新穎的抗真菌組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及新穎的抗真菌組合物，及其在處理農(nóng)產(chǎn)品中的用途。
【專利說(shuō)明】新穎的抗真菌組合物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開了控制植物疾病和預(yù)防作物微生物腐敗(spoilage)的新穎的抗真菌組合物。
[0002]發(fā)明背景
[0003]據(jù)估計(jì)世界作物產(chǎn)量的約25%由于微生物腐敗而損失，其中真菌導(dǎo)致的腐敗是迄今為止最嚴(yán)重的原因。從經(jīng)濟(jì)學(xué)觀點(diǎn)以及人道主義觀點(diǎn)(humane point)來(lái)看，預(yù)防食品腐敗都非常重要。畢竟世界上許多地方的人在遭受饑餓。
[0004]在抵抗植物和作物疾病以及減輕它們對(duì)產(chǎn)量和品質(zhì)造成的損傷方面的成功大幅取決于殺真菌劑的及時(shí)應(yīng)用。由于抗性現(xiàn)象的發(fā)生，許多殺真菌劑(例如苯并咪唑)的長(zhǎng)期和頻繁使用促成了它們有效性的降低。
[0005]—類重要的殺真菌劑是二羧酰亞胺(dicarboximide)。二羧酰亞胺的作用模式尚未被全面表征，但是它們影響真菌滲透壓調(diào)節(jié)，并且導(dǎo)致一些其他的非特異性毒效應(yīng)。二羧酰亞胺是具有低植物毒性和較短的停藥期(withholding period)的保護(hù)性殺真菌劑。因?yàn)檩^短的停藥期，它們?cè)诮咏斋@時(shí)被廣泛使用。
[0006]二羧酰亞胺在20世紀(jì)70年代中期被引入，主要用于在葡萄中控制BotrytisCinerea0它們被用作苯并咪唑(benzimidazole)殺真菌劑的替代方案,在B.cinerea中產(chǎn)生了針對(duì)所述苯并咪唑的抗性。在WO 2007/104677中公開了針對(duì)植物細(xì)菌病誘導(dǎo)耐性的方法，其中特別用甲氧基丙烯酸酯(strobilurin)和惡唑菌酮處理植物。EP 2 036 438 Al公開了異菌脲(iprodione)保護(hù)收獲的水果或蔬菜抵抗植物病原性真菌的用途。GB 2 213727 A公開了含有兩種或三種活性成分的協(xié)同殺真菌和殺螨組合物。
`[0007]在20世紀(jì)70年代中期引入二羧酰亞胺殺真菌劑后的數(shù)年中，很少在自然中觀察到二羧酰亞胺抗性隔離群。然而，到20世紀(jì)80年代時(shí)，抗性隔離群在若干種作物中是常見的(見例如 Locke et al.，1988 ；Pommer et al.，1982 ；Yourman et al.，1999)。
[0008]幾十年來(lái),多烯大環(huán)內(nèi)酯抗霉菌劑那他霉素(natamycin)已被用于預(yù)防食品如乳酪和香腸上的真菌生長(zhǎng)。通過(guò)使用Streptomyces natalensis發(fā)酵生產(chǎn)的這一天然防腐劑在全世界被廣泛用作食物防腐劑，并且在食品工業(yè)中具有安全使用的悠久歷史。在US5，597，598中公開了包含多烯抗真菌化合物、酸性抗真菌化合物和額外的有機(jī)酸或其堿金屬鹽或堿土金屬鹽用于處理食品和農(nóng)產(chǎn)品的用途。那他霉素針對(duì)所有已知的食物腐敗真菌都非常有效。盡管那他霉素在例如乳酪工業(yè)中被應(yīng)用多年，但是迄今為止從未觀察到抗性真菌物種的發(fā)生。
[0009]因此可以得出結(jié)論:對(duì)更有效的用于處理植物和作物中的真菌生長(zhǎng)和植物和作物上的真菌生長(zhǎng)的抗微生物組合物(例如抗真菌組合物)具有嚴(yán)重的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明通過(guò)提供含有多烯抗真菌化合物和至少一種來(lái)自二羧酰亞胺殺真菌劑家族的抗真菌化合物的新的協(xié)同抗微生物(例如抗真菌)組合物，解決了上述問(wèn)題。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“協(xié)同的”表示組合使用時(shí)抗真菌化合物的組合效果大于他們各自使用時(shí)的效果之和。
[0011]通常，兩種活性成分的協(xié)同活性可以例如使用處理交互作用層(treatmentinteraction stratum,見SI inker, 1998)在方差分析模型中測(cè)試。相對(duì)有效性可以通過(guò)下式計(jì)算:((未經(jīng)處理的對(duì)照的進(jìn)化狀態(tài)值-組合物的進(jìn)化狀態(tài)值)/ (未經(jīng)處理的對(duì)照的進(jìn)化狀態(tài)值))X 100。然后可以通過(guò)下式計(jì)算交互作用系數(shù):((化合物A+化合物B的組合的相對(duì)有效性)/ (化合物A的相對(duì)有效性+化合物B的相對(duì)有效性))X 100。大于100的交互作用系數(shù)表示化合物之間的協(xié)同作用。
[0012]或者可以如下計(jì)算協(xié)同作用:可以通過(guò)計(jì)算與用對(duì)照組合物處理的產(chǎn)品上的霉菌生長(zhǎng)相比，用活性成分處理的產(chǎn)品上觀察到的霉菌生長(zhǎng)的減少，來(lái)測(cè)定個(gè)體活性成分的抗真菌活性(以％計(jì))?？梢愿鶕?jù)Colby方程(Colby，1967)計(jì)算包含兩種活性成分的組合抗真菌組合物的預(yù)期抗真菌活性(E，以％計(jì)):E = X+Y-[ (X.Y)/100]，其中X和Y分別是個(gè)體活性成分X和Y的觀察到的抗真菌活性(以％計(jì))。如果組合的觀察到的抗真菌活性(0，以％計(jì))超出組合的預(yù)期抗真菌活性(Ε，以％計(jì))并且因而協(xié)同因子0/Ε> 1.0，那么活性成分的組合應(yīng)用導(dǎo)致協(xié) 同的抗真菌效應(yīng)。
[0013]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，至少一種來(lái)自二羧酰亞胺殺真菌劑家族的抗真菌化合物選自由惡唑菌酮(famoxadone)、氟氯菌核利(f Iuoroimide)、乙菌利(chlozolinate)、菌核利(dichlozoline)、異菌服(iprodione)、異瓦二麗(isovaledione)、甲菌利(myclozolin)、腐霉利(procymidone)和乙烯菌核利(vinclozolin)組成的組。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，至少一種來(lái)自二羧酰亞胺殺真菌劑家族的抗真菌化合物選自由異菌脲、腐霉利和乙烯菌核利組成的組。在一個(gè)實(shí)施方式中，組合物可還含有兩種或更多不同的來(lái)自二羧酰亞胺殺真菌劑家族的抗真菌化合物。應(yīng)當(dāng)理解，來(lái)自二羧酰亞胺殺真菌劑家族的抗真菌化合物的衍生物(包括但不限于來(lái)自二羧酰亞胺殺真菌劑家族的抗真菌化合物的鹽或溶劑合物)或來(lái)自二羧酰亞胺殺真菌劑家族的抗真菌化合物的經(jīng)修飾的形式也可以應(yīng)用在本發(fā)明的組合物中。含有二羧酰亞胺殺真菌劑例如乙烯菌核利的商業(yè)產(chǎn)品的例子是具有以下商品名的產(chǎn)品=Curalan⑩(乙烯菌核利)或Ronilan暴(乙烯菌核利)。含有二羧酰亞胺殺真菌劑例如異菌脲的商業(yè)產(chǎn)品的例子是具有以下商品名的產(chǎn)品=Rovralf)(異菌脲)或Chipco 26019 ? (異菌脲)。所述商業(yè)產(chǎn)品可以被并入本發(fā)明中。
[0014]在一個(gè)實(shí)施方式中，多烯抗真菌化合物選自由以下化合物組成的組:那他霉素、制霉菌素(nystatin)、兩性霉素B、三烯菌素(trienin)、意北霉素(etruscomycin)、菲律賓菌素(filipin)、欽氏菌素(chainin)、制皮菌素(dermostatin)、lymphosarcin、殺念珠菌素(candicidin)、金色制霉素(aureofungin) A、金色制霉素B、哈霉素(hamycin)A、哈霉素B和魯斯霉素(Iucensomycin)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，多烯抗真菌化合物是那他霉素。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物也可含有兩種或更多種不同的多烯抗真菌化合物。應(yīng)當(dāng)理解，多烯抗真菌化合物的衍生物(包括但不限于多烯抗真菌化合物的鹽或溶劑合物)或經(jīng)修飾形式的多烯抗真菌化合物也可以在本發(fā)明的組合物中應(yīng)用。含有那他霉素的商業(yè)產(chǎn)品的一個(gè)例子是商品名為Delvocid ?的產(chǎn)品。所述產(chǎn)品由DSM Food Specialties (荷蘭)生產(chǎn)，并且可以是含有例如50% (w/w)那他霉素的固體或是含有例如2-50% (w/v)那他霉素的液體。所述商業(yè)產(chǎn)品可以被并入本發(fā)明的組合物中。[0015]本發(fā)明的組合物通常包含從約0.005g/l到約100g/l和優(yōu)選地從約0.0lg/Ι到約50g/l的多烯抗真菌化合物。優(yōu)選地，所述量為0.0lg/Ι到3g/l。
[0016]本發(fā)明的組合物通常包含從約0.0001g/l到約2000g/l和優(yōu)選地從約0.0005g/I到約1500g/l的來(lái)自二羧酰亞胺殺真菌劑家族的抗真菌化合物。更優(yōu)選地，所述量為從0.001g/l 到 1000g/l。
[0017]在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物還包含至少一種選自下組的額外化合物，所述組由粘著劑(sticking agent)、載劑、著色劑、保護(hù)性膠體、粘合劑(adhesive)、除草劑、肥料、增稠劑、掩蔽劑、觸變劑、表面活性劑、其他抗微生物化合物、洗滌劑、防腐劑、鋪展劑、填充劑、噴霧油、流動(dòng)添加劑、礦物質(zhì)、溶劑、分散劑、乳化劑、濕潤(rùn)劑、穩(wěn)定劑、消泡劑、緩沖劑、UV-吸收劑和抗氧化劑組成。其他抗微生物抗真菌化合物可以是抗真菌化合物(例如抑霉唑、噻苯達(dá)唑或百菌清)，或抵抗昆蟲、線蟲、螨蟲和/或細(xì)菌的化合物。當(dāng)然，根據(jù)本發(fā)明的組合物也可以包含兩種或更多種任何上述額外的化合物。在兩種防抗真菌化合物被分別應(yīng)用的情況下，任何上述額外的化合物也可以與多烯抗真菌化合物和/或至少一種來(lái)自二羧酰亞胺殺真菌劑家族的抗真菌化合物組合。在一個(gè)實(shí)施方式中，額外的化合物是特定用途(例如食物、飼料或農(nóng)業(yè))可接受的添加劑。適用于食物、飼料或農(nóng)業(yè)的額外的化合物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
[0018]在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，其他抗微生物化合物是屬于亞磷酸鹽類的天然作物保護(hù)化合物，例如KH2PO3或K2HPO3或這兩種亞磷酸鹽的混合物。在本文中使用時(shí)，含亞磷酸根的化合物表示包含亞磷酸根即PO3 (以例如H2PO3' HPO32-或PO33-的形式)的化合物，或允許釋放亞磷酸根離子的任何化合物，包括化合物例如亞磷酸和膦酸及其衍生物如酯和/或堿金屬鹽或堿土金屬鹽。在本發(fā)明的組合物包含多烯抗真菌化合物(例如那他霉素)和至少一種含亞磷酸根的化合物的情況下，相對(duì)于每克多烯抗真菌化合物，它們優(yōu)選地包含0.1g或更少的木素磺酸鹽(Iignosulphonate),更優(yōu)選地0.1g或更少的多酹。優(yōu)選地,相對(duì)于每克多烯抗真菌化合物，它們包含0.0lg或更少的木素磺酸鹽，更優(yōu)選地0.0lg或更少的多酚。具體地，它們不含木素磺酸鹽，并優(yōu)選地不含多酚。含亞磷酸根的化合物的合適例子是亞磷酸及其(堿 金屬或堿土金屬)鹽，例如亞磷酸鉀鹽例如KH2PO3和K2HPO3,亞磷酸鈉鹽和亞磷酸銨鹽，和亞磷酸的(C1-C4)烷基酯及其鹽，例如乙基亞磷酸鋁(乙膦鋁(fosetyl-Al))、乙基亞磷酸鈣、異丙基亞磷酸鎂、異丁基亞磷酸鎂、仲丁基亞磷酸鎂和正丁基亞磷酸鋁。當(dāng)然，含亞磷酸根的化合物的混合物也包括在內(nèi)。例如KH2POjP K2HPO3的混合物可以通過(guò)例如向KH2PO3溶液中添加KOH或K2CO3至5.0-6.0的終pH來(lái)容易地獲得。如上文所指出的，作物或植物中被代謝成為亞磷酸鹽/酯化合物的前體-型化合物也可以包括在本發(fā)明的組合物中。其例子是膦酸酯，例如乙膦鋁復(fù)合物。在例如作物或植物中，該分子的膦酸乙基酯部分被代謝成為亞磷酸鹽/酯。這類化合物的一個(gè)例子是被稱作Aliette ?(Bayer,德國(guó))的商業(yè)膦酸氫乙基酯(ethyl hydrogen phosphonate)。組合物中亞磷酸鹽/酯與那他霉素的比例(以重量計(jì))一般在2: I到500: l(w/w)之間，優(yōu)選地在3: I到300: I (w/w)之間，更優(yōu)選地在5: I到200: l(w/w)之間。
[0019]根據(jù)本發(fā)明的組合物可具有從I到10、優(yōu)選地從2到9、更優(yōu)選地從3到8、最優(yōu)選地從4到7的pH。它們可以是固體例如粉末組合物，或者可以是液體。本發(fā)明的組合物可以是水性或非水性的即用型組合物，但是也可以是水性或非水性的濃縮組合物/懸浮液，或在使用前必須用合適的稀釋劑例如水或緩沖體系稀釋的儲(chǔ)存組合物、懸浮液和/或溶液。或者，本發(fā)明的組合物也可以被用于制備涂層乳液。本發(fā)明的組合物也可以具有濃縮干產(chǎn)品(例如粉末、顆粒和片劑)的形式。它們可以被用于制備用于對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行浸沒(méi)或噴霧的組合物，所述產(chǎn)品例如是農(nóng)產(chǎn)品，包括植物、作物、蔬菜和/或水果。當(dāng)然，當(dāng)多烯抗真菌化合物和至少一種來(lái)自二羧酰亞胺殺真菌劑家族的抗真菌化合物作為獨(dú)立的組合物被施用時(shí)，以上也適用。
[0020]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及包含多烯抗真菌化合物和至少一種來(lái)自二羧酰亞胺殺真菌劑家族的抗真菌化合物的試劑盒。多烯抗真菌化合物和至少一種來(lái)自二羧酰亞胺殺真菌劑家族的抗真菌化合物可存在于兩個(gè)獨(dú)立的包裝(例如容器)中。試劑盒的組分可以是包裝中的干燥形式或是液體形式。需要時(shí)，試劑盒可包含用于溶解化合物的說(shuō)明書。另夕卜，試劑盒可含有用于應(yīng)用化合物的說(shuō)明書。
[0021]在另一方面，本發(fā)明涉及通過(guò)用多烯抗真菌化合物和至少一種來(lái)自二羧酰亞胺殺真菌劑家族的抗真菌化合物處理農(nóng)產(chǎn)品來(lái)保護(hù)產(chǎn)品抵抗真菌的方法。另外，可以在用多烯抗真菌化合物和至少一種來(lái)自二羧酰亞胺殺真菌劑家族的抗真菌化合物處理產(chǎn)品之前、同時(shí)或之后，用其他抗真菌和/或抗微生物化合物處理產(chǎn)品?？梢酝ㄟ^(guò)多烯抗真菌化合物和至少一種來(lái)自二羧酰亞胺殺真菌劑家族的抗真菌化合物的順次應(yīng)用來(lái)處理產(chǎn)品，或反之亦然?；蛘?，可以通過(guò)多烯抗真菌化合物和至少一種來(lái)自二羧酰亞胺殺真菌劑家族的抗真菌化合物的同時(shí)應(yīng)用來(lái)處理產(chǎn)品。在同時(shí)應(yīng)用的情況下，化合物可存在于被同時(shí)應(yīng)用的不同的組合物中，或化合物可存在于單一組合物中。還在另一實(shí)施方式中，可以通過(guò)應(yīng)用兩種抗真菌化合物的單獨(dú)模式或交替模式來(lái)處理產(chǎn)品。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及通過(guò)對(duì)產(chǎn)品應(yīng)用多烯抗真菌化合物和至少一種來(lái)自二羧酰亞胺殺真菌劑家族的抗真菌化合物來(lái)處理產(chǎn)品的方法。通過(guò)應(yīng)用化合物，能夠預(yù)防產(chǎn)品上或產(chǎn)品中的真菌生長(zhǎng)。也就是說(shuō)，化合物保護(hù)產(chǎn)品抵抗真菌生長(zhǎng)和/或抵抗真菌感染和/或抵抗真菌腐敗?；衔镆部梢员挥糜谔幚硪呀?jīng)感染真菌的產(chǎn)品。通過(guò)應(yīng)用化合物，歸因于這些產(chǎn)品上或產(chǎn)品中真菌的疾病發(fā)生可以被減緩、停止，或產(chǎn)品甚至可以從疾病中痊愈。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，用根據(jù)本發(fā)明的組合物或試劑盒處理產(chǎn)品。在一個(gè)`實(shí)施方式中，產(chǎn)品是食物、飼料、藥物、化妝品或農(nóng)產(chǎn)品。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，產(chǎn)品是農(nóng)產(chǎn)品。
[0022]多烯抗真菌化合物和至少一種來(lái)自二羧酰亞胺殺真菌劑家族的抗真菌化合物、根據(jù)本發(fā)明的組合物和根據(jù)本發(fā)明的試劑盒可以通過(guò)噴霧被應(yīng)用至產(chǎn)品。適用于將液體形式的這些化合物、組合物和試劑盒應(yīng)用至產(chǎn)品的其他方法也是本發(fā)明的一部分。這些方法包括但不限于，浸潰(dipping)、燒水、浸透(drenching)、引入接收器(dump tank)中、蒸發(fā)、霧化(atomizing)、成霧(fogging)、熏蒸、涂抹、刷抹(brushing)、粉化(dusting)、起泡、鋪展、包裝和涂覆(例如借助于蠟或靜電)。另外，也可以將抗真菌化合物注射進(jìn)土壤中。使用自動(dòng)化系統(tǒng)的噴霧應(yīng)用已知降低人力成本并且是成本有效的。為此目的可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法和設(shè)備。感染風(fēng)險(xiǎn)較高時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的組合物也可以定期噴霧。感染風(fēng)險(xiǎn)較低時(shí)，噴霧間隔可以更長(zhǎng)。取決于應(yīng)用的類型，應(yīng)用的多烯抗真菌化合物的用量可以從5ppm到10，OOOppm、優(yōu)選地從IOppm到5，OOOppm和最優(yōu)選地從20到1，OOOppm變化。取決于應(yīng)用類型，被應(yīng)用的至少一種來(lái)自二羧酰亞胺殺真菌劑家族的抗真菌化合物的用量可從IOppm到5，OOOppm、優(yōu)選地從20ppm到3，OOOppm和最優(yōu)選地從50到1，OOOppm變化。[0023]在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，可以在收獲后處理農(nóng)產(chǎn)品。通過(guò)使用多烯抗真菌化合物和至少一種來(lái)自二羧酰亞胺殺真菌劑家族的抗真菌化合物，在較長(zhǎng)的時(shí)間段中實(shí)現(xiàn)了收獲后和/或儲(chǔ)存疾病的控制，從而允許在長(zhǎng)距離和在溫度與濕度方面具有不同的受控氣氛的多種儲(chǔ)存條件下運(yùn)輸收獲的農(nóng)產(chǎn)品。收獲后儲(chǔ)存病癥為例如皮孔斑點(diǎn)(Ienticelspots)、枯萎(scorch)、衰老性分解(senescent breakdown)、苦陷癥(bitter pit)、褐斑(scald)、水核(water core)、褐化(browning)、維管分解(vascular breakdown)、CO2損傷、CO2或O2不足、和軟化。真菌疾病可例如由以下真菌引起:Mycosphaerella spp.、Mycosphaerella musaeΛMycosphaerella fragariae、Mycosphaerella citri ;毛霉屬的物種(Mucor spp.)，例如 Mucor piriformis ；Monilinia spp.，例如 Monilinia fructigena、Monilinia Iaxa ;擬莖點(diǎn)霉屬的物種(Phomopsis spp.)、Phomopsis natalensis ；Colletotrichum spp.，例如 Colletotrichum musae、Colletotrichum gloeosporioides、Colletotrichum coccodes ；Verticillium spp.， 例如 Verticillium theobromae ；Nigrospora spp.；Botrytis spp.，例如Botrytis cinerea ；Diplodia spp.，例如Diplodiacitri ；Pezicula spp.；Alternaria spp.，例如Alternaria citriΛAlternaria alternat ；Septoria spp.，例如 Septoria depressa ；Venturia spp.，例如 Venturia inaequalis、Venturia pyrina ；Rhizopus spp.， 例如 Rhizopus stolonifer、Rhizopus oryzae ；Glomerella spp.，例如 Glomerella cingulata ；Sclerotinia spp.，例如 Sclerotiniafruiticola ；Ceratocystis spp.，例如 Ceratocystis paradoxa ；Fusarium spp.，例如Fusarium semitectum、Fusarium moniliforme、Fusarium solan1、Fusarium oxysporum ；Cladosporium spp.， 例如 Cladosporium fulvum、Cladosporium cladosporioides、Cladosporium cucumerinum、Cladosporium musae ;青霉菌屬的物種(Penicillium spp.)，例如繩狀青霉菌(Penicillium funiculosum)、擴(kuò)展青霉菌(Penicillium expansum)、指狀青霉菌(Penicillium digitatum)、意大利青霉菌(Penicillium italicum)；Phytophthora spp.， 例如 Phytophthora citrophthora、Phytophthora fragariae、Phytophthora cactorum、Phytophthora parasitica ；Phacydiopycnis spp.， 例如Phacydiopycnis malirum ；Gloeosporium spp.，例如 Gloeosporium album、Gloeosporiumperennans、Gloeosporium fructigenum、Gloeosporium singulata ；Geotrichum spp.，例如Geotrichum candidum ；Phlyctaena spp.，例如Phlyctaena vagabunda ；Cylindrocarponspp.，例如 Cylindrocarpon mali ；Stemphyllium spp.，例如 Stemphyllium vesicarium ；Thielaviopsis spp.，例如 Thielaviopsis paradoxy ；曲霉屬的物種(Aspergillusspp.)，例如黑曲霉(Aspergillus niger)、Aspergillus carbonarius ；Nectria spp.，例如 Nectria galligena ；Cercospora spp.，例如 Cercospora angrec1、Cercospora api1、Cercospora atrofiliformis、Cercospora musae、Cercospora zeae—maydis。
[0024]本發(fā)明的另一方面涉及多烯抗真菌化合物和至少一種來(lái)自二羧酰亞胺殺真菌劑家族的抗真菌化合物保護(hù)產(chǎn)品抵抗真菌的用途。如上文所述，化合物可以順次或同時(shí)使用(例如應(yīng)用)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種用途，其中根據(jù)本發(fā)明的組合物或試劑盒被應(yīng)用至產(chǎn)品。在一個(gè)實(shí)施方式中，產(chǎn)品是食物、飼料、藥物、化妝品或農(nóng)產(chǎn)品。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，產(chǎn)品是農(nóng)產(chǎn)品。
[0025]在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，多烯抗真菌化合物和至少一種來(lái)自二羧酰亞胺殺真菌劑家族的抗真菌化合物可在藥物中被用于例如治療和/或預(yù)防真菌疾病。多烯抗真菌化合物和至少一種來(lái)自二羧酰亞胺殺真菌劑家族的抗真菌化合物可例如以藥物組合物的形式被使用。組合物可還包含藥物可接受的賦形劑?？拐婢衔锟煽诜┯没蚰c胃外施用。組合物的類型取決于施用途徑。
[0026]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用多烯抗真菌化合物和至少一種來(lái)自二羧酰亞胺殺真菌劑家族的抗真菌化合物處理的產(chǎn)品。在一個(gè)實(shí)施方式中，用根據(jù)本發(fā)明的組合物或試劑盒處理產(chǎn)品。本發(fā)明因此涉及包含多烯抗真菌化合物和至少一種來(lái)自苯氨基嘧啶(aniIinopyrimidines)殺真菌劑家族的抗真菌化合物的產(chǎn)品。經(jīng)處理的產(chǎn)品的表面上和/或產(chǎn)品內(nèi)可包含多烯抗真菌化合物和至少一種來(lái)自二羧酰亞胺殺真菌劑家族的抗真菌化合物?；蛘撸?jīng)處理的產(chǎn)品可包含涂層，所述涂層包含這些化合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，經(jīng)處理的產(chǎn)品表面上包含從0.000001到200mg/dm2、優(yōu)選地0.00001到100mg/dm2、更優(yōu)選地從0.00005到10mg/dm2的多烯抗真菌化合物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，它們?cè)诒砻嫔习瑥?.000001 到 200mg/dm2、優(yōu)選地 0.00001 到 100mg/dm2、更優(yōu)選地從 0.00005 到 10mg/dm2 的至少一種來(lái)自二羧酰亞胺殺真菌劑家族的抗真菌化合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，產(chǎn)品是食物、飼料、藥物、化妝品或農(nóng)產(chǎn)品。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，產(chǎn)品是農(nóng)產(chǎn)品。
[0027]在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“食品“應(yīng)當(dāng)被非常廣義地理解，包括但不限于，乳酪、奶油乳酪、碎乳酪、松軟干酪(cottage cheese)、經(jīng)加工的乳酪、酸奶油、干燥的經(jīng)發(fā)酵的肉制品，包括薩拉米香腸和其他香腸、葡萄酒、啤酒、酸乳、果汁和其他飲料、沙拉醬、松軟干酪醬(cottage cheese dressing)、蘸料、烘焙制品和烘焙填料、表面釉(surface glaze)和糖霜、涂抹醬、披薩餅餡料、糕餅和糕餅填料、橄欖、橄欖鹵水(olive brine)、橄欖油、果汁、番茄泥和番茄糊、作料、和水果漿和其他類似的食品。
[0028]在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“飼料產(chǎn)品”也應(yīng)當(dāng)非常廣義地理解，包括但不限于寵物食物、肉雞飼料等等。
[0029]在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“藥物產(chǎn)品”也應(yīng)當(dāng)非常廣義地理解，包括包含活性分子例如藥物、藥劑或藥物化合物和任選地包含藥物可接受的賦形劑的產(chǎn)品，所述賦形劑即與活性分子組合用于制備合適或便利的 劑型的任何惰性物質(zhì)。
[0030]在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“化妝品產(chǎn)品”也應(yīng)當(dāng)非常廣義地理解，包括下述產(chǎn)品，所述產(chǎn)品被用于通過(guò)防止水分的蒸騰來(lái)保護(hù)或治療角質(zhì)組織如皮膚和唇、頭發(fā)和指甲的干燥，并且護(hù)理組織以及給予這些組織良好的外觀。術(shù)語(yǔ)“化妝品組合物”涉及的產(chǎn)品包括但不限于保濕霜、個(gè)人清潔產(chǎn)品、閉合的藥物遞送貼片、指甲油、粉、擦拭片、護(hù)發(fā)素、皮膚處理乳液、剃須霜等等。
[0031]在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“農(nóng)產(chǎn)品”也應(yīng)當(dāng)非常廣義地理解，包括但不限于谷物，例如小麥、大麥、裸麥、燕麥、水稻、高粱等等；甜菜，例如糖用甜菜(sugar beet)和飼料甜菜(fodder beet);梨果和核果和漿果，例如蘋果、梨、李子、杏、桃、杏仁、櫻桃、草莓、覆盆子和黑莓；豆科植物，例如豆子、扁豆、豌豆、大豆；油料植物，例如油菜、芥末、罌粟、橄欖、向日葵、椰子、蓖麻植物、可可、花生；葫蘆科，例如南瓜、小黃瓜(gherkins)、甜瓜、黃瓜、倭瓜、爺子；纖維植物，例如棉花、亞麻、大麻、黃麻；柑橘水果，例如橙、檸檬、葡萄柚、蜜桔、枸櫞；熱帶水果，例如木瓜、百香果、芒果、楊桃、菠蘿、香蕉、奇異果；蔬菜，例如菠菜、萵苣、蘆筍、十字花科如卷心菜和蕪菁、胡蘿卜、洋蔥、番茄、馬鈴薯、馬鈴薯種子(seed-potatoe)、尖辣椒(hot pepper)和甜椒；月桂樣植物,例如酪梨、肉桂、樟腦樹；或產(chǎn)品如玉米、煙草、堅(jiān)果、咖啡、甘蔗、茶、葡萄藤、酒花、橡膠植物、以及觀賞植物例如切花、玫瑰、郁金香、百合、水仙花、藏紅花、風(fēng)信子、大麗花、大丁草、康乃馨、倒掛金鐘(fuchsias)、菊花和球根花丼(flower bulbs)、灌木、落葉樹和常綠樹例如松柏植物、溫室植物和樹木。其包括但不限于植物及其部分、果實(shí)、種子、插條(cuttings)、栽培種、移植物、鱗莖、塊莖、根-塊莖、根莖、切花和蔬菜。
[0032]用于制備本文所述的組合物的方法是本發(fā)明的另一個(gè)方面。方法包括向至少一種來(lái)自二羧酰亞胺殺真菌劑家族的抗真菌化合物添加多烯抗真菌化合物?；衔锟衫绫粏为?dú)地添加至水性組合物并混合，需要時(shí)隨后調(diào)節(jié)pH、粘度等等。如果單獨(dú)添加，則單獨(dú)的化合物中的一些或全部可以是粉末形式，但是替代性地，一些或全部也可以是液體形式?；衔镆部衫缫苑勰┬问奖槐舜颂砑硬⒒旌?，以獲得粉末組合物。粉末狀的組合物可隨后被添加至水性組合物。
實(shí)施例
[0033]實(shí)施例1
[0034]收獲前應(yīng)用
[0035]用真菌接種香蕉植物的葉。未經(jīng)接種的葉被包括在內(nèi)作為對(duì)照。接著，用組合物
I(那他霉素)、組合物2(異菌脲)、組合物3 (腐霉利)、組合物4(乙烯菌核利)、組合物5 (那他霉素+異菌脲)、組合物6 (那他霉素+腐霉利)或組合物7 (那他霉素+乙烯菌核利)處理葉的確定部分。通過(guò)噴霧應(yīng)用每種組合物。未經(jīng)處理的葉也包括在內(nèi)(未經(jīng)處理的對(duì)照)。
.[0036]獲得的結(jié)果顯示本發(fā)明的組合物保護(hù)香蕉植物免于真菌生長(zhǎng)，還證明與活性化合物各自應(yīng)用時(shí)的活性相比，本發(fā)明的組合物顯示協(xié)同增強(qiáng)的活性。
[0037]實(shí)施例2
[0038]收獲后應(yīng)用
[0039]根據(jù)de Lapeyre de Bellaire and Dubois (1987)所述方法使香蕉受傷。使用木塞穿孔器對(duì)香蕉造成創(chuàng)傷，之后用真菌孢子污染。在室溫下孵育若干小時(shí)后，將香蕉浸在以下組合物之一中:a)無(wú)處理(對(duì)照I)、b)浸在水中(對(duì)照2)、c)浸在那他霉素中、d)浸在異菌脲中、e)浸在腐霉利中、f)浸在乙烯菌核利中、g)浸在那他霉素+異菌脲中、h)浸在那他霉素+腐霉利中和i)浸在那他霉素+乙稀囷核利中。在該處理后，將香焦在閉合箱中于21°C和提高的濕度下孵育。每天視覺(jué)評(píng)價(jià)香蕉的真菌發(fā)展。
[0040]結(jié)果顯示與單獨(dú)的那他霉素或至少一種來(lái)自二羧酰亞胺殺真菌劑家族的抗真菌化合物相比，含有那他霉素和至少一種來(lái)自二羧酰亞胺殺真菌劑家族的抗真菌化合物的組合物更好地保護(hù)香蕉抵抗真菌。令人驚訝的是，那他霉素和至少一種來(lái)自二羧酰亞胺殺真菌劑家族的抗真菌化合物的組合應(yīng)用導(dǎo)致感染的強(qiáng)烈的協(xié)同減少。
[0041]實(shí)施例3
[0042]處理草莓
[0043]每個(gè)處理組使用十個(gè)新鮮的、有機(jī)的草莓。用0.5mm長(zhǎng)的切口對(duì)每個(gè)草莓造成創(chuàng)傷，用10 μ I含有I X IO5孢子/ml的Botrytis cinerea懸浮液接種每個(gè)創(chuàng)口。在20°C下孵育2小時(shí)后，在新鮮制備的含有500ppm那他霉素(DSM Food Specialties, Delft，荷蘭)、2000ppm腐霉利或二者兼有的水性抗真菌組合物中將每個(gè)草莓各自浸潰I分鐘?？拐婢M合物還包含3.1% (w/w)蜂蠟、0.76% (w/w)甘油、0.66% (w/w)聚氧乙烯脫水山梨醇單硬脂酸酯(Tween 60),0.03% (w/w)甲基羥乙基纖維素(MHEC),0.02% (w/w)黃原膠、0.02%(w/w)消泡劑、0.15% (w/w)朽1檬酸和0.01% (w/w)山梨酸鉀。組合物的pH為4。使用不含那他霉素和腐霉利的組合物作為對(duì)照。將經(jīng)處理的草莓在閉合箱中于暗中和20°C下孵育13天。
[0044]在孵育期間，以雙重方式評(píng)價(jià)草莓上的霉菌生長(zhǎng):(i)計(jì)數(shù)每10個(gè)草莓總數(shù)中長(zhǎng)有霉菌的草莓?dāng)?shù)量；和(ii)通過(guò)計(jì)算與用對(duì)照組合物處理的草莓上的霉菌生長(zhǎng)相比，用抗真菌組合物處理的草莓上觀察到的霉菌生長(zhǎng)的減少，來(lái)測(cè)定個(gè)體和組合的活性成分的抗真菌活性(以％計(jì))。根據(jù)Colby方程(Colby, 1967)計(jì)算包含兩種活性成分的組合抗真菌組合物的預(yù)期抗真菌活性(E，以％計(jì)):
[0045]E = X+Y-[(X .Y)/100]
[0046]其中X和Y分別是個(gè)體活性成分X和Y的觀察到的抗真菌活性(以％計(jì))。如果組合的觀察到的抗真菌活性(0，以％計(jì))超出組合的預(yù)期抗真菌活性(Ε，以％計(jì))并且因而協(xié)同因子0/Ε > 1.0，那么活性成分的組合應(yīng)用導(dǎo)致協(xié)同的抗真菌效應(yīng)。
[0047]表I (每10個(gè)草莓總數(shù)中長(zhǎng)有霉菌的草莓?dāng)?shù))和表2 (抗真菌活性)中的結(jié)果清楚地證實(shí)，與單獨(dú)的那他霉素或腐霉利相比，包含500ppm那他霉素和2000ppm腐霉利的抗真菌組合物在草莓上具有強(qiáng)得多的抗真菌活性。
[0048]孵育5天后，用對(duì)照組合物處理的所有10個(gè)草莓均顯示霉菌生長(zhǎng)，而用那他霉素單獨(dú)處理的10個(gè)草莓中的9個(gè)長(zhǎng)有霉菌，用腐霉利單獨(dú)處理的10個(gè)草莓中的8個(gè)長(zhǎng)有霉菌。然而，用包含那他霉素和腐霉利二者的組合物處理的10個(gè)草莓中僅4個(gè)觀察到霉菌生長(zhǎng)(見表I)。另外，對(duì)包含那他霉素和腐霉利二者的組合物觀察的抗真菌活性比預(yù)期的抗真菌活性超出15%，這導(dǎo)致> 1.0的協(xié)同因子(見表2)。
[0049]孵育6天后，用對(duì)照組合物處理的所有10個(gè)草莓長(zhǎng)有霉菌，用那他霉素或腐霉利任一單獨(dú)處理的10個(gè)草莓中的9個(gè)長(zhǎng)有霉菌。然而,用包含那他霉素和腐霉利的組合物處理的12個(gè)草莓中僅有5個(gè)長(zhǎng)有霉菌(見表I)。另外，對(duì)包含那他霉素和腐霉利的組合的組合物所觀察到的抗真菌活性比預(yù)期的抗真菌活性高> 20%，獲得了> 1.0的協(xié)同因子(見表2)。
[0050]孵育7、8、9、10和12天后,用對(duì)照組合物、那他霉素或腐霉利任一單獨(dú)處理的所有10個(gè)草莓均顯示霉菌生長(zhǎng)。然而，用那他霉素和腐霉利的活性成分組合處理的10個(gè)草莓中，7天后僅有5個(gè)草莓長(zhǎng)有霉菌，8、9和10天后僅有6個(gè)草莓長(zhǎng)有霉菌，12天后僅有7個(gè)草莓長(zhǎng)有霉菌。另外，孵育7和13天之間時(shí)，觀察到的抗真菌活性比預(yù)期的抗真菌活性高>40%。因此，相應(yīng)的協(xié)同因子在整個(gè)13天孵育期間超過(guò)1.0，并且從第5天的1.2提高至高達(dá)第13天的> 33 (見表2)。
[0051]因此,500ppm那他霉素和2000ppm腐霉利在草莓上的組合應(yīng)用具有令人驚訝的強(qiáng)協(xié)同抗真菌效應(yīng)。
[0052]實(shí)施例4
[0053]處理草莓[0054]如實(shí)施例3中所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不同之處在于在新鮮制備的含有500ppm那他霉素(DSM Food Specialties，Delft，荷蘭)UOOOppm腐霉利或二者兼有的水性抗真菌組合物中將每個(gè)有創(chuàng)口并且經(jīng)接種的草莓各自浸潰I分鐘。孵育4、5和7天后根據(jù)實(shí)施例3中所述的兩種方法針對(duì)霉菌生長(zhǎng)評(píng)價(jià)經(jīng)處理的草莓。
[0055]表3(抗真菌活性)和表4(每10個(gè)草莓總數(shù)中長(zhǎng)有霉菌的草莓?dāng)?shù))中的結(jié)果顯示，與單獨(dú)包含那他霉素或腐霉利的組合物相比，包含500ppm那他霉素以及IOOOppm腐霉利的抗真菌組合物在限制草莓上霉菌生長(zhǎng)方面更加成功。
[0056]孵育4天后，觀察到的抗真菌活性比預(yù)期的抗真菌活性高12%，這導(dǎo)致> 1.0的協(xié)同因子(見表3)。
[0057]孵育5天和7天后,用對(duì)照組合物或腐霉利處理的所有10個(gè)草莓均長(zhǎng)有霉菌,用那他霉素單獨(dú)處理的10個(gè)草莓中分別有9個(gè)和10個(gè)長(zhǎng)有霉菌。然而，對(duì)草莓應(yīng)用那他霉素和腐霉利的活性成分組合時(shí)，第5天10個(gè)草莓中僅4個(gè)觀察到霉菌生長(zhǎng)，第7天10個(gè)草莓中僅8個(gè)觀察到霉菌生長(zhǎng)(見表4)。另外，第5天和第7天對(duì)包含那他霉素和腐霉利的組合物觀察的抗真菌活性比預(yù)期的抗真菌活性分別超出16%和14%。因此，兩天中獲得的協(xié)同因子為1.3 (見表3)。
[0058]總而言之,該實(shí)施例的結(jié)果證明，500ppm那他霉素和IOOOppm腐霉利組合應(yīng)用協(xié)同減少了草莓上的霉菌生長(zhǎng)。
[0059]實(shí)施例5
[0060]處理草莓
[0061]如實(shí)施例3中所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不同之處在于在新鮮制備的含有250ppm那他霉素(DSM Food Specialties, Delft，荷蘭)、500ppm腐霉利或二者兼有的水性抗真菌組合物中將每個(gè)有創(chuàng)口并且經(jīng)接種的草莓各自浸潰I分鐘。將經(jīng)處理的草莓孵育9天，并在第5天起每天評(píng)價(jià)霉菌生長(zhǎng)。根據(jù)實(shí)施例3中所述的方法，測(cè)定單獨(dú)和組合的活性成分的抗真菌活性(以％計(jì))。
[0062]表5中的結(jié)果顯示,包含250ppm那他霉素以及500ppm腐霉利的抗真菌組合物在減少草莓上霉菌生長(zhǎng)方面優(yōu)于單獨(dú)包含那他霉素或腐霉利任一的組合物。
[0063]孵育5、6、7、8、9天后，觀察到的抗真菌活性比預(yù)期的抗真菌活性高8 %到31 %，相應(yīng)的協(xié)同因子范圍從1.1到2.1 (見表5)。
[0064]因此，組合應(yīng)用于草莓上時(shí),250ppm那他霉素和500ppm腐霉利之間存在抵抗真菌的協(xié)同活性。
[0065]實(shí)施例6
[0066]處理草毒
[0067]如實(shí)施例3中所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不同之處在于在新鮮制備的含有250ppm那他霉素(DSM Food Specialties, Delft，荷蘭)、250ppm腐霉利或二者兼有的水性抗真菌組合物中將每個(gè)有創(chuàng)口并且經(jīng)接種的草莓各自浸潰I分鐘。孵育期間，根據(jù)實(shí)施例3中所述的兩種方法針對(duì)霉菌生長(zhǎng)評(píng)價(jià)經(jīng)處理的草莓。
[0068]表6 (每10個(gè)草莓總數(shù)中長(zhǎng)有霉菌的草莓?dāng)?shù))和表7 (抗真菌活性)明確證實(shí)，與單獨(dú)包含那他霉素或腐霉利的組合物相比，包含250ppm那他霉素以及250ppm腐霉利的組合抗真菌組合物更有效地保護(hù)草莓抵抗霉菌生長(zhǎng)。[0069]孵育4、5和6天后，用對(duì)照組合物或腐霉利任一單獨(dú)處理的所有10個(gè)草莓均長(zhǎng)有霉菌，用那他霉素單獨(dú)處理的10個(gè)草莓中分別有4個(gè)、7個(gè)和9個(gè)長(zhǎng)有霉菌。然而，用那他霉素和腐霉利的活性成分組合處理的10個(gè)草莓中，孵育4、5和6天后10個(gè)草莓中分別僅
2、3和6個(gè)草莓長(zhǎng)有霉菌(見表6)。另外，第4、5、6天觀察到的抗真菌活性比預(yù)期的抗真菌活性分別超出9%、17%和24% (見表7)。
[0070]孵育7、8和9天后,用對(duì)照組合物、那他霉素或腐霉利任一單獨(dú)處理的所有10個(gè)草莓均顯示霉菌生長(zhǎng)。然而，用包含那他霉素和腐霉利二者的組合物處理的10個(gè)草莓中，第7天和第8天僅7個(gè)草莓觀察到霉菌生長(zhǎng)，第9天僅8個(gè)草莓觀察到霉菌生長(zhǎng)(見表6)。另外，孵育7天和13天之間，觀察的抗真菌活性比預(yù)期的抗真菌活性高13%到29%。因此，整個(gè)12天孵育期期間協(xié)同因子超過(guò)1.0,并且從第4天的1.1提高至第12天的3.6 (見表7)。
[0071]因此，250ppm那他霉素和250ppm腐霉利的組合應(yīng)用導(dǎo)致草莓上霉菌生長(zhǎng)的令人驚訝的強(qiáng)協(xié)同減少。
[0072]實(shí)施例7
[0073]處理蜜桔(mandarins)
[0074]每個(gè)處理組使用十個(gè)新鮮的有機(jī)蜜桔。根據(jù)de Lapeyre de Bellaire andDubois (1987)所述方法，使用木塞鉆孔器對(duì)每個(gè)蜜桔的皮造成一次創(chuàng)傷。隨后，用10μ I含有I X IO4孢子/ml的Penicillium italicum懸浮液接種每個(gè)創(chuàng)口。在20°C下孵育2小時(shí)后，在新鮮制備的包含500ppm那他霉素(DSM Food Specialties,Delft,荷蘭)、2000ppm腐霉利或二者兼有的水性抗真菌組合物中將蜜桔各自浸潰I分鐘。另外，抗真菌組合物包含
3.1% (w/w)蜂臘、0.76% (w/w)甘油、0.66% (w/w)聚氧乙烯山梨聚糖單硬脂酸酯(Tween60),0.03% (w/w)甲基羥乙基纖 維素(MHEC)、0.02% (w/w)黃原膠、0.02% (w/w)消泡劑、0.15% (w/w)朽1檬酸和0.01% (w/w)山梨酸鉀。組合物的pH為4。使用不含那他霉素和腐霉利的組合物作為對(duì)照。
[0075]將經(jīng)處理的蜜桔在閉合箱中于暗中、20°C下孵育，并在孵育6、8、10、13、15和18天后評(píng)價(jià)霉菌生長(zhǎng)。根據(jù)實(shí)施例3中所述的Colby方法(Colby，1967)，通過(guò)計(jì)算與用對(duì)照組合物處理的蜜桔上的霉菌生長(zhǎng)相比，用抗真菌組合物處理的蜜桔上觀察到的霉菌生長(zhǎng)的減少，來(lái)測(cè)定個(gè)體和組合的活性成分的抗真菌活性(以％計(jì))。
[0076]表8中的結(jié)果證明，包含500ppm那他霉素和2000ppm腐霉利的活性成分組合比單獨(dú)的那他霉素或腐霉利更加成功地限制蜜桔上的霉菌生長(zhǎng)。
[0077]孵育6、8、10、13、15和18天后，針對(duì)包含那他霉素和腐霉利二者的組合物觀察到的抗真菌活性比預(yù)期的抗真菌活性超出18%到37%。上述這些天中每天相應(yīng)的協(xié)同因子>1.0，并且從第6天的1.2提高至第18天的1.8 (見表8)。
[0078]總而言之，該實(shí)施例的結(jié)果清楚地證明在蜜桔上組合應(yīng)用時(shí)，500ppm那他霉素和2000ppm腐霉利的協(xié)同抗真菌效應(yīng)。
[0079]實(shí)施例8
[0080]處理蘋果
[0081]每個(gè)處理組使用十二個(gè)新鮮的、有機(jī)的蘋果。根據(jù)Lapeyre de Bellaire andDubois (1987)所述方法，使用木塞鉆孔器對(duì)每個(gè)蘋果造成創(chuàng)傷。隨后，用10μ I含有IXlO5孢子/ml的Botrytis cinerea懸浮液接種每個(gè)創(chuàng)口。在20°C下孵育2小時(shí)后,在新鮮制備的含有250ppm那他霉素(DSM Food Specialties, Delft,荷蘭)、500ppm腐霉利任一或二者兼有的水性抗真菌組合物中將蘋果各自浸潰I分鐘。另外，抗真菌組合物包含3.1%(w/w)蜂臘、0.76% (w/w)甘油、0.66% (w/w)聚氧乙烯脫水山梨醇單硬脂酸酯(Tween60),0.03% (w/w)甲基羥乙基纖維素(MHEC)、0.02% (w/w)黃原膠、0.02% (w/w)消泡劑、
0.15% (w/w)朽1檬酸和0.01% (w/w)山梨酸鉀。組合物的pH為4。使用不含那他霉素和腐霉利的組合物作為對(duì)照。將經(jīng)處理的蘋果在閉合箱中于暗中和20°C下孵育。
[0082]在孵育期間，以雙重方式評(píng)價(jià)蘋果上的霉菌生長(zhǎng):(i)計(jì)數(shù)每12個(gè)蘋果總數(shù)中長(zhǎng)有霉菌的蘋果數(shù)量；和(ii)根據(jù)實(shí)施例3中所述Colby方法(Colby，1967)，通過(guò)計(jì)算與用對(duì)照組合物處理的蘋果上的霉菌生長(zhǎng)相比，用抗真菌組合物處理的蘋果上觀察到的霉菌生長(zhǎng)的減少，來(lái)測(cè)定個(gè)體和組合的活性成分的抗真菌活性(以％計(jì))。
[0083]表9(每12個(gè)蘋果總數(shù)中長(zhǎng)有霉菌的蘋果數(shù))和表10 (抗真菌活性)中的結(jié)果顯示,包含250ppm那他霉素和500ppm腐霉利的抗真菌組合物具有與單獨(dú)包含那他霉素或腐霉利的組合物相比更強(qiáng)的抗真菌活性。
[0084]孵育4到11天期間，用對(duì)照組合物處理的所有蘋果都長(zhǎng)有霉菌，用腐霉利單獨(dú)處理的10個(gè)蘋果中的8個(gè)長(zhǎng)有霉菌。單獨(dú)使用那他霉素進(jìn)行處理時(shí)，在第4天12個(gè)蘋果中的11個(gè)觀察到霉菌生長(zhǎng)，第5到11天所有12個(gè)蘋果均觀察到霉菌生長(zhǎng)。然而，用包含腐霉利和那他霉素二者的組合物處理的12個(gè)蘋果中，第4天3個(gè)蘋果長(zhǎng)有霉菌，第5天和第6天4個(gè)蘋果長(zhǎng)有霉菌，第7到11天12個(gè)蘋果中的6個(gè)長(zhǎng)有霉菌(見表9)。
[0085]孵育12和13天后，用對(duì)照組合物或那他霉素任一單獨(dú)處理的所有蘋果都顯示霉菌生長(zhǎng)，用腐霉利單獨(dú)處理的12個(gè)蘋果中分別有10個(gè)和11個(gè)顯示霉菌生長(zhǎng)。然而，用包含那他霉素和腐霉利二者的組合物處理蘋果時(shí)，第12天和第13天13個(gè)蘋果中分別僅有6和7個(gè)長(zhǎng)有霉菌(見表9)。另.外，針對(duì)那他霉素和腐霉利的活性成分組合所觀察的抗真菌活性幾乎比預(yù)期的抗真菌活性高10%，這導(dǎo)致> 1.0的協(xié)同因子(見表10)。
[0086]在孵育的14到25天期間，用對(duì)照組合物、那他霉素或腐霉利任一單獨(dú)處理的所有蘋果均長(zhǎng)有霉菌。然而，用包含那他霉素以及腐霉利的組合物處理后顯示霉菌生長(zhǎng)的蘋果數(shù)在從14到25天的孵育周期中保持恒定為12個(gè)中的7個(gè)。針對(duì)那他霉素和腐霉利的活性成分組合觀察的抗真菌活性比預(yù)期的抗真菌活性超出11%到幾乎50%。因此，協(xié)同因子從第13天的1.1提高至第25天的2.3 (見表10)。
[0087]因此,組合應(yīng)用于蘋果上時(shí)，250ppm那他霉素和500ppm腐霉利之間存在非常強(qiáng)的協(xié)同活性。
[0088]實(shí)施例9
[0089]處理蘋果
[0090]如實(shí)施例8中所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不同之處在于在新鮮制備的含有250ppm那他霉素(DSM Food Specialties, Delft，荷蘭)、250ppm腐霉利或二者兼有的水性抗真菌組合物中將每個(gè)有創(chuàng)口并且經(jīng)接種的蘋果各自浸潰I分鐘。孵育期間，根據(jù)實(shí)施例8中所述的兩種方法針對(duì)霉菌生長(zhǎng)評(píng)價(jià)經(jīng)處理的蘋果。
[0091]表11 (每12個(gè)蘋果總數(shù)中長(zhǎng)有霉菌的蘋果數(shù))和表12 (抗真菌活性)中的結(jié)果證明，與單獨(dú)的那他霉素或腐霉利相比，包含250ppm那他霉素以及250ppm腐霉利的組合物更有效地減少霉菌生長(zhǎng)。
[0092]孵育6到11天期間，用對(duì)照組合物或那他霉素單獨(dú)處理的所有蘋果均長(zhǎng)有霉菌。單獨(dú)使用腐霉利進(jìn)行處理時(shí)，第6天和第8天12個(gè)蘋果中僅7個(gè)觀察到霉菌生長(zhǎng)，第7到11天12個(gè)蘋果中僅8個(gè)觀察到霉菌生長(zhǎng)。然而,在用包含腐霉利和那他霉素二者的組合物處理的12個(gè)蘋果中，第7天到第11天中4個(gè)蘋果長(zhǎng)有霉菌(見表11)。
[0093]孵育12到25天期間，用對(duì)照組合物、那他霉素或腐霉利任一單獨(dú)處理的所有蘋果均顯示霉菌生長(zhǎng)。然而，在用包含那他霉素和腐霉利二者的組合物處理蘋果時(shí)，第12天和第13天12個(gè)經(jīng)處理的蘋果中僅5個(gè)觀察到霉菌生長(zhǎng)，第14到25天12個(gè)經(jīng)處理的蘋果中僅6個(gè)觀察到霉菌生長(zhǎng)(見表11)。另外，針對(duì)那他霉素和腐霉利的活性成分組合觀察的抗真菌活性比預(yù)期的抗真菌活性超出12%到>50%。因此，協(xié)同因子從第13天的1.2提高至第25天的2.9(見表12)。
[0094]因此，該實(shí)施例明確證實(shí)蘋果上250ppm那他霉素和250ppm腐霉利的組合應(yīng)用的協(xié)同抗真菌效應(yīng)。
0095]實(shí)施例10
0096]體外(In vitro)抗真菌活性
0097]為了證實(shí)那他霉素與異菌脲、乙烯菌核利或腐霉利任一的組合針對(duì)Botrytiscinerea的協(xié)同抗真菌活性，使用96孔微量滴定板進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。測(cè)試以下的組合物:
0098]-對(duì)照(無(wú)活性成分)，
0099]-1.25ppm 那他霉素(DSM Food Specialties, Delft,荷蘭),
0100]-3.0 或 8.0pp m 異菌脲，
0101]-1.5或7.0ppm乙烯菌核利，
0102]-1.25 或 2.0ppm 腐霉利，
0103]-1.25ppm那他霉素+3.0ppm異菌脲，
0104]-1.25ppm那他霉素+8.0ppm異菌脲，
0105]-1.25ppm那他霉素+1.5ppm乙烯菌核利，
0106]-1.25ppm那他霉素+7.0ppm乙烯菌核利，
0107]-1.25ppm那他霉素+1.25腐霉利，
0108]-1.25ppm那他霉素+2.0腐霉利。
0109]用84 μ I PCB培養(yǎng)基填充微量滴定板的每個(gè)孔后，從制備于PCB培養(yǎng)基或甲醇中的單獨(dú)的儲(chǔ)備溶液中添加活性成分，這導(dǎo)致每孔100 μ I的中間體積。隨后，使用制備于PCB培養(yǎng)基中的100 μ I Botrytis cinerea懸浮液，以2.5χ103孢子/ml接種每個(gè)孔。因此,每個(gè)孔含有200 μ I的終體積和< 1%的甲醇,這不影響B(tài)otrytis cinerea的生長(zhǎng)(數(shù)據(jù)未展示)O
[0110]將微量滴定板在25°C下孵育后，通過(guò)計(jì)算與無(wú)活性成分時(shí)觀察到的霉菌生長(zhǎng)相比，存在活性成分時(shí)觀察到的霉菌生長(zhǎng)的減少，來(lái)評(píng)價(jià)個(gè)體活性成分的體外抗真菌活性(以％計(jì))。根據(jù)Colby方程(Colby，1967)計(jì)算活性成分組合的預(yù)期抗真菌活性(E，以％計(jì)):
[0111]E = X+Y-[(X.Y)/100]
[0112]其中X和Y分別是個(gè)體活性成分X和Y的觀察到的抗真菌活性(以％計(jì))。如果組合的觀察到的抗真菌活性(0，以％計(jì))超出組合的預(yù)期抗真菌活性(E，以％計(jì))并且因而協(xié)同因子0/E > 1.0，那么活性成分的組合應(yīng)用導(dǎo)致協(xié)同的抗真菌效應(yīng)。
[0113]結(jié)果顯示，與單獨(dú)的那他霉素、異菌脲、乙烯菌核利或腐霉利相比，那他霉素+異菌脲(見表13)、那他霉素+乙烯菌核利(見表14)和那他霉素+腐霉利(見表14)的活性成分組合更有效地抑制Botrytis cinerea的生長(zhǎng)。針對(duì)那他霉素與異菌脲、乙烯菌核利或腐霉利的組合觀察到的抗真菌活性比預(yù)期的抗真菌活性高25%到100%。因此，相應(yīng)的協(xié)同因子均超過(guò)1.0。
[0114]因此，那他霉素+異菌脲、那他霉素+乙烯菌核利和那他霉素+腐霉利的活性成分組合協(xié)同地抑制了 Botrytis cinerea的生長(zhǎng)。
[0115]實(shí)施例11
[0116]體外抗真菌活性
[0117]如實(shí)施例10中所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不同之處在于測(cè)試以下的組合物:
[0118]-對(duì)照(無(wú)活性成分)，
[0119]-0.63ppm 那他霉素(DSM Food Specialties, Delft,荷蘭),
[0120]-5.0ppm乙烯菌核利，
[0121]-10 或 50ppm 腐霉利，
[0122]-0.63ppm那他霉素+5.0ppm乙烯菌核利，
[0123]-0.63ppm那他霉素+IOppm`腐霉利，
`[0124]-0.63ppm那他霉素+50ppm腐霉利。
[0125]另外,使用Penicillium italicum接種。根據(jù)實(shí)施例10中所述方法測(cè)定個(gè)體活性成分和組合的活性成分的抗真菌活性(以％計(jì))。
[0126]結(jié)果(見表15)揭示了那他霉素+乙烯菌核利和那他霉素+腐霉利的活性成分組合比個(gè)體的那他霉素、乙烯菌核利或腐霉利更有效地抑制Penicillium italicum的生長(zhǎng)。另外，針對(duì)活性成分組合那他霉素+乙烯菌核利和那他霉素+腐霉利觀察到的抗真菌活性比預(yù)期的抗真菌活性超出50%，因此獲得遠(yuǎn)大于1.0的協(xié)同因子。
[0127]因此，那他霉素+乙烯菌核利和那他霉素+腐霉利的活性成分組合具有抵抗Penicillium italicum的強(qiáng)烈協(xié)同抗真菌活性。
[0128]表1.用包含500ppm那他霉素、2000ppm腐霉利任一或二者兼有的組合物處理后，在20°C下孵育的長(zhǎng)有霉菌的草莓?dāng)?shù)。
[0129]
【權(quán)利要求】
1.包含多烯抗真菌化合物和至少一種來(lái)自二羧酰亞胺殺真菌劑家族的抗真菌化合物的組合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述至少一種來(lái)自二羧酰亞胺殺真菌劑家族的抗真菌化合物選自由惡唑菌酮、氟氯菌核利、乙菌利、菌核利、異菌脲、異瓦二酮、甲菌利、腐霉利和乙烯菌核利組成的組。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述多烯抗真菌化合物是那他霉素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物還包含至少一種選自下組的額外的化合物，所述組由粘著劑、載劑、著色劑、保護(hù)性膠體、粘合劑、除草劑、月巴料、增稠劑、掩蔽劑、觸變劑、表面活性劑、其他抗微生物化合物、洗滌劑、防腐劑、鋪展劑、填充劑、噴霧油、流動(dòng)添加劑、礦物質(zhì)、溶劑、分散劑、乳化劑、濕潤(rùn)劑、穩(wěn)定劑、消泡劑、緩沖劑、UV-吸收劑和抗氧化劑組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述多烯抗真菌化合物的量在從0.005g/l到約100g/l的范圍內(nèi)，所述至少一種來(lái)自二羧酰亞胺殺真菌劑家族的抗真菌化合物的量在從約0.0OOlg/Ι到約2000g/l的范圍內(nèi)。
6.包含多烯抗真菌化合物和至少一種來(lái)自二羧酰亞胺殺真菌劑家族的抗真菌化合物的試劑盒。
7.通過(guò)用多烯抗真菌化合物和至少一種來(lái)自二羧酰亞胺殺真菌劑的抗真菌化合物處理產(chǎn)品來(lái)保護(hù)產(chǎn)品抵抗真菌的方法。
8.根據(jù)權(quán)利要求 7所述的方法，其中用根據(jù)權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)所述的組合物或根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒來(lái)處理所述產(chǎn)品。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其中所述產(chǎn)品選自由食品、飼料產(chǎn)品、藥物產(chǎn)品、化妝品產(chǎn)品和農(nóng)產(chǎn)品組成的組。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述產(chǎn)品是農(nóng)產(chǎn)品。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述產(chǎn)品在收獲后被處理。
12.包含多烯抗真菌化合物和至少一種來(lái)自二羧酰亞胺殺真菌劑家族的抗真菌化合物的產(chǎn)品。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的產(chǎn)品，其中所述產(chǎn)品選自由食品、飼料產(chǎn)品、藥物產(chǎn)品、化妝品產(chǎn)品和農(nóng)產(chǎn)品組成的組。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的產(chǎn)品，其中所述產(chǎn)品是農(nóng)產(chǎn)品。
15.多烯抗真菌化合物和至少一種來(lái)自二羧酰亞胺殺真菌劑家族的抗真菌化合物用于保護(hù)產(chǎn)品抵抗真菌的用途。
【文檔編號(hào)】A01N43/76GK103429084SQ201280011591
【公開日】2013年12月4日 申請(qǐng)日期:2012年3月1日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月3日
【發(fā)明者】雅各布斯·斯塔克, 安格里克·里克·德 申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司