新穎的抗真菌組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及新穎的抗真菌組合物，及其在處理農(nóng)產(chǎn)品中的用途。
【專利說明】新穎的抗真菌組合物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開了控制植物疾病和預(yù)防作物微生物腐敗(spoilage)的新穎的抗真菌組合物。
[0002]發(fā)明背景
[0003]據(jù)估計(jì)世界作物產(chǎn)量的約25%由于微生物腐敗而損失，其中真菌導(dǎo)致的腐敗是迄今為止最嚴(yán)重的原因。從經(jīng)濟(jì)學(xué)觀點(diǎn)以及人道主義觀點(diǎn)(humane point)來看，預(yù)防食品腐敗都非常重要。畢竟世界上許多地方的人在遭受饑餓。
[0004]在抵抗植物和作物疾病以及減輕它們對產(chǎn)量和品質(zhì)造成的損傷方面的成功大幅取決于殺真菌劑的及時(shí)應(yīng)用。由于抗性現(xiàn)象的發(fā)生，許多殺真菌劑(例如苯并咪唑)的長期和頻繁使用促成了它們有效性的降低。
[0005]—類重要的殺真菌劑是三唑(triazoles)。提出的第一種三唑是三唑酮(triadimefon)。這種三唑于1976年由拜耳首次提出(見Kuck et al.，1987)。三唑酮在植物中提供治療活性以及保護(hù)活性、低應(yīng)用率(low application rates)和極佳的再分布(redistribution)。過去二十年間提出了其他的三唑殺真菌劑，它們具有改進(jìn)的效能和植物安全性(例如氟環(huán)唑(epoxiconazole))、更寬的有效譜(例如丙環(huán)唑(propiconazole)、戍唑醇(tebuconazole))或?qū)ｉT的應(yīng)用(例如用于種子處理的苯醚甲環(huán)唑(difenoconazole)和滅菌唑(triticonazole))(見 Kuck et al.，1987)。除了在保護(hù)農(nóng)產(chǎn)品方面的用途——例如保護(hù)收獲的水果或蔬菜免受致植物病的真菌(見EP 2 036 438Al)或保護(hù)谷物免受真菌毒素污染(見WO 2007/009969)之外，三唑還被用于保護(hù)食品免受真菌腐蝕(見EP O 101 102 A2)。
[0006]然而，三唑殺真菌劑在其發(fā)展和維持中仍未對挑戰(zhàn)免疫。它們對植物具有眾所周知的副作用。應(yīng)用至幼 芽和根上常常降低伸長并導(dǎo)致葉更小、更厚和更綠。經(jīng)處理的植物可能在衰老方面被延遲，根據(jù)作物的不同這會(huì)阻礙收獲或提高產(chǎn)量(見Buchenauer, 1987)。
[0007]更大的擔(dān)心是抗性的發(fā)生，因?yàn)槿驓⒄婢鷦┚哂性S多與苯并咪唑相同的特性。對三唑殺真菌劑的抗性最初在白粉病中發(fā)生，也在其他疾病中觀察到過(見Kuck etal., 1987 ；Buchenauer, 1987 ；Ma et al.，2002)。另外，盡管三唑殺真菌劑的開創(chuàng)為子囊菌(Ascomycete)和擔(dān)子菌(Basidiomycete)疾病提供了有效的、系統(tǒng)性的殺真菌劑解決方案，但是破壞性的卵菌(Oomycete)疾病例如馬鈴薯晚疫病(potato late blight)和葡萄霜霉病(grape downy mildew)的控制受到限制，并且(由疫霉屬(Phytophthora)和腐酶屬(Pythium)導(dǎo)致的)長成的植物的根部腐朽和系統(tǒng)性霜霉病完全不能通過應(yīng)用三唑殺真菌劑來控制。
[0008]幾十年來,多烯大環(huán)內(nèi)酯抗霉菌劑那他霉素(natamycin)已被用于預(yù)防食品如乳酪和香腸上的真菌生長。例如，在EP O 748 588 Al中描述了包含多烯抗真菌劑和咪唑抗真菌劑的真菌組合物用于處理食品和農(nóng)產(chǎn)品的用途。通過使用Streptomyces natalensis發(fā)酵生產(chǎn)的這一天然防腐劑在全世界被廣泛用作食物防腐劑，并且在食品工業(yè)中具有安全使用的悠久歷史。其針對所有已知的食物腐敗真菌都非常有效。盡管那他霉素在例如乳酪工業(yè)中被應(yīng)用多年，但是迄今為止從未觀察到抗性真菌物種的發(fā)生。
[0009]因此可以得出結(jié)論:對更有效的用于處理植物和作物中的真菌生長和植物和作物上的真菌生長的抗微生物組合物(例如抗真菌組合物)具有嚴(yán)重的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明通過提供含有多烯抗真菌化合物和至少一種來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物的新的協(xié)同抗微生物(例如抗真菌)組合物，解決了上述問題。在本文中使用時(shí)，術(shù)語“協(xié)同的”表示組合使用時(shí)抗真菌化合物的組合效果大于他們各自使用時(shí)的效果之和。[0011 ] 通常，兩種活性成分的協(xié)同活性可以例如使用處理交互作用層(treatmentinteraction stratum,見Slinker, 1998)在方差分析模型中測試。相對有效性可以通過下式計(jì)算:((未經(jīng)處理的對照的進(jìn)化狀態(tài)值-組合物的進(jìn)化狀態(tài)值)/ (未經(jīng)處理的對照的進(jìn)化狀態(tài)值))X 1 00。然后可以通過下式計(jì)算交互作用系數(shù):((化合物A+化合物B的組合的相對有效性)/ (化合物A的相對有效性+化合物B的相對有效性))X 100。大于100的交互作用系數(shù)表示化合物之間的協(xié)同作用。
[0012]或者可以如下計(jì)算協(xié)同作用:可以通過計(jì)算與用對照組合物處理的產(chǎn)品上的霉菌生長相比，用活性成分處理的產(chǎn)品上觀察到的霉菌生長的減少，來測定個(gè)體活性成分的抗真菌活性(以％計(jì))。可以根據(jù)Colby方程(Colby，1967)計(jì)算包含兩種活性成分的組合抗真菌組合物的預(yù)期抗真菌活性(E，以％計(jì)):E=X+Y - [ (X.Y) /100]，其中X和Y分別是個(gè)體活性成分X和Y的觀察到的抗真菌活性(以％計(jì))。如果組合的觀察到的抗真菌活性(0，以％計(jì))超出組合的預(yù)期抗真菌活性(E，以％計(jì))并且因而協(xié)同因子0/Ε>1.0，那么活性成分的組合應(yīng)用導(dǎo)致協(xié)同的抗真菌效應(yīng)。
[0013]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，至少一種來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物選自由卩引唑橫菌胺(amisulbrom)、氧環(huán)唑(azaconazole)、聯(lián)苯三唑醇(bitertanol )、糖菌唑(bromuconazole)、環(huán)丙唑醇(cyproconazole)、節(jié)氯三唑醇(diclobutrazol)、苯醚甲環(huán)唑(difenoconazole)、烯唑醇(diniconazole)、高效烯唑醇(diniconazole-M)、氟環(huán)唑(epoxiconazole)、乙環(huán)唑啉(etaconazole)、臆苯唑(fenbuconazole)、三氟苯唑(fluotrimazole)、氟喹唑(fluquinconazole)、氟娃唑(flusilazole)、粉唑醇(flutriafol)、呋菌唑(furconazole)、順式呋菌唑(furconazole-cis)、己唑醇(hexaconazole)、環(huán)菌唑(huanjunzuo)、亞胺唑(imibenconazole)、種菌唑(ipconazole)、葉菌唑(metconazole)、臆菌唑(myclobutanil )、戍菌唑(penconazole)、丙環(huán)唑(propiconazole)、丙硫菌唑(prothioconazole)、喹唑(quinconazole)、娃氟唑(simeconazole)、戍唑醇(tebuconazole)、四氟醚唑(tetraconazole)、 丁三唑(triazbutil)、滅菌唑(triticonazole)、烯效唑(uniconazole)和烯效唑-P(uniconazole-P)組成的組。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，至少一種來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物選自由聯(lián)苯三唑醇、環(huán)丙唑醇、苯醚甲環(huán)唑、氟環(huán)唑、腈苯唑、氟喹唑、氟硅唑、粉唑醇、葉菌唑、腈菌唑、丙環(huán)唑、丙硫菌唑、戊唑醇、四氟醚唑、滅菌唑和烯效唑組成的組。在一個(gè)進(jìn)一步更優(yōu)選的實(shí)施方式中，至少一種來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物選自由苯醚甲環(huán)唑、氟環(huán)唑、氟喹唑、氟硅唑、粉唑醇、丙環(huán)唑、丙硫菌唑、戊唑醇和四氟醚唑組成的組。在一個(gè)實(shí)施方式中，組合物可還含有兩種或更多不同的來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物。應(yīng)當(dāng)理解，來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物的衍生物(包括但不限于來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物的鹽或溶劑合物)或來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物的經(jīng)修飾的形式也可以應(yīng)用在本發(fā)明的組合物中。含有三唑殺真菌劑例如丙環(huán)唑的商業(yè)產(chǎn)品的例子是具有以下商品名的產(chǎn)品:Tilt? (丙環(huán)唑)、Propimax ? (丙環(huán)唑)、Bumper ?〔丙環(huán)唑)、Quilt? (丙環(huán)唑+卩密菌酯)或Stratego ? (丙環(huán)唑+廂菌酯)。含有三唑殺真菌劑如戊唑醇的商業(yè)產(chǎn)品的例子是具有以下商品名的產(chǎn)品=Folicur ? (戊唑醇)、Orius ? (戍唑醇)、Uppercut ? (戍唑醇)或Headline SBR? (戍唑醇+批唑醚菌酯)。含有三唑殺真菌劑如四氟醚唑、葉菌唑或丙硫菌唑的商業(yè)產(chǎn)品的例子分別是具有以下商品名的產(chǎn)品:Domark:? (四氟醚唑)、Twinline ? (葉菌唑+卩比唑醚菌酯)或Stratego YLD ? (丙硫菌唑+肟菌酯)或Proline? (丙硫菌唑)。所述商業(yè)產(chǎn)品可以被并入本發(fā)明中。
[0014]在一個(gè)實(shí)施方式中，多烯抗真菌化合物選自由以下化合物組成的組:那他霉素、制霉菌素(nystatin)、兩性霉素B、三烯菌素(trienin)、意北霉素(etruscomycin)、菲律賓菌素(filipin)、欽氏菌素(chainin)、制皮菌素(dermostatin)、lymphosarcin、殺念珠菌素(candicidin)、金色制霉素(aureofungin)A、金色制霉素B、哈霉素(hamycin)A、哈霉素B和魯斯霉素(lucensomycin)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，多烯抗真菌化合物是那他霉素。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物也可含有兩種或更多種不同的多烯抗真菌化合物。應(yīng)當(dāng)理解，多烯抗真菌化合物的衍生物(包括但不限于多烯抗真菌化合物的鹽或溶劑合物)或經(jīng)修飾形式的多烯抗真菌化合物也可以在本發(fā)明的組合物中應(yīng)用。含有那他霉素的商業(yè)產(chǎn)品的一個(gè)例子是商品名為Delvocid ?的產(chǎn)品。所述產(chǎn)品由DSM Food Specialties (荷蘭)生產(chǎn)，并且可以是含有例如50% (w/w)那他霉素的固體或是含有例如2-50% (w/v)那他霉素的液體。所述商業(yè)產(chǎn)品可以被并入本發(fā)明的組合物中。
[0015]本發(fā)明的組合物通常包含從約0.005g/l到約100g/l和優(yōu)選地從約0.0lg/Ι到約50g/l的多烯抗真菌化合物。優(yōu)選地，所述量為0.0lg/Ι到3g/l。
[0016]本發(fā)明的組合物通常包含從約0.0001g/l到約2000g/l和優(yōu)選地從約0.0005g/l到約1500g/l的來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物。更優(yōu)選地，所述量為從0.001g/l到 1000g/l。
[0017]在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物還包含至少一種選自下組的額外化合物，所述組由粘著劑(sticking agent)、載劑、著色劑、保護(hù)性膠體、粘合劑(adhesive)、除草劑、肥料、增稠劑、掩蔽劑、觸變劑、表面活性劑、其他抗微生物化合物、洗滌劑、防腐劑、鋪展劑、填充劑、噴霧油、流動(dòng)添加劑、礦物質(zhì)、溶劑、分散劑、乳化劑、濕潤劑、穩(wěn)定劑、消泡劑、緩沖齊[J、UV_吸收劑和抗氧化劑組成。其他抗微生物抗真菌化合物可以是抗真菌化合物(例如抑霉唑、噻苯達(dá)唑或百菌清)，或抵抗昆蟲、線蟲、螨蟲和/或細(xì)菌的化合物。當(dāng)然，根據(jù)本發(fā)明的組合物也可以包含兩種或更多種任何上述額外的化合物。在兩種防抗真菌化合物被分別應(yīng)用的情況下，任何上述額外的化合物也可以與多烯抗真菌化合物和/或至少一種來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物組合。在一個(gè)實(shí)施方式中，額外的化合物是特定用途(例如食物、飼料、藥物、化妝品或農(nóng)業(yè))可接受的添加劑。適用于食物、飼料、藥物、化妝品或農(nóng)業(yè)的額外的化合物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
[0018]在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，其他抗微生物化合物是屬于亞磷酸鹽類的天然作物保護(hù)化合物，例如KH2PO3或K2HPO3或這兩種亞磷酸鹽的混合物。在本文中使用時(shí)，含亞磷酸根的化合物表示包含亞磷酸根即PO3 (以例如H2POpHPO廣或PO廣的形式)的化合物，或允許釋放亞磷酸根離子的任何化合物，包括化合物例如亞磷酸和膦酸及其衍生物如酯和/或堿金屬鹽或堿土金屬鹽。在本發(fā)明的組合物包含多烯抗真菌化合物(例如那他霉素)和至少一種含亞磷酸根的化合物的情況下，相對于每克多烯抗真菌化合物，它們優(yōu)選地包含0.1g或更少的木素磺酸鹽(Iignosulphonate),更優(yōu)選地0.1g或更少的多酹。優(yōu)選地，相對于每克多烯抗真菌化合物，它們包含0.0lg或更少的木素磺酸鹽，更優(yōu)選地0.0lg或更少的多酚。具體地，它們不含木素磺酸鹽，并優(yōu)選地不含多酚。含亞磷酸根的化合物的合適例子是亞磷酸及其(堿金屬或堿土金屬)鹽，例如亞磷酸鉀鹽例如KH2PO3和K2HPO3,亞磷酸鈉鹽和亞磷酸銨鹽，和亞磷酸的(C「C4)烷基酯及其鹽，例如乙基亞磷酸鋁(乙膦鋁(fosetyl-Al ))、乙基亞磷酸鈣、異丙基亞磷酸鎂、異丁基亞磷酸鎂、仲丁基亞磷酸鎂和正丁基亞磷酸鋁。當(dāng)然，含亞磷酸根的化合物的混合物也包括在內(nèi)。例如KH2PO3和K2HPO3的混合物可以通過例如向KH2PO3溶液中添加KOH或K2CO3至5.0 - 6.0的終pH來容易地獲得。如上文所指出的，作物或植物中被代謝成為亞磷酸鹽/酯化合物的前體-型化合物也可以包括在本發(fā)明的組合物中。其例子是膦酸酯，例如乙膦鋁復(fù)合物。在例如作物或植物中，該分子的膦酸乙基酯部分被代謝成為亞磷酸鹽/酯。這類化合物的一個(gè)例子是被稱作Aliette⑩(Bayer，德國)的商業(yè)膦酸氫乙基酯(ethyl hydrogen phosphonate)。組合物中亞磷酸鹽/酯與那他霉素的比例(以重量計(jì))一般在2:1到500:1 (w/w)之間,優(yōu)選地在3:1到300:1 (w/w)之間，更優(yōu)選地在5:1到200:1 (w/w)之間。
[0019]根據(jù)本發(fā)明的組合物可具有從I到10、優(yōu)選地從2到9、更優(yōu)選地從3到8、最優(yōu)選地從4到7的pH。它們可以是固體例如粉末組合物，或者可以是液體。本發(fā)明的組合物可以是水性或非水性的即用型組合物，但是也可以是水性或非水性的濃縮組合物/懸浮液，或在使用前必須用合適的稀釋劑例如水或緩沖體系稀釋的儲(chǔ)存組合物、懸浮液和/或溶液?；蛘撸景l(fā)明的組合物也可以被用于制備涂層乳液。本發(fā)明的組合物也可以具有濃縮干產(chǎn)品(例如粉末、顆粒和片劑)的形式。它們可以被用于制備用于對產(chǎn)品進(jìn)行浸沒或噴霧的組合物，所述產(chǎn)品例如是農(nóng)產(chǎn)品，包括植物、作物、蔬菜和/或水果。當(dāng)然，當(dāng)多烯抗真菌化合物和至少一種來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物作為獨(dú)立的組合物被施用時(shí)，以上也適用。
[0020]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及包含多烯抗真菌化合物和至少一種來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物的試劑盒。多烯抗真菌化合物和至少一種來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物可存在于兩個(gè)獨(dú)立的包裝(例如容器)中。試劑盒的組分可以是包裝中的干燥形式或是液體形式。需要時(shí)，試劑盒可包含用于溶解化合物的說明書。另外，試劑盒可含有用于應(yīng)用化合物的說明書。
[0021]在另一方面，本發(fā)明涉及通過用多烯抗真菌化合物和至少一種來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物處理農(nóng)產(chǎn)品來保護(hù)產(chǎn)品抵抗真菌的方法。另外，可以在用多烯抗真菌化合物和至少一種來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物處理產(chǎn)品之前、同時(shí)或之后，用其他抗真菌和/或抗微生物化合物處理產(chǎn)品。可以通過多烯抗真菌化合物和至少一種來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物的順次應(yīng)用來處理產(chǎn)品，或反之亦然?；蛘?，可以通過多烯抗真菌化合物和至少一種來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物的同時(shí)應(yīng)用來處理產(chǎn)品。在同時(shí)應(yīng)用的情況下，化合物可存在于被同時(shí)應(yīng)用的不同的組合物中，或化合物可存在于單一組合物中。還在另一實(shí)施方式中，可以通過應(yīng)用兩種抗真菌化合物的單獨(dú)模式或交替模式來處理產(chǎn)品。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及通過對產(chǎn)品應(yīng)用多烯抗真菌化合物和至少一種來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物來處理產(chǎn)品的方法。通過應(yīng)用化合物，能夠預(yù)防產(chǎn)品上或產(chǎn)品中的真菌生長。也就是說，化合物保護(hù)產(chǎn)品抵抗真菌生長和/或抵抗真菌感染和/或抵抗真菌腐敗?；衔镆部梢员挥糜谔幚硪呀?jīng)感染真菌的產(chǎn)品。通過應(yīng)用化合物，歸因于這些產(chǎn)品上或產(chǎn)品中真菌的疾病發(fā)生可以被減緩、停止，或產(chǎn)品甚至可以從疾病中痊愈。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，用根據(jù)本發(fā)明的組合物或試劑盒處理產(chǎn)品。在一個(gè)實(shí)施方式中，產(chǎn)品是食物、飼料、藥物、化妝品或農(nóng)產(chǎn)品。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，產(chǎn)品是農(nóng)廣品。
[0022]多烯抗真菌化合物和至少一種來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物、根據(jù)本發(fā)明的組合物和根據(jù)本發(fā)明的試劑盒可以通過噴霧被應(yīng)用至產(chǎn)品。適用于將液體形式的這些化合物、組合物和試劑盒應(yīng)用至產(chǎn)品的其他方法也是本發(fā)明的一部分。這些方法包括但不限于，浸潰(dipping)、燒水、浸透(drenching)、弓丨入接收器(dump tank)中、蒸發(fā)、霧化(atomizing)、成霧(fogging)、熏蒸、涂抹、刷抹(brushing)、粉化(dusting)、起泡、鋪展、包裝和涂覆(例如借助于蠟或靜電)。另外，也可以將抗真菌化合物注射進(jìn)土壤中。使用自動(dòng)化系統(tǒng)的噴霧應(yīng)用已知降低人力成本并且是成本有效的。為此目的可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法和設(shè)備。感染風(fēng)險(xiǎn)較高時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的組合物也可以定期噴霧。感染風(fēng)險(xiǎn)較低時(shí)，噴霧間隔可以更長。取決于應(yīng)用的類型，應(yīng)用的多烯抗真菌化合物的用量可以從5ppm到10，OOOppm、優(yōu)選地從IOppm到5，OOOppm和最優(yōu)選地從20到1，OOOppm變化。取決于應(yīng)用類型，被應(yīng)用的至少一種來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物的用量可從IOppm到5，OOOppm、優(yōu)選地從20ppm到3，OOOppm和最優(yōu)選地從50到1，OOOppm變化。
[0023]在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，可以在收獲后處理農(nóng)產(chǎn)品。通過使用多烯抗真菌化合物和至少一種來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物，在較長的時(shí)間段中實(shí)現(xiàn)了收獲后和/或儲(chǔ)存疾病的控制，從而允許在長距離和在溫度與濕度方面具有不同的受控氣氛的多種儲(chǔ)存條件下運(yùn)輸收獲的農(nóng)產(chǎn)品。收獲后儲(chǔ)存病癥為例如皮孔斑點(diǎn)(lenticel spots)、枯萎(scorch)、衰老性分解(senescent breakdown)、苦陷癥(bitter pit)、褐斑(scald)、水核(water core)、褐化(browning)、維管分解(vascular breakdown)、CO2 損傷、CO2 或 O2不足、和軟化。真菌疾病可例如由以下真菌引起:Mycosphaerella spp.、Mycosphaerellamusae、Mycosphaerella fragariae、Mycosphaerella citri ;毛霉屬的物種(Mucor spp.)，例如 Mucor piriformis ；Monilinia spp.，例如 Monilinia fructigena、Monilinia Iaxa ；擬莖點(diǎn)霉屬的物種(Phomopsis spp.)、Phomopsis natalensis ；Colletotrichum spp.，例如 Colletotrichum musae、 Colletotrichum gloeosporioides、 Colletotrichumcoccodes ；Verticillium spp.， 例如 Verticillium theobromae ；Nigrospora spp.；Botrytis spp.，例如 Botrytis cinerea ；Diplodia spp.，例如 Diplodia citri ；Pezicula spp.；Alternaria spp.，例如 Alternaria citr1、Alternaria alternata ；Septoria spp.，例如 Septoria depressa ；Venturia spp.，例如 Venturia inaequalis、Venturia pyrina ；Rhizopus spp.， 例如 Rhizopus stolonifer、Rhizopus oryzae ；Glomerella spp.，例如 Glomerella cingulata ；Sclerotinia spp.，例如 Sclerotiniafruiticola ；Ceratocystis spp.,例如 Ceratocystis paradoxa ；Fusarium spp.,例如Fusarium semitectum、Fusarium moniliforme、Fusarium solan1、Fusarium oxysporum ；Cladosporium spp., 例如 Cladosporium fulvum、 Cladosporium cladosporioides、Cladosporium cucumerinum>Cladosporium musae ;青霉菌屬的物種(Penicillium spp.),例如繩狀青霉菌(Penicillium funiculosum)、擴(kuò)展青霉菌(Penicillium expansum)、指狀青霉菌(Penicillium digitatum)、意大利青霉菌(Penicillium italicum)；Phytophthora spp., 例如 Phytophthora citrophthora、Phytophthora fragariae、Phytophthora cactorum、Phytophthora parasitica ；Phacydiopycnis spp., 例如Phacydiopycnis malirum ；Gloeosporium spp.,例如 Gloeosporium album、Gloeosporiumperennans、Gloeosporium fructigenum、Gloeosporium singulata ；Geotrichum spp.,例如Geotrichum candidum ；Phlyctaena spp.,例如Phlyctaena vagabunda ；Cylindrocarponspp.,例如 Cylindrocarpon mali ；Stemphyllium spp.,例如 Stemphyllium vesicarium ；Thielaviopsis spp.,例如Thielaviopsis paradoxy ;曲霉屬的物種(Aspergillus spp.),例如黑曲霉(Aspergillus niger)、Aspergillus carbonarius ；Nectria spp.,例如Nectria galligena ；Cercospora spp.,例如 Cercospora angrec1、Cercospora api1、Cercospora atrofiliformis> Cercospora musae、Cercospora zeae—maydis。
[0024]本發(fā)明的另一方面涉及多烯抗真菌化合物和至少一種來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物保護(hù)產(chǎn)品抵抗真菌的用途。如上文所述，化合物可以順次或同時(shí)使用(例如應(yīng)用)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種用途，其中根據(jù)本發(fā)明的組合物或試劑盒被應(yīng)用至產(chǎn)品。在一個(gè)實(shí)施方式中，產(chǎn)品是.食物、飼料、藥物、化妝品或農(nóng)產(chǎn)品。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，產(chǎn)品是農(nóng)產(chǎn)品。
[0025]在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，多烯抗真菌化合物和至少一種來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物可在藥物中被用于例如治療和/或預(yù)防真菌疾病。多烯抗真菌化合物和至少一種來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物可例如以藥物組合物的形式被使用。組合物可還包含藥物可接受的賦形劑?？拐婢衔锟煽诜┯没蚰c胃外施用。組合物的類型取決于施用途徑。
[0026]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用多烯抗真菌化合物和至少一種來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物處理的產(chǎn)品。在一個(gè)實(shí)施方式中，用根據(jù)本發(fā)明的組合物或試劑盒處理產(chǎn)品。本發(fā)明因此涉及包含多烯抗真菌化合物和至少一種來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物的產(chǎn)品。經(jīng)處理的產(chǎn)品的表面上和/或產(chǎn)品內(nèi)可包含多烯抗真菌化合物和至少一種來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物?；蛘撸?jīng)處理的產(chǎn)品可包含涂層，所述涂層包含這些化合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，經(jīng)處理的產(chǎn)品表面上包含從0.000001到200mg/dm2、優(yōu)選地
0.00001到100mg/dm2、更優(yōu)選地從0.00005到10mg/dm2的多烯抗真菌化合物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，它們在表面上包含從0.000001到200mg/dm2、優(yōu)選地0.00001到100mg/dm2、更優(yōu)選地從0.00005到10mg/dm2的至少一種來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，產(chǎn)品是食物、飼料、藥物、化妝品或農(nóng)產(chǎn)品。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，產(chǎn)品是農(nóng)產(chǎn)品。
[0027]在本文中使用時(shí)，術(shù)語“食品“應(yīng)當(dāng)被非常廣義地理解，包括但不限于，乳酪、奶油乳酪、碎乳酪、松軟干酪(cottage cheese)、經(jīng)加工的乳酪、酸奶油、干燥的經(jīng)發(fā)酵的肉制品，包括薩拉米香腸和其他香腸、葡萄酒、啤酒、酸乳、果汁和其他飲料、沙拉醬、松軟干酪醬(cottage cheese dressing)、蘸料、烘焙制品和烘焙填料、表面釉(surface glaze)和糖霜、涂抹醬、披薩餅餡料、糕餅和糕餅填料、橄欖、橄欖1?水(ο I i ve brine )、橄欖油、果汁、番茄泥和番茄糊、作料、和水果漿和其他類似的食品。
[0028]在本文中使用時(shí)，術(shù)語“飼料產(chǎn)品”也應(yīng)當(dāng)非常廣義地理解，包括但不限于寵物食物、肉雞飼料等等。
[0029]在本文中使用時(shí)，術(shù)語“藥物產(chǎn)品”也應(yīng)當(dāng)非常廣義地理解，包括包含活性分子例如藥物、藥劑或藥物化合物和任選地包含藥物可接受的賦形劑的產(chǎn)品，所述賦形劑即與活性分子組合用于制備合適或便利的劑型的任何惰性物質(zhì)。
[0030]在本文中使用時(shí)，術(shù)語“化妝品產(chǎn)品”也應(yīng)當(dāng)非常廣義地理解，包括下述產(chǎn)品，所述產(chǎn)品被用于通過防止水分的蒸騰來保護(hù)或治療角質(zhì)組織如皮膚和唇、頭發(fā)和指甲的干燥，并且護(hù)理組織以及給予這些組織良好的外觀。術(shù)語“化妝品組合物”涉及的產(chǎn)品包括但不限于保濕霜、個(gè)人清潔產(chǎn)品、閉合的藥物遞送貼片、指甲油、粉、擦拭片、護(hù)發(fā)素、皮膚處理乳液、剃須霜等等。
[0031]在本文中使用時(shí)，術(shù)語“農(nóng)產(chǎn)品”也應(yīng)當(dāng)非常廣義地理解，包括但不限于谷物，例如小麥、大麥、裸麥、燕麥、水稻、高粱等等；甜菜，例如糖用甜菜(sugar beet)和飼料甜菜(fodder beet);梨果和核果和漿果，例如蘋果、梨、李子、杏、桃、杏仁、櫻桃、草莓、覆盆子和黑莓；豆科植物，例如豆子、扁豆、豌豆、大豆；油料植物，例如油菜、芥末、罌粟、橄欖、向日葵、椰子、蓖麻植物、可可、花生；葫蘆科，例如南瓜、小黃瓜(gherkins)、甜瓜、黃瓜、倭瓜、爺子；纖維植物，例如棉花、亞麻`、大麻、黃麻；柑橘水果，例如橙、檸檬、葡萄柚、蜜桔、枸櫞；熱帶水果，例如木瓜、百香果、芒果、楊桃、菠蘿、香蕉、奇異果；蔬菜，例如菠菜、萵苣、蘆筍、十字花科如卷心菜和蕪菁、胡蘿卜、洋蔥、番茄、馬鈴薯、馬鈴薯種子(seed-potatoe)、尖辣椒(hot pepper)和甜椒；月桂樣植物，例如酪梨、肉桂、樟腦樹；或產(chǎn)品如玉米、煙草、堅(jiān)果、咖啡、甘蔗、茶、葡萄藤、酒花、橡膠植物、以及觀賞植物例如切花、玫瑰、郁金香、百合、水仙花、藏紅花、風(fēng)信子、大麗花、大丁草、康乃馨、倒掛金鐘(fuchsias)、菊花和球根花丼(flower bulbs)、灌木、落葉樹和常綠樹例如松柏植物、溫室植物和樹木。其包括但不限于植物及其部分、果實(shí)、種子、插條(cuttings)、栽培種、移植物、鱗莖、塊莖、根-塊莖、根莖、切花和蔬菜。
[0032]用于制備本文所述的組合物的方法是本發(fā)明的另一個(gè)方面。方法包括向至少一種來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物添加多烯抗真菌化合物?；衔锟衫绫粏为?dú)地添加至水性組合物并混合，需要時(shí)隨后調(diào)節(jié)pH、粘度等等。如果單獨(dú)添加，則單獨(dú)的化合物中的一些或全部可以是粉末形式，但是替代性地，一些或全部也可以是液體形式。化合物也可例如以粉末形式被彼此添加并混合，以獲得粉末組合物。粉末狀的組合物可隨后被添加至水性組合物。
實(shí)施例
[0033]實(shí)施例1
[0034]收獲前應(yīng)用
[0035]用真菌接種香蕉植物的葉。未經(jīng)接種的葉被包括在內(nèi)作為對照。接著，用組合物I (那他霉素)、組合物2 (聯(lián)苯三唑醇)、組合物3 (環(huán)丙唑醇)、組合物4 (苯醚甲環(huán)唑)、組合物5 (腈苯唑)、組合物6 (氟硅唑)、組合物7 (粉唑醇)、組合物8 (葉菌唑)、組合物9 (腈菌唑)、組合物10 (丙環(huán)唑)、組合物11 (丙硫菌唑)、組合物12 (戊唑醇)、組合物13 (四氟醚唑)、組合物14 (滅菌唑)、組合物15 (烯效唑)、組合物16 (那他霉素+聯(lián)苯三唑醇)、組合物17 (那他霉素+環(huán)丙唑醇)、組合物18 (那他霉素+苯醚甲環(huán)唑)、組合物19 (那他霉素+腈苯唑)、組合物20 (那他霉素+氟硅唑)、組合物21 (那他霉素+粉唑醇)、組合物22 (那他霉素+葉菌唑)、組合物23 (那他霉素+腈菌唑)、組合物24 (那他霉素+丙環(huán)唑)、組合物25(那他霉素+丙硫菌唑)、組合物26 (那他霉素+戊唑醇)、組合物27 (那他霉素+四氟醚唑)、組合物28 (那他霉素+滅菌唑)和組合物29 (那他霉素+烯效唑)處理葉的確定部分。通過噴霧應(yīng)用每種組合物。未經(jīng)處理的葉也包括在內(nèi)(未經(jīng)處理的對照)。
[0036]獲得的結(jié)果顯示本發(fā)明的組合物保護(hù)香蕉植物免于真菌生長，還證明與活性化合物各自應(yīng)用時(shí)的活性相比，本發(fā)明的組合物顯示協(xié)同增強(qiáng)的活性。
[0037]實(shí)施例2
[0038]收獲后應(yīng)用
[0039]根據(jù)de Lapeyre de Bellaire and Dubois (1987)所述方法使香蕉受傷。使用木塞穿孔器對香蕉造成創(chuàng)傷，之后用真菌孢子污染。在室溫下孵育若干小時(shí)后，將香蕉浸在以下組合物之一中:a)無處理(對照l)、b)浸在水中(對照2)、c)浸在那他霉素中、d)浸在聯(lián)苯三唑醇中、e)浸在 環(huán)丙唑醇中、f)浸在苯醚甲環(huán)唑中、g)浸在腈苯唑中、h)浸在氟硅唑中、i)浸在粉唑醇中、j)浸在葉菌唑中、k)浸在腈菌唑中、I)浸在丙環(huán)唑中、m)浸在丙硫菌唑中、η)浸在戊唑醇中、O)浸在四氟醚唑中、P)浸在滅菌唑中、q)浸在烯效唑中、r)浸在那他霉素+聯(lián)苯三唑醇中、s)浸在那他霉素+環(huán)丙唑醇中、t)浸在那他霉素+苯醚甲環(huán)唑中、u)浸在那他霉素+腈苯唑中、V)浸在那他霉素+氟硅唑中、w)浸在那他霉素+粉唑醇中、X)浸在那他霉素+葉菌唑中、y)浸在那他霉素+腈菌唑中、z)浸在那他霉素+丙環(huán)唑中、zl)浸在那他霉素+丙硫菌唑中、z2)浸在那他霉素+戊唑醇中、z3)浸在那他霉素+四氟醚唑中、z4)浸在那他霉素+滅菌唑中、z5)浸在那他霉素+烯效唑中。在該處理后，將香蕉在閉合箱中于21°C和提高的濕度下孵育。每天視覺評價(jià)香蕉的真菌發(fā)展。
[0040]結(jié)果顯示與單獨(dú)的那他霉素或至少一種來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物相比，含有那他霉素和至少一種來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物的組合物更好地保護(hù)香蕉抵抗真菌。令人驚訝的是，那他霉素和至少一種來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物的組合應(yīng)用導(dǎo)致感染的強(qiáng)烈的協(xié)同減少。
[0041]實(shí)施例3
[0042]處理香蕉
[0043]每個(gè)處理組使用四個(gè)有機(jī)的、未成熟的(綠色的)香蕉。根據(jù)de Lapeyre deBellaire and Dubois (1987)所述方法,使用木塞鉆孔器對每個(gè)香蕉的皮造成三次創(chuàng)傷。隨后，用15 μ I含有I X IO5孢子/ml的Fusarium proliferatum懸浮液接種每個(gè)創(chuàng)口。在20°C下孵育4小時(shí)后，用100μ I新鮮制備的包含500ppm那他霉素(DSM Food Specialties,Delft,荷蘭)、IOOOppm丙環(huán)唑或二者兼有的水性抗真菌組合物處理每個(gè)香蕉創(chuàng)口。另外,抗真菌組合物包含1.00% (w/w)甲基羥乙基纖維素(MHEC)、0.40% (w/w)黃原膠、0.20% (w/w)消泡劑、0.30% (w/w)朽1檬酸、0.39% (w/w)乳酸和0.11% (w/w)山梨酸鉀。組合物的pH為4.0。使用不含那他霉素和丙環(huán)唑的組合物作為對照。將經(jīng)處理的、未成熟的香蕉在閉合箱中于暗中、20°C下和95%的相對空氣濕度中孵育，所述條件在存在飽和的Na2HPO4水溶液時(shí)獲得。在孵育的最初20天期間，閉合箱中包含成熟的(黃色的)香蕉，以提高乙烯氣體水平，從而誘導(dǎo)經(jīng)處理的、未成熟的香蕉的成熟。
[0044]孵育39和42天后，通過計(jì)數(shù)每12個(gè)創(chuàng)口的總數(shù)中長有霉菌的創(chuàng)口總數(shù)來測定香蕉上的霉菌生長程度。
[0045]表I中的結(jié)果清楚地證明，與單獨(dú)的那他霉素或丙環(huán)唑相比，包含500ppm那他霉素和IOOOppm丙環(huán)唑二者的抗真菌組合物保護(hù)香蕉更好地抵抗霉菌生長。
[0046]孵育39和42天后，用單獨(dú)的對照組合物或那他霉素處理的所有12個(gè)創(chuàng)口均顯示霉菌生長，而單獨(dú)用丙環(huán)唑處理的12個(gè)創(chuàng)口中的4個(gè)有霉菌生長。然而，用包含那他霉素和丙環(huán)唑二者的組合物處理時(shí)，孵育39天后12個(gè)創(chuàng)口均無霉菌生長，孵育42天后12個(gè)創(chuàng)口中僅I個(gè)有霉菌能夠(見表I)。
[0047]因此，500ppm那他霉素和IOOOppm丙環(huán)唑的組合在香蕉上具有協(xié)同的抗真菌活性。
[0048]實(shí)施例4
[0049]處理香蕉
[0050]如實(shí)施例3中所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不同之處是用100 μ I新鮮制備的包含500ppm那他霉素(DSM Food Specialties, Delft,荷蘭)、150ppm丙環(huán)唑或二者兼有的水性抗真菌組合物處理每個(gè)接種的香蕉創(chuàng)口。
[0051]孵育期間， 以雙重方式(twofold manner)評價(jià)香蕉上霉菌生長的程度:(i)計(jì)算每12個(gè)創(chuàng)口的總數(shù)中長有霉菌的創(chuàng)口數(shù)jP(ii)通過計(jì)算與用對照組合物處理的香蕉創(chuàng)口上的霉菌生長相比，用抗真菌組合物處理的香蕉創(chuàng)口上觀察到的霉菌生長的減少，來測定個(gè)體活性成分的抗真菌活性(以％計(jì))。根據(jù)Colby方程(Colby，1967)計(jì)算包含兩種活性成分的組合抗真菌組合物的預(yù)期抗真菌活性(E，以％計(jì)):
[0052]E=X+Y - [ (X.Y)/100]
[0053]其中X和Y分別是個(gè)體活性成分X和Y的觀察到的抗真菌活性(以％計(jì))。如果組合的觀察到的抗真菌活性(0，以％計(jì))超出組合的預(yù)期抗真菌活性(E，以％計(jì))并且因而協(xié)同因子0/Ε>1.0，那么活性成分的組合應(yīng)用導(dǎo)致協(xié)同的抗真菌效應(yīng)。
[0054]表2 (每12個(gè)創(chuàng)口的總數(shù)中長有霉菌的創(chuàng)口數(shù))和表3 (抗真菌活性)中的結(jié)果清楚地證明，與單獨(dú)的那他霉素或丙環(huán)唑相比，包含500ppm那他霉素和150ppm丙環(huán)唑二者的組合物更有效地降低香蕉上的霉菌生長。
[0055]孵育26天后，用對照組合物處理的所有12個(gè)創(chuàng)口均顯示霉菌生長，而單獨(dú)用那他霉素處理的12個(gè)創(chuàng)口中的8個(gè)有霉菌生長，單獨(dú)用丙環(huán)唑處理的12個(gè)創(chuàng)口中9個(gè)有霉菌生長。然而，用包含那他霉素和丙環(huán)唑二者的組合物處理的12個(gè)創(chuàng)口中沒有霉菌生長(見表2)。另外，對包含那他霉素和丙環(huán)唑二者的組合物觀察到的抗真菌活性比預(yù)期的抗真菌活性高8%，這導(dǎo)致>1.0的協(xié)同因子(見表3)。
[0056]孵育27、28、29、31和32天后，用對照組合物或丙環(huán)唑單獨(dú)處理的所有12個(gè)創(chuàng)口均顯示霉菌生長，單獨(dú)用那他霉素處理的12個(gè)創(chuàng)口中8個(gè)有霉菌生長。然而，使用包含那他霉素和丙環(huán)唑二者的組合物處理時(shí)，在第27、28和29天12個(gè)創(chuàng)口中均未觀察到霉菌生長，第31和32天時(shí)12個(gè)創(chuàng)口中僅有I個(gè)觀察到霉菌生長(見表2)。另外，孵育27和32天之間，對那他霉素和丙環(huán)唑二者的活性成分組合所觀察到的抗真菌活性比預(yù)期的抗真菌活性超出8%到18%，并且獲得了 >1.0的協(xié)同因子(見表3)。
[0057]因此，500ppm那他霉素和150ppm丙環(huán)唑的組合應(yīng)用協(xié)同降低了香蕉上的霉菌生長。
[0058]實(shí)施例5
[0059]處理香蕉
[0060]如實(shí)施例3中所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不同之處是用100 μ I新鮮制備的包含250ppm那他霉素(DSM Food Specialties, Delft,荷蘭)、500ppm丙環(huán)唑或二者兼有的水性抗真菌組合物處理每個(gè)接種的香蕉創(chuàng)口。孵育期間，根據(jù)實(shí)施例4中所述的兩種方法評價(jià)香蕉創(chuàng)口上的霉菌生長程度。
[0061]表4 (每12個(gè)創(chuàng)口總數(shù)中長有霉菌的創(chuàng)口數(shù))和表5 (抗真菌活性)中的結(jié)果顯示，在減少香蕉上霉菌生長方面，包含250ppm那他霉素以及500ppm丙環(huán)唑二者的抗真菌組合物優(yōu)于單獨(dú)包含那他霉素或單獨(dú)包含丙環(huán)唑的組合物。
[0062]孵育34和36天后，用對照組合物或那他霉素單獨(dú)處理的所有12個(gè)創(chuàng)口中均觀察到霉菌生長，用丙環(huán)唑單獨(dú)處理的所有12個(gè)創(chuàng)口中的10個(gè)觀察到霉菌生長。然而，用那他霉素和丙環(huán)唑的活性成分組合處理時(shí)，34天后12個(gè)創(chuàng)口中僅7個(gè)長有霉菌，36天后12個(gè)創(chuàng)口中僅8個(gè)長有霉菌(見表4)。另外,孵育34天和36天后,對包含那他霉素和丙環(huán)唑二者的組合物觀察到的抗真菌活性比預(yù)期的抗真菌活性分別超出11%和21%。因此，得到>1.0的協(xié)同因子(見表5)。
[0063]孵育39和42天后，針對包含那他霉素和丙環(huán)唑的組合物觀察的抗真菌活性比預(yù)期的抗真菌活性分別高32%和38%。因此，協(xié)同因子從第34天的1.1提高至第39天的1.8和第42天的2.1 (見表5)。
[0064]總而言之，該實(shí)施例的結(jié)果清楚地證明，應(yīng)用在香蕉上時(shí)250ppm那他霉素和500ppm丙環(huán)唑的組合的抗真菌活性是協(xié)同的。
[0065]實(shí)施例6
[0066]處理香蕉
[0067]如實(shí)施例3中所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不同之處是用100 μ I新鮮制備的包含250ppm那他霉素(DSM Food Specialties,Delft,荷蘭)、50ppm丙環(huán)唑或二者兼有的水性抗真菌組合物處理每個(gè)接種的香蕉創(chuàng)口。根據(jù)實(shí)施例4中所述方法測定經(jīng)處理的香蕉創(chuàng)口上個(gè)體和組合的活性成分的抗真菌活性(以％計(jì))。
[0068]表6中的結(jié)果顯示，包含250ppm那他霉素和50ppm丙環(huán)唑二者的抗真菌組合物具有比單獨(dú)的那他霉素或丙環(huán)唑更強(qiáng)的抗真菌活性。
[0069]孵育23、27和29天后，針對那他霉素和丙環(huán)唑的活性成分組合所實(shí)際觀察的抗真菌活性比預(yù)期的抗真菌活性高8%到18%，這導(dǎo)致>1.0的協(xié)同因子。
[0070]因此，該實(shí)施例的結(jié)果清楚地證明香蕉上250ppm那他霉素和50ppm丙環(huán)唑的協(xié)同抗真菌活性。
[0071]實(shí)施例7
[0072]處理香蕉[0073]如實(shí)施例3中所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不同之處是用100 μ I新鮮制備的包含50ppm那他霉素(DSM Food Specialties, Delft,荷蘭)、250ppm丙環(huán)唑或二者兼有的水性抗真菌組合物處理每個(gè)接種的香蕉創(chuàng)口。根據(jù)實(shí)施例4中所述的兩種方法評價(jià)香蕉創(chuàng)口上的霉菌生長程度。
[0074]表7 (每12個(gè)創(chuàng)口總數(shù)中長有霉菌的創(chuàng)口數(shù))和表8 (抗真菌活性)中的結(jié)果顯示，與單獨(dú)包含那他霉素或單丙環(huán)唑的組合物相比，包含50ppm那他霉素以及250ppm丙環(huán)唑二者的組合抗真菌組合物保護(hù)香蕉更有效地抵抗香蕉上的霉菌生長。
[0075]孵育29天后，用對照組合物或那他霉素單獨(dú)處理的所有12個(gè)創(chuàng)口均顯示霉菌生長，單獨(dú)用丙環(huán)唑處理的12個(gè)創(chuàng)口中5個(gè)有霉菌生長。然而，用包含那他霉素和丙環(huán)唑二者的組合物處理的12個(gè)創(chuàng)口中沒有霉菌生長(見表7)。另外，對包含那他霉素和丙環(huán)唑二者的組合物觀察到的抗真菌活性比預(yù)期的抗真菌活性高7%，這導(dǎo)致>1.0的協(xié)同因子(見表8)。
[0076]孵育32天后，用對照組合物或那他霉素單獨(dú)處理的所有12個(gè)創(chuàng)口均顯示霉菌生長，單獨(dú)用丙環(huán)唑處理的 12個(gè)創(chuàng)口中8個(gè)有霉菌生長。然而，用包含那他霉素和丙環(huán)唑二者的組合物處理的12個(gè)創(chuàng)口中僅2個(gè)有霉菌生長(見表7)。另外，對包含那他霉素和丙環(huán)唑二者的組合物觀察到的抗真菌活性比預(yù)期的抗真菌活性高7%，獲得了 >1.0的協(xié)同因子(見表8)。
[0077]孵育34天后，用對照組合物或那他霉素單獨(dú)處理的所有12個(gè)創(chuàng)口均顯示霉菌生長，單獨(dú)用丙環(huán)唑處理的12個(gè)創(chuàng)口中10個(gè)有霉菌生長。然而，用包含那他霉素和丙環(huán)唑二者的組合物處理的12個(gè)創(chuàng)口中僅4個(gè)有霉菌生長(見表7)。另外，對包含那他霉素和丙環(huán)唑二者的組合物觀察到的抗真菌活性比預(yù)期的抗真菌活性高10%。因此，協(xié)同因子超過1.0(見表8)。
[0078]孵育36、39和42天后，用對照組合物、那他霉素或丙環(huán)唑單獨(dú)處理的所有12個(gè)創(chuàng)口中均有霉菌生長。然而，在創(chuàng)傷上應(yīng)用包含那他霉素和丙環(huán)唑二者的組合物時(shí)，第36天12個(gè)創(chuàng)口中僅5個(gè)觀察到霉菌生長，第39天12個(gè)創(chuàng)口中僅8個(gè)觀察到霉菌生長，第42天12個(gè)創(chuàng)口中僅10個(gè)觀察到霉菌生長(見表7)。另外，孵育36、39和42天后，對那他霉素和丙環(huán)唑的活性成分組合所觀察到的抗真菌活性比預(yù)期的抗真菌活性分別超出10%、30%和37%。因此，協(xié)同因子從第29、32和34天的1.1提高至第36天的1.2、第39天的1.5和第42天的1.8 (見表8)。
[0079]因此，50ppm那他霉素和250ppm丙環(huán)唑的組合應(yīng)用導(dǎo)致對香蕉上霉菌生長的令人驚訝的強(qiáng)協(xié)同減少。
[0080]實(shí)施例8
[0081]處理香蕉
[0082]如實(shí)施例3中所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不同之處是用100 μ I新鮮制備的包含500ppm那他霉素(DSM Food Specialties, Delft，荷蘭)、250ppm丙硫菌唑或二者兼有的水性抗真菌組合物處理每個(gè)接種的香蕉創(chuàng)口。使用不含那他霉素和丙硫菌唑的組合物作為對照。孵育27天和29天后通過計(jì)數(shù)每12個(gè)創(chuàng)口總數(shù)中長有霉菌的創(chuàng)口數(shù)，來測定香蕉上的霉菌生長程度。
[0083]表9中的結(jié)果顯示，與單獨(dú)的那他霉素或丙硫菌唑相比，包含500ppm那他霉素和250ppm丙硫菌唑二者的組合物更加成功地限制了香蕉上的霉菌生長。
[0084]孵育27、28和29天后，用對照組合物處理的所有12個(gè)創(chuàng)口均長有霉菌。另外，單獨(dú)用那他霉素處理的創(chuàng)口中8個(gè)觀察到霉菌生長，單獨(dú)用丙硫菌唑處理的創(chuàng)口中10個(gè)觀察到霉菌生長。然而，用包含那他霉素和丙硫菌唑的組合物處理的12個(gè)創(chuàng)口中僅2個(gè)長有霉菌(見表9)。
[0085]總而言之，香蕉上500ppm那他霉素和250ppm丙硫菌唑的活性成分組合具有協(xié)同的抗真菌活性。
[0086]實(shí)施例9
[0087]處理香蕉
[0088]如實(shí)施例3中所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不同之處是用100 μ I新鮮制備的包含250ppm那他霉素(DSM Food Specialties, Delft,荷蘭)、IOOppm丙硫菌唑或二者兼有的水性抗真菌組合物處理每個(gè)接種的香蕉創(chuàng)口。使用不含那他霉素和丙硫菌唑的組合物作為對照。如實(shí)施例8中所述測定霉菌生長程度。
[0089]表10中的結(jié)果證明，與單獨(dú)的那他霉素或丙硫菌唑相比，包含250ppm那他霉素和IOOppm丙硫菌唑二者的組合物更好地保護(hù)香蕉抵抗霉菌生長。
[0090]孵育27、28和29天后，用對照組合物或那他霉素單獨(dú)處理的所有12個(gè)創(chuàng)口均長有霉菌。單獨(dú)用丙硫菌唑處理的12創(chuàng)口中，11個(gè)在第27天顯示霉菌生長，12個(gè)在第28天和29天顯示霉菌生長。然而，孵育27、28和29天后，用包含那他霉素和丙硫菌唑的組合物處理的12個(gè)創(chuàng)口中僅9個(gè)長有霉菌(見表10)。
[0091]該實(shí)施例清楚地顯示，作為活性成分組合應(yīng)用在香蕉上時(shí)，250ppm那他霉素和IOOppm丙硫菌唑之間存在協(xié)同 的抗真菌活性。
[0092]實(shí)施例10
[0093]處理草莓
[0094]每個(gè)處理組使用十二個(gè)新鮮的、有機(jī)的草莓。用0.5mm長的切口對每個(gè)草莓造成創(chuàng)傷，用10 μ I含有I X IO5孢子/ml的Botrytis cinerea懸浮液接種每個(gè)創(chuàng)口。在20°C下孵育2小時(shí)后，在新鮮制備的含有250ppm那他霉素(DSM Food Specialties，Delft，荷蘭)、500ppm丙硫菌唑或二者兼有的水性抗真菌組合物中將每個(gè)草莓各自浸潰I分鐘?？拐婢M合物還包含1.00% (w/w)甲基羥乙基纖維素(MHEC)、0.40% (w/w)黃原膠、0.20% (w/w)消泡劑、0.30% (w/w)朽1檬酸、0.39% (w/w)乳酸和0.11% (w/w)山梨酸鉀。組合物的pH為4.0。使用不含那他霉素和丙硫菌唑的組合物作為對照。將經(jīng)處理的草莓在閉合箱中于暗中和20°C下孵育3天。
[0095]在孵育2和3天后，以雙重方式評價(jià)草莓上的霉菌生長:(i)計(jì)數(shù)每12個(gè)草莓總數(shù)中長有霉菌的草莓?dāng)?shù)量；和(ii)根據(jù)實(shí)施例4中所述的Colby方法(Colby，1967)，通過計(jì)算與用對照組合物處理的草莓上的霉菌生長相比，用抗真菌組合物處理的草莓上觀察到的霉菌生長的減少，來測定個(gè)體和組合的活性成分的抗真菌活性(以％計(jì))。
[0096]表11 (每12個(gè)草莓總數(shù)中長有霉菌的草莓?dāng)?shù))和表12 (抗真菌活性)中的結(jié)果證實(shí)，與單獨(dú)的那他霉素或丙硫菌唑相比，包含250ppm那他霉素和500ppm丙硫菌唑的抗真菌組合物在草莓上具有更強(qiáng)的抗真菌活性。
[0097]孵育2天后，用對照組合物或丙硫菌唑單獨(dú)處理的所有12個(gè)草莓均顯示霉菌生長，而用那他霉素單獨(dú)處理的12個(gè)草莓中10個(gè)長有霉菌。然而，用包含那他霉素和丙硫菌唑二者的組合物處理的12個(gè)草莓中僅6個(gè)觀察到霉菌生長(見表11)。另外，對包含那他霉素和丙硫菌唑二者的組合物觀察的抗真菌活性比預(yù)期的抗真菌活性超出14%，這導(dǎo)致>1.0的協(xié)同因子(見表12)。
[0098]孵育3天后，用對照組合物、那他霉素或丙硫菌唑任一單獨(dú)處理的所有12個(gè)草莓顯示霉菌生長。然而，用包含那他霉素和丙硫菌唑的組合物處理的12個(gè)草莓中僅有8個(gè)觀察到霉菌生長(見表11)。另外，對包含那他霉素和丙硫菌唑的組合的組合物所觀察到的抗真菌活性比預(yù)期的抗真菌活性高出10%，獲得了 >1.0的協(xié)同因子(見表12)。
[0099]因此,250ppm那他霉素和500ppm丙硫菌唑的組合應(yīng)用協(xié)同減少了草莓上的霉菌生長。
[0100]實(shí)施例11
[0101]處理蜜桔(mandarins)
[0102]每個(gè)處理組使用十個(gè)新鮮的有機(jī)蜜桔。根據(jù)de Lapeyre de Bellaire and Dubois(1987)所述方法，使用木塞鉆孔器對每個(gè)蜜桔的皮造成一次創(chuàng)傷。隨后，用10μ1含有I X IO4孢子/ml的Penicillium italicum懸浮液接種每個(gè)創(chuàng)口。在20°C下孵育2小時(shí)后，在新鮮制備的包含500ppm那他霉素(DSM Food Specialties, Delft,荷蘭)、600ppm丙硫菌唑或二者兼有的水性抗真菌組合物中將蜜桔各自浸潰I分鐘。另外，抗真菌組合物包含3.1% (w/w)蜂臘、0.76% (w/w)甘油、0.66% (w/w)聚氧乙烯山梨聚糖單硬脂酸酯(Tween60),0.03% (w/w)甲基羥乙基纖維素(MHEC)、0.02% (w/w)黃原膠、0.02% (w/w)消泡劑、
0.15% (w/w)檸檬酸和0.01% (w /w)山梨酸鉀。組合物的pH為4.0。使用不含那他霉素和丙硫菌唑的組合物作為對照。
[0103]將經(jīng)處理的蜜桔在閉合箱中于暗中、20°C下孵育，并在孵育25、28、31和34天后評價(jià)霉菌生長。根據(jù)實(shí)施例4中所述的Colby方法(Colby, 1967),通過計(jì)算與用對照組合物處理的蜜桔上的霉菌生長相比，用抗真菌組合物處理的蜜桔上觀察到的霉菌生長的減少，來測定個(gè)體和組合的活性成分的抗真菌活性(以％計(jì))。
[0104]表13中的結(jié)果證明，在預(yù)防蜜桔上霉菌生長方面，包含500ppm那他霉素和600ppm丙硫菌唑的抗真菌組合物優(yōu)于單獨(dú)包含那他霉素或單獨(dú)包含丙環(huán)唑的組合物。
[0105]孵育25、28、31和34天后，針對包含那他霉素和丙環(huán)唑二者的組合物觀察到的抗真菌活性分別比預(yù)期的抗真菌活性高6%、12%、32%和38%。因此，協(xié)同因子從第25天的1.1提高至第34天的1.4 (見表13)。
[0106]因此，500ppm那他霉素和600ppm丙環(huán)唑的組合應(yīng)用協(xié)同地減少了蜜桔上的霉菌生長。
[0107]實(shí)施例12
[0108]處理蜜桔
[0109]如實(shí)施例11中所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不同之處在于在新鮮制備的包含250ppm那他霉素(DSM Food Specialties, Delft,荷蘭)、150ppm丙硫菌唑或二者兼有的水性抗真菌組合物中將每個(gè)有創(chuàng)口的經(jīng)接種的蜜桔各自浸潰I分鐘。根據(jù)實(shí)施例4中所述的Colby方法，在孵育13、16、21、26、29和34天后評價(jià)蜜桔上個(gè)體活性成分和組合活性成分的抗真菌活性(以％計(jì))。[0110]結(jié)果(見表14)顯示，與單獨(dú)的那他霉素或單獨(dú)的丙硫菌唑相比，包含250ppm那他霉素和150ppm丙硫菌唑的抗真菌組合物更有效地降低蜜桔上的霉菌生長。
[0111]孵育13、16、21、26、29和34天后，針對那他霉素和丙硫菌唑的活性成分組合所觀察的抗真菌活性比預(yù)期的抗真菌活性分別超出10%、15%、17%、28%、35%和38%。協(xié)同因子從第13天的1.1提高至第34天的2.4 (見表14)。
[0112]因此可以得出結(jié)論:250ppm那他霉素和150ppm丙硫菌唑的組合應(yīng)用導(dǎo)致蜜桔上霉菌生長的協(xié)同降低。
[0113]實(shí)施例13
[0114]體外(In vitro)抗真菌活性
[0115]為了證實(shí)那他霉素與丙環(huán)唑或丙硫菌唑的組合針對Botrytis cinerea的協(xié)同抗真菌活性，使用96孔微量滴定板進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。測試以下的組合物:
[0116]-對照(無活性成分)，
[0117]-0.63 或 1.25ppm 那他霉素(DSM Food Specialties, Delft,荷蘭),
[0118]-0.50 或 1.0Oppm 丙環(huán)唑，
[0119]-0.13ppm 丙硫菌唑，
[0120]-0.63ppm 那他霉素 +1.0Oppm 丙環(huán)唑，
[0121]-1.25ppm 那他霉素 +`0.50ppm 丙環(huán)唑，
[0122]-1.25ppm那他霉素+0.13ppm丙硫菌唑。
[0123]用92 μ I PCB培養(yǎng)基填充微量滴定板的每個(gè)孔后，從制備于PCB培養(yǎng)基或甲醇中的單獨(dú)的儲(chǔ)備溶液中添加活性成分，這導(dǎo)致每孔100 μ I的中間體積。隨后，使用制備于PCB培養(yǎng)基中的100 μ I Botrytis cinerea懸浮液，以2.5χ103孢子/ml接種每個(gè)孔。因此,每個(gè)孔含有200 μ I的終體積和〈1%的甲醇，這不影響B(tài)otrytis cinerea的生長(數(shù)據(jù)未展示)。
[0124]將微量滴定板在25°C下孵育5和10天后，通過計(jì)算與無活性成分時(shí)觀察到的霉菌生長相比，存在活性成分時(shí)觀察到的霉菌生長的減少，來評價(jià)個(gè)體活性成分的體外抗真菌活性(以％計(jì))。根據(jù)Colby方程(Colby, 1967)計(jì)算活性成分組合的預(yù)期抗真菌活性(E,以％計(jì)):
[0125]E=X+Y - [ (X.Y)/100]
[0126]其中X和Y分別是個(gè)體活性成分X和Y的觀察到的抗真菌活性(以％計(jì))。如果組合的觀察到的抗真菌活性(0，以％計(jì))超出組合的預(yù)期抗真菌活性(E，以％計(jì))并且因而協(xié)同因子0/Ε>1.0，那么活性成分的組合應(yīng)用導(dǎo)致協(xié)同的抗真菌效應(yīng)。
[0127]結(jié)果(見表15)證明，與單獨(dú)的那他霉素、丙環(huán)唑或丙硫菌唑相比，那他霉素+丙環(huán)唑的組合和那他霉素+丙硫菌唑的組合均具有強(qiáng)得多的針對Botrytis cinerea的抗真菌活性。另外，針對那他霉素+丙環(huán)唑的組合和那他霉素+丙硫菌唑的組合觀察到的抗真菌活性比預(yù)期的抗真菌活性高50%到100%。因此，得到大于1.0的協(xié)同因子。
[0128]因此，那他霉素和丙環(huán)唑的組合應(yīng)用以及那他霉素和丙硫菌唑的組合應(yīng)用協(xié)同地抑制了 Botrytis cinerea 的生長。
[0129]實(shí)施例14
[0130]體外抗真菌活性[0131]如實(shí)施例13中所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不同之處在于測試以下的組合物:
[0132]-對照(無活性成分)，
[0133]-2.5ppm 那他霉素(DSM Food Specialties, Delft，荷蘭)，
[0134]-7.5 或 10.0ppm 丙環(huán)唑，
[0135]_0.5ppm 丙硫菌唑，
[0136]-2.5ppm那他霉素+7.5ppm丙環(huán)唑，
[0137]-2.5ppm 那他霉素 +10.0ppm 丙環(huán)唑，
[0138]-2.5ppm那他霉素+0.5ppm of丙硫菌唑。
[0139]另外,使用Fusarium proliferatum接種。根據(jù)實(shí)施例13中所述方法測定個(gè)體活性成分和組合的活性成分的抗真菌活性(以％計(jì))。
[0140]結(jié)果(見表16)揭示了那他霉素+丙環(huán)唑的活性成分組合和那他霉素+丙硫菌唑的活性成分組合比個(gè)體的那他霉素、丙環(huán)唑或丙硫菌唑更有效地抑制Fu s ar i umproliferatum的生長?；钚猿煞纸M合那他霉素+丙環(huán)唑和活性成分組合那他霉素+丙硫菌唑的觀察到的抗真菌活性比預(yù)期的抗真菌活性超出50%到100%，這導(dǎo)致大于1.0的協(xié)同因子。
[0141]因此，那他霉素和丙環(huán)唑的組合應(yīng)用以及那他霉素和丙硫菌唑的組合應(yīng)用顯示抵抗Fusarium proliferatum的強(qiáng)烈協(xié)同抗真菌活性。
.[0142]表1.用包含500ppm那他霉素、IOOOppm丙環(huán)唑或二者兼有的組合物處理后，在20 V下孵育的香蕉上長有霉菌的創(chuàng)口數(shù)。
抗真菌組合物長有霉菌的創(chuàng)口數(shù)/
【權(quán)利要求】
1.包含多烯抗真菌化合物和至少一種來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物的組合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述至少一種來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物選自由吲唑磺菌胺、氧環(huán)唑、聯(lián)苯三唑醇、糠菌唑、環(huán)丙唑醇、芐氯三唑醇、苯醚甲環(huán)唑、烯唑醇、高效烯唑醇、氟環(huán)唑、乙環(huán)唑啉、腈苯唑、三氟苯唑、氟喹唑、氟娃唑、粉唑醇、呋菌唑、順式呋菌唑、己唑醇、環(huán)菌唑、亞胺唑、種菌唑、葉菌唑、腈菌唑、戊菌唑、丙環(huán)唑、丙硫菌唑、喹唑、硅氟唑、戊唑醇、四氟醚唑、丁三唑、滅菌唑、烯效唑和烯效唑-P組成的組。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述多烯抗真菌化合物是那他霉素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物還包含至少一種選自下組的額外的化合物，所述組由粘著劑、載劑、著色劑、保護(hù)性膠體、粘合劑、除草劑、月巴料、增稠劑、掩蔽劑、觸變劑、表面活性劑、其他抗微生物化合物、洗滌劑、防腐劑、鋪展劑、填充劑、噴霧油、流動(dòng)添加劑、礦物質(zhì)、溶劑、分散劑、乳化劑、濕潤劑、穩(wěn)定劑、消泡劑、緩沖劑、UV-吸收劑和抗氧化劑組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述多烯抗真菌化合物的量在從0.005g/l到約100g/l的范圍內(nèi)，所述至少一種來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物的量在從約0.0OOlg/Ι到約2000g/l的范圍內(nèi)。
6.包含多烯抗真菌化合物和至少一種來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物的試劑盒。
7.通過用多烯抗真菌化合物和至少一種來自三唑殺真菌劑的抗真菌化合物處理產(chǎn)品來保護(hù)產(chǎn)品抵抗真菌的方法。
8.根據(jù)權(quán)利要求 7所 述的方法，其中用根據(jù)權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)所述的組合物或根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒來處理所述產(chǎn)品。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其中所述產(chǎn)品選自由食品、飼料產(chǎn)品、藥物產(chǎn)品、化妝品產(chǎn)品和農(nóng)產(chǎn)品組成的組。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述產(chǎn)品是農(nóng)產(chǎn)品。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述產(chǎn)品在收獲后被處理。
12.包含多烯抗真菌化合物和至少一種來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物的產(chǎn)品O
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的產(chǎn)品，其中所述產(chǎn)品選自由食品、飼料產(chǎn)品、藥物產(chǎn)品、化妝品產(chǎn)品和農(nóng)產(chǎn)品組成的組。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的產(chǎn)品，其中所述產(chǎn)品是農(nóng)產(chǎn)品。
15.多烯抗真菌化合物和至少一種來自三唑殺真菌劑家族的抗真菌化合物用于保護(hù)產(chǎn)品抵抗真菌的用途。
【文檔編號】A01P1/00GK103429076SQ201280011576
【公開日】2013年12月4日 申請日期:2012年3月1日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月3日
【發(fā)明者】雅各布斯·斯塔克, 安格里克·里克·德 申請人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司