。
[0037]獲得的結果顯示本發(fā)明的組合物保護香蕉植物免于真菌生長，還證明與活性化合物各自應用時的活性相比，本發(fā)明的組合物顯示協同增強的活性。
[0038]實施例2
[0039]收獲后應用
[0040]根據de Lapeyre de Bellaire and Dubois (1987)所述方法使香蕉受傷。使用木塞穿孔器對香蕉造成創(chuàng)傷，之后用真菌孢子污染。在室溫下孵育若干小時后，將香蕉浸在以下組合物之一中:a)無處理(對照l)、b)浸在水中(對照2)、c)浸在那他霉素中、d)浸在氰霜唑中、e)浸在咪唑菌酮中、f)浸在咪菌腈中、g)浸在果綠啶中、h)浸在異瓦二酮中、i)浸在稻瘟酯中、j)浸在咪唑嗪中、k)浸在那他霉素+氰霜唑中、I)浸在那他霉素+咪唑菌酮中、m)浸在那他霉素+咪菌腈中、η)浸在那他霉素+果綠啶中、ο)浸在那他霉素+異瓦二酮中、P)浸在那他霉素+稻瘟酯或q)浸在那他霉素+咪唑嗪中。在該處理后，將香蕉在閉合箱中于21°C和提高的濕度下孵育。每天視覺評價香蕉的真菌發(fā)展。
[0041]結果顯示與單獨的那他霉素或至少一種來自咪唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物相比，含有那他霉素和至少一種來自咪唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物的組合物更好地保護香蕉抵抗真菌。令人驚訝的是，那他霉素和至少一種來自咪唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物的組合應用導致感染的強烈的協同減少。
[0042]實施例3
[0043]處理香蕉
[0044]每個處理組使用四個有機的、未成熟的(綠色的)香蕉。根據deLapeyre deBellaire and Dubois (1987)所述方法,使用木塞鉆孔器對每個香蕉的皮造成三次創(chuàng)傷。隨后，用15 μ I含有I X IO5孢子/ml的Fusarium proliferatum懸浮液接種每個創(chuàng)口。在20°C下孵育4小時后，用100μ I新鮮制備的包含500ppm那他霉素(DSM Food Specialties,Delft,荷蘭)、2000ppm氰霜唑或二者兼有的水性抗真菌組合物處理每個香蕉創(chuàng)口。另外,抗真菌組合物包含1.00% (w/w)甲基羥乙基纖維素(MHEC)、0.40% (w/w)黃原膠、0.20% (w/w)消泡劑、0.30% (w/w)檸檬酸、0.39% (w/w)乳酸和0.11% (w/w)山梨酸鉀。組合物的pH為4.0。使用不含那他霉素和氰霜唑的組合物作為對照。
[0045]將經處理的、未成熟的香蕉在閉合箱中于暗中、20°C下和95%的相對空氣濕度中孵育，所述條件在存在飽和的Na2HPO4水溶液時獲得。閉合箱中包含成熟的(黃色的)香蕉，以提高乙烯氣體水平，從而誘導經處理的、未成熟的香蕉的成熟。
[0046]孵育期間，通過計算與用對照組合物處理的香蕉創(chuàng)口上的霉菌生長相比，用抗真菌組合物處理的香蕉創(chuàng)口上觀察到的霉菌生長的減少，來測定個體活性成分的抗真菌活性(以％計)。根據Colby方程(Colby, 1967)計算包含兩種活性成分的組合抗真菌組合物的預期抗真菌活性化，以％計):
[0047]E=X+Y - [ (X.Y)/100]
[0048]其中X和Y分別是個體活性成分X和Y的觀察到的抗真菌活性(以％計)。如果組合的觀察到的抗真菌活性(0，以％計)超出組合的預期抗真菌活性(E，以％計)并且因而協同因子0/Ε>1.0，那么活性成分的組合應用導致協同的抗真菌效應。
[0049]表1中的結果清楚地證明，與單獨的那他霉素或氰霜唑相比,包含500ppm那他霉素和2000ppm氰霜唑二者的抗真菌組合物保護香蕉更好地抵抗霉菌生長。
[0050]孵育21、23和24天后，對包含那他霉素和氟嘧菌酯二者的組合物所觀察到的抗真菌活性比預期的抗真菌活性高 6%到14%，并且獲得了 >1.0的協同因子(見表1)。
[0051]因此，500ppm那他霉素和2000ppm氰霜唑的組合在香蕉上具有協同的抗真菌活性。
[0052]實施例4
[0053]處理香蕉
[0054]如實施例3中所述進行實驗，不同之處是用100 μ I新鮮制備的包含250ppm那他霉素(DSM Food Specialties, Delft,荷蘭)、500ppm氰霜唑或二者兼有的水性抗真菌組合物處理每個接種的香蕉創(chuàng)口。根據實施例3中所述方法測定個體和組合的活性成分在香蕉上的抗真菌活性(以％計)。
[0055]表2中的結果顯示，在降低香蕉上霉菌生產的方面，包含250ppm那他霉素以及500ppm氰霜唑的組合物優(yōu)于包含那他霉素或氰霜唑任一的組合物。
[0056]孵育27天后，用包含那他霉素和氰霜唑二者的組合物所觀察到的抗真菌活性幾乎比預期的抗真菌活性高40%。因此，相應的協同因子遠超出1.0 (見表2)。
[0057]因此，250ppm那他霉素和500ppm氰霜唑的組合應用導致香蕉上霉菌生長的令人驚訝的強協同減少。
[0058]實施例5
[0059]處理香蕉
[0060]如實施例3中所述進行實驗，不同之處是用100 μ I新鮮制備的包含50ppm那他霉素(DSM Food Specialties，Delft，荷蘭)、250ppm氰霜唑或二者兼有的水性抗真菌組合物處理每個接種的香蕉創(chuàng)口。根據實施例3中所述方法測定個體和組合的活性成分在香蕉上的抗真菌活性(以％計)。
[0061]表3中的結果顯示，與單獨包含那他霉素或氰霜唑的組合物相比，包含50ppm那他霉素以及250ppm氰霜唑的組合抗真菌組合物更有效地保護香蕉抵抗香蕉上的霉菌生長。
[0062]孵育27天后，用包含那他霉素和氰霜唑二者的組合物所觀察到的抗真菌活性比預期的抗真菌活性高20%，這導致>1.0的協同因子(見表3)。[0063]總而言之，該實施例的結果證明，50ppm那他霉素和250ppm氰霜唑的組合應用協同降低了香蕉上的霉菌生長。
[0064]實施例6
[0065]處理草莓
[0066]每個處理組使用十二個新鮮的、有機的草莓。用0.5mm長的切口對每個草莓造成創(chuàng)傷，用10 μ I含有I X IO5孢子/ml的Botrytis cinerea懸浮液接種每個創(chuàng)口。在20°C下孵育2小時后，在新鮮制備的含有500ppm那他霉素(DSM Food Specialties，Delft，荷蘭)、1000ppm咪唑菌酮或二者兼有的水性抗真菌組合物中將每個草莓各自浸潰I分鐘?？拐婢M合物還包含1.00% (w/w)甲基羥乙基纖維素(MHEC)、0.40% (w/w)黃原膠、0.20% (w/w)消泡劑、0.30% (w/w)檸檬酸、0.39% (w/w)乳酸和0.11% (w/w)山梨酸鉀。組合物的pH為4。使用不含那他霉素和咪唑菌酮的組合物作為對照。
[0067]將經處理的草莓在閉合箱中于暗中和20°C下孵育3、4、5、7、8和9天。以雙重方式(twofold manner)評價草莓上霉菌生長的程度:(i)計數每12個草莓總數中長有霉菌的草莓數jP(ii)通過計算與用對照組合物處理的草莓上觀察到的霉菌生長相比，用抗真菌組合物處理的草莓上觀察到的霉菌生長的減少，來測定個體活性成分的抗真菌活性(以％計)。根據Colby方程(Colby, 1967)計算包含兩種活性成分的組合抗真菌組合物的預期抗真菌活性化，以％計):
[0068]E=X+Y - [ (X.Y)/100]
[0069]其中X和Y分別是個體活性成分X和Y的觀察到的抗真菌活性(以％計)。如果組合的觀察到的抗真菌活性(0，以％計)超出組合的預期抗真菌活性(E，以％計)并且因而協同因子0/Ε>1.0，那么活性成分的組合應用導致協同的抗真菌效應。
[0070]表4 (每12個草莓總數中長有霉菌的草莓數)和表5 (抗真菌活性)中的結果清楚地證實，與單獨的那他霉素或咪唑菌酮相比，包含500ppm那他霉素和1000ppm咪唑菌酮的抗真菌組合物在草莓上具有強得多的抗真菌活性。
[0071]孵育3天后，用對照組合物或咪唑菌酮任一單獨處理的所有12個草莓均長有霉菌，用那他霉素單獨處理的12個草莓中3個長有霉菌。然而，用包含那他霉素和咪唑菌酮的組合物處理的12個草莓中僅I個觀察到霉菌生長(見表4)。另外，第3天和第4天時，對包含那他霉素和咪唑菌酮二者的組合物觀察的抗真菌活性比預期的抗真菌活性分別超出14%和12%。因此，獲得了 >1.0的協同因子(見表5)。
[0072]孵育5天后，用對照組合物或咪唑菌酮任一單獨處理的所有12個草莓均長有霉菌，用那他霉素單獨處理的12個草莓中有11個長有霉菌。然而，用包含那他霉素和咪唑菌酮的組合物處理的12個草莓中僅有8個觀察到霉菌生長(見表4)。另外，對包含那他霉素和咪唑菌酮的組合的組合物所觀察到的抗真菌活性比預期的抗真菌活性高出>30%，這導致>1.0的協同因子(見表5)。
[0073] 孵育7、8和9天后，對包含那他霉素和咪唑菌酮二者的組合物觀察的抗真菌活性比預期的抗真菌活性高18%到26%。所述連續(xù)三天中的每一天相應的協同因子都超過1.0,并且從第7天的3.0提高至第8天和第9天的>18 (見表5)。
[0074]總而言之,500ppm那他霉素和1000ppm咪唑菌酮的組合應用在協同減少草莓上霉菌生長的方面極為有效。
[0075]實施例7
[0076]處理草莓
[0077]如實施例6中所述進行實驗，不同之處是在新鮮制備的含有50ppm那他霉素(DSMFood Specialties, Delft,荷蘭)、250ppm咪唑菌酮任一或二者兼有的水性抗真菌組合物中將每個有創(chuàng)口并且經接種的草莓各自浸潰I分鐘。孵育3、4、5、7、8和9天后，根據實施例6中所述的兩種方法針對霉菌生長評價經處理的草莓。
[0078]表6 (每12個草莓總數中長有霉菌的草莓數)和表7 (抗真菌活性)中的結果顯示，與單獨包含那他霉素或咪唑菌酮任一的組合物相比，包含250ppm那他霉素以及250ppm咪唑菌酮的抗真菌組合物在抑制草莓上霉菌生長方面更加成功。
[0079]孵育3、4和5天后，用對照組合物或咪唑菌酮任一單獨處理的所有12個草莓均長有霉菌，用那他霉素單獨處理的12個草莓中分別有3、5和10個長有霉菌。然而，對草莓應用那他霉素和咪唑菌酮的活性成分組合時，孵育3、4和5天后12個草莓分別僅有1、3和6個顯示霉菌生長(見表6)。另外，第3天、第4天和第5天時，對包含那他霉素和咪唑菌酮的組合物觀察的抗真菌活性比預期的抗真菌活性分別超出22%、28%和甚至44%。因此，這三天中每一天獲得的協同因子都>1.0,并且范圍從1.6到3.8 (見表7)。
[0080]孵育7、8和9天后，對包含那他霉素和咪唑菌酮二者的組合物觀察的抗真菌活性比預期的抗真菌活性高13%到20%。所述連續(xù)三天中的每一天相應的協同因子都超過1.0,并且甚至提高至第9天的>13 (見表7)。
[0081]因此，組合應用在草莓上時，50ppm那他霉素和250ppm咪唑菌酮之間存在抵抗真菌的令人驚訝的強協同活性。
[0082]實施例8
[0083]體外(In vitro)抗真菌活性
[0084]為了證實那他霉素與氰霜唑或咪唑菌酮的組合針對Botrytis cinerea的協同抗真菌活性，使用96孔微量滴定板進行體外實驗。測試以下的組合物:
[0085]-對照(無活性成分)，
[0086]-0.63ppm 那他霉素(DSM Food Specialties, Delft,荷蘭)，
[0087]-25ppm 氰霜唑，
[0088]-5Oppm 咪唑菌酮，
[0089]-0.63ppm那他霉素+25ppm氰霜唑，
[0090]-0.63ppm那他霉素+50ppm咪唑菌酮。
[0091]用92 μ I PCB培養(yǎng)基填充微量滴定板的每個孔后，從制備于PCB培養(yǎng)基或甲醇中的單獨的儲備溶液中添加活性成分，這導致每孔100 μ I的中間體積。隨后，使用制備于PCB培養(yǎng)基中的100 μ I Botrytis cinerea懸浮液，以2.5χ103孢子/ml接種每個孔。因此,每個孔含有200 μ I的終體積和〈1%的甲醇，這不影響B(tài)otrytis cinerea的生長(數據未展示)。
[0092]將微量滴定板在25°C下孵育7天后，通過計算與無活性成分時觀察到的霉菌生長相比，存在活性成分時觀察到的霉菌生長的減少，來評價個體活性成分的體外抗真菌活性(以％計)。根據Colby方程(Colby, 1967)計算活性成分組合的預期抗真菌活性(E,以％計):
[0093]E=X+Y - [ (X.Y)/100]
[0094]其中X和Y分別是個體活性成分X和Y的觀察到的抗真菌活性(以％計)。如果組合的觀察到的抗真菌活性(0，以％計)超出組合的預期抗真菌活性(E，以％計)并且因而協同因子0/Ε>1.0，那么活性成分的組合應用導致協同的抗真菌效應。
[0095]結果(見表8 )證明，與單獨的那他霉素、氰霜唑或咪唑菌酮相比，那他霉素+氰霜唑的組合和那他霉素+咪唑菌酮的組合均具有強得多的針對Botrytis cinerea的抗真菌活性。針對那他霉素+氰霜唑和那他霉素+咪唑菌酮的組合觀察到的抗真菌活性比預期的抗真菌活性高100%，因此得到大于1.0的協同因子。
[0096]該實施例的結果清楚地顯示，那他霉素和氰霜唑的組合應用以及那他霉素和咪唑菌酮的組合應用協同地抑制了 Botrytis cinerea的生長。
[0097]實施例9
[0098]體外抗真菌活性
[0099]如實施例8中所述進行實驗，不同之處在于測試以下的組合物:
[0100]-對照(無活性成分)，
[0101]-2.5ppm 那他霉素(DSM Food Specialties, Delft,荷蘭),
[0102]-50 或 75ppm 氰霜唑，
[0103]-2.5ppm那他霉素+50ppm氰霜唑，
[0104]-2.5ppm那他霉素+75ppm氰霜唑。
[0105]另外，使用Fusarium proliferatum接種。在25°C孵育5天后,根據實施例8中所述方法測定個體活性成分和組合的活性成分的抗真菌活性(以％計)。
[0106]表9中的結果證實，那他霉素+氰霜唑的活性成分組合比個體的那他霉素或氰霜唑更有效地抑制Fusarium proliferatum的生長。對包含那他霉素以及氰霜唑的組合物觀察到的抗真菌活性比預期的抗真菌活性超出50%到100%，這導致大于1.0的協同因子。
[0107]因此,那他霉素和氰霜唑的組合應用具有抵抗Fusarium proliferatum的強烈協同抗真菌活性。
[0108]表1.在20°C孵育后，包含500ppm那他霉素、2000ppm氰霜唑任一或二者兼有的組合物在香蕉上的抗真菌活性(％)。
[0109]
【權利要求】
1.包含多烯抗真菌化合物和選自下組的至少一種來自咪唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物的組合物，所述組由咪唑菌酮、氰霜唑、咪菌腈、果綠唳、異瓦二酮、稻痕酯和咪唑嗪組成。
2.根據權利要求1所述的組合物，其包含多烯抗真菌化合物和醚唑菌酮或氰霜唑。
3.根據權利要求1或2所述的組合物，其中所述多烯抗真菌化合物是那他霉素。
4.根據權利要求1到3中任一項所述的組合物，其中所述組合物還包含至少一種選自下組的額外的化合物，所述組由粘著劑、載劑、著色劑、保護性膠體、粘合劑、除草劑、肥料、增稠劑、掩蔽劑、觸變劑、表面活性劑、其他抗微生物化合物、洗滌劑、防腐劑、鋪展劑、填充劑、噴霧油、流動添加劑、礦物質、溶劑、分散劑、乳化劑、濕潤劑、穩(wěn)定劑、消泡劑、緩沖劑、UV-吸收劑和抗氧化劑組成。
5.根據權利要求1到4中任一項所述的組合物，其中所述多烯抗真菌化合物的量在從0.005g/l到約100g/l的范圍內，所述至少一種來自咪唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物的量在從約0.0OOlg/Ι到約2000g/l的范圍內。
6.包含多烯抗真菌化合物和選自下組的至少一種來自咪唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物的試劑盒，所述組由氰霜唑、咪唑菌酮、咪菌腈、果綠唳、異瓦二酮、稻痕酯和咪唑嗪組成。
7.通過用多烯抗真菌化合物和選自下組的至少一種來自咪唑殺真菌劑的抗真菌化合物處理產品來保護產品抵抗真菌的方法，所述組由氰霜唑、咪唑菌酮、咪菌腈、果綠啶、異瓦二酮、稻瘟酯和咪唑嗪組成。
8.根據權利要求7所述的方法，其中用根據權利要求1到5中任一項所述的組合物或根據權利要求6所述的試劑盒來處理所述產品。
9.根據權利要求7或8所述的方法，其中所述產品選自由食品、飼料產品、藥物產品、化妝品產品和農產品組成的組。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述產品是農產品。
11.根據權利要求10所述的方法，其中所述產品在收獲后被處理。
12.包含多烯抗真菌化合物和選自下組的至少一種來自咪唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物的產品，所述組由氰霜唑、咪唑菌酮、咪菌腈、果綠唳、異瓦二酮、稻痕酯和咪唑嗪組成。
13.根據權利要求12所述的產品，其中所述產品選自由食品、飼料產品、藥物產品、化妝品產品和農產品組成的組。
14.根據權利要求12或13所述的產品，其中所述產品是農產品。
15.多烯抗真菌化合物和選自下組的至少一種來自咪唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物用于保護產品抵抗真菌的用途，所述組由氰霜唑、咪唑菌酮、咪菌腈、果綠啶、異瓦二酮、稻瘟酯和咪唑嗪組成。
【文檔編號】A01N43/90GK103547157SQ201280011561
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2012年3月1日 優(yōu)先權日:2011年3月3日
【發(fā)明者】雅各布斯·斯塔克, 安格里克·里克·德 申請人:帝斯曼知識產權資產管理有限公司