酸穩(wěn)定的蛋白酶在動(dòng)物飼料中的用途，優(yōu)選地是增加球蟲(chóng)疫苗接種的肉雞的生產(chǎn)性能的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及與禽的抗球蟲(chóng)疫苗接種相結(jié)合的至少一種酸穩(wěn)定的蛋白酶的用途，用于增加疫苗接種的動(dòng)物的生產(chǎn)性能。出乎意料的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)將根據(jù)本發(fā)明的至少一種酸穩(wěn)定的蛋白酶添加至“球蟲(chóng)”疫苗接種的禽食物中顯著地改進(jìn)了動(dòng)物的生產(chǎn)性能。諸位發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，尤其是使用絲氨酸蛋白酶改進(jìn)了疫苗接種的肉雞的生產(chǎn)性能，特別是使用絲氨酸蛋白酶增加了體重增加并且改進(jìn)了球蟲(chóng)疫苗接種的禽的飼料轉(zhuǎn)化率(FCR)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】酸穩(wěn)定的蛋白酶在動(dòng)物飼料中的用途，優(yōu)選地是增加球蟲(chóng) 疫苗接種的肉雞的生產(chǎn)性能

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及動(dòng)物飼料中酸穩(wěn)定的蛋白酶與抗球蟲(chóng)劑相結(jié)合的用途，尤其涉及此類(lèi) 蛋白酶用于增加接種動(dòng)物的生產(chǎn)性能的用途。
[0002] 動(dòng)物飼料中蛋白酶的用途從以下文件中獲悉：
[0003] W095/28850披露了一種動(dòng)物飼料添加劑，它包括植酸酶和蛋白水解酶。各類(lèi)蛋白 水解酶在第7頁(yè)中具體指明。
[0004] W096/05739披露了一種酶飼料添加劑，它包括木聚糖酶和蛋白酶。適宜的蛋白酶 在第25頁(yè)中列出。W095/02044披露了衍生自棘孢曲霉的蛋白酶，以及它在動(dòng)物飼料中的用 途。
[0005] US3966971披露了通過(guò)用一種酸性植酸酶以及可任選地蛋白水解酶，從一種蔬菜 蛋白質(zhì)來(lái)源獲取蛋白質(zhì)的步驟。適宜的蛋白酶在欄2中具體指明。 技術(shù)背景
[0006] 球蟲(chóng)亞綱是一種單細(xì)胞原生動(dòng)物有機(jī)體的通用名稱(chēng)，它們是感染脊椎動(dòng)物和無(wú)脊 椎動(dòng)物的腸道寄生蟲(chóng)。這些有機(jī)體引起球蟲(chóng)病，并且通常停留在小腸，例如結(jié)腸中。對(duì)于農(nóng) 場(chǎng)動(dòng)物而言，感染球蟲(chóng)亞綱不僅嚴(yán)重地降低生長(zhǎng)，還可能會(huì)危及生命。球蟲(chóng)感染的癥狀包括 上皮細(xì)胞損失，腸粘膜剝落以及腹瀉（通常會(huì)伴有血液損失）。對(duì)于某些農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物如家禽而 言，球蟲(chóng)感染會(huì)是致命的，即使不是這樣也嚴(yán)重?fù)p害動(dòng)物的健康。
[0007] 家禽尤其易患球蟲(chóng)病，原因如下：（1) 6至8天的寄生周期會(huì)在第2周至第4周的關(guān) 鍵階段襲擊家禽，此時(shí)家禽通常會(huì)表現(xiàn)出最大化的生長(zhǎng)。因?yàn)榧纳x(chóng)基本上損壞了整個(gè)小 腸上皮，所以營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收劇烈減少，這就導(dǎo)致了生長(zhǎng)的明顯抑制。在第5或6周被屠宰 之前，沒(méi)有足夠的時(shí)間來(lái)恢復(fù)。（2)能感染家禽的艾美球蟲(chóng)屬物種有7種，比其他任何動(dòng)物 種類(lèi)都多，并且其中它們中至少有4種在商業(yè)運(yùn)行中是常見(jiàn)的。因此，當(dāng)一個(gè)感染周期結(jié)束 時(shí)，另一個(gè)周期可能出于初始階段，這樣球蟲(chóng)病就變成慢性的。（3)在家禽體內(nèi)觀察到最具 致病性的物種（柔嫩艾美球蟲(chóng)、毒害艾美球蟲(chóng)），它們誘發(fā)嚴(yán)重的出血，并且在某些情況下 所造成的死亡率能高達(dá)50%。這種緊急球蟲(chóng)病事件能很容易摧毀一個(gè)家禽飼養(yǎng)場(chǎng)主。（4) 家禽在厚褥草上密集飼養(yǎng)（一個(gè)家禽舍十萬(wàn)只小雞或更多），促使家禽經(jīng)由食糞接近糞便 中球蟲(chóng)亞綱的傳染階段，并因此使得該疾病通過(guò)整群家禽快速傳播。如果消毒條件并不嚴(yán) 格，則該疾病還將傳播至同一飼養(yǎng)場(chǎng)的其他家禽舍，并且持續(xù)存在數(shù)年。
[0008] 為了對(duì)抗球蟲(chóng)病，動(dòng)物飼料經(jīng)常補(bǔ)充一種球蟲(chóng)抑制劑和/或動(dòng)物會(huì)接種一種 藥物，例如Coecivac^'B,先靈德雅動(dòng)物健康公司（Shering-Plough Animal Health Corporation)的一種抗球蟲(chóng)疫苗。經(jīng)EEC認(rèn)證用于家禽（雞、火雞、嫩雞和蛋雞）的球蟲(chóng)抑 制劑包括磺胺類(lèi)藥、氨丙嘧吡啶、地可喹酯以及離子載體。
[0009] 球蟲(chóng)疫苗接種導(dǎo)致肉雞的生產(chǎn)性能下降，這一點(diǎn)是熟知的。尤其是，球蟲(chóng)疫苗接種 導(dǎo)致飼料攝取和飼料效率的下降。目前，美國(guó)所產(chǎn)的所有肉雞中有20%已接種對(duì)抗球蟲(chóng)病。 預(yù)期，到2020年球蟲(chóng)疫苗接種在美國(guó)肉雞生產(chǎn)中的使用將增加至50%。因此，球蟲(chóng)疫苗接 種的使用對(duì)肉雞生產(chǎn)者具有巨大的經(jīng)濟(jì)影響。
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 出乎意料的是，已發(fā)現(xiàn)將如以下定義的至少一種酸穩(wěn)定的蛋白酶添加至經(jīng)球蟲(chóng)疫 苗接種的禽的食物中，導(dǎo)致動(dòng)物生產(chǎn)性能的顯著改進(jìn)。諸位發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，尤其是絲氨酸蛋白 酶與球蟲(chóng)疫苗接種結(jié)合使用改進(jìn)了肉雞的生產(chǎn)性能。尤其是，使用絲氨酸蛋白酶增加了體 重增加并且改進(jìn)了經(jīng)球蟲(chóng)疫苗接種的鳥(niǎo)類(lèi)的飼料轉(zhuǎn)化率（FCR)。因此，使用此類(lèi)蛋白酶可以 克服有通過(guò)使用這種球蟲(chóng)疫苗接種所造成的問(wèn)題。
[0012] 術(shù)語(yǔ)"鳥(niǎo)類(lèi)"包括家禽，例如火雞、鴨和雞（包括但不限于肉雞、蛋雞）。
[0013] 本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明
[0014] 蛋白酶根據(jù)其催化機(jī)制分為以下幾類(lèi)：絲氨酸蛋白酶（S)、半胱氨酸蛋白酶（C)、 天冬氨酸蛋白酶（A)、金屬蛋白酶（M)以及未知或還未分類(lèi)的蛋白酶（U)，參見(jiàn)《催化酶手 冊(cè)》，A. J. Barrett, N. D. Rawlings, J. F. Woessner (編），學(xué)術(shù)出版社（1998)，尤其是總體介 紹部分。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明所使用的蛋白酶是酸穩(wěn)定的蛋白酶。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的蛋白酶是酸 穩(wěn)定的絲氨酸蛋白酶。術(shù)語(yǔ)絲氨酸蛋白質(zhì)是指絲氨酸肽酶以及如以上手冊(cè)中定義的它們的 宗族（clan)。在該手冊(cè)的1998年版本中，絲氨酸肽酶和它們的宗族在第1章至175章中 進(jìn)行了討論。絲氨酸蛋白酶可以被定義成以下蛋白酶，其中其催化機(jī)制取決于絲氨酸殘基 的羥基基團(tuán)，它充當(dāng)襲擊肽鍵的親核體。根據(jù)本發(fā)明所使用的絲氨酸蛋白酶的實(shí)例是宗族 SA的蛋白酶，例如家族S2(鏈霉菌蛋白酶（Str印togrisin))，例如亞家族S2A(a -裂解蛋 白酶），正如以上手冊(cè)所定義。
[0016] 蛋白酶活性可以通過(guò)以下任何測(cè)定測(cè)量，該測(cè)定中使用了一種底物，它含有與所 討論的蛋白酶的特異性相關(guān)的肽鍵。PH測(cè)定和溫度測(cè)定同樣應(yīng)用于所討論的蛋白酶。PH 值測(cè)定的實(shí)例是pH5、6、7、8、9、10或11。溫度測(cè)定的實(shí)例是30°C、35°C、37°C、40°C、45°C、 5(TC、55°C、6(TC、65t：*7(rC。
[0017] 蛋白酶底物的實(shí)例是酪蛋白、以及pNA底物，例如Suc-AAPF-NA (可以從例如Si gma S7388獲得）。該pNA-底物中的大寫(xiě)字母是指單字母氨基酸密碼。另一個(gè)實(shí)例是Protazyme AK(天青精所染的交聯(lián)酪蛋白，由Megazyme公司制備成片劑T-PRAK)。對(duì)于pH活性和pH穩(wěn) 定性的研究，該pNA-底物是優(yōu)選的，其中對(duì)于溫度活性研究，Protazyme AK底物是優(yōu)選的。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明所使用的酸穩(wěn)定的絲氨酸蛋白酶的起源沒(méi)有限制。因此，術(shù)語(yǔ)蛋白酶 不僅包括自然或野生型的蛋白酶，還包括它們的展示出蛋白酶活性的任一突變體、變體、片 段等等，以及合成的蛋白酶，例如改組蛋白酶以及共有蛋白酶。此類(lèi)基因工程處理的蛋白酶 可以按照本領(lǐng)域通常所知的方法制備，例如通過(guò)定點(diǎn)突變、通過(guò)PCR(使用含有所希望突變 的一個(gè)PCR片段作為PCR反應(yīng)的引物之一），或通過(guò)隨機(jī)突變。共有蛋白質(zhì)的制備在例如 EP0897985 中說(shuō)明。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明所使用的酸穩(wěn)定的蛋白酶的實(shí)例是
[0020] a)從擬諾卡氏菌屬NRRL18262以及無(wú)色擬諾卡氏菌衍生的蛋白酶；
[0021] b)與以下（i)的任一蛋白酶具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或 至少95%氨基酸同一性的蛋白酶；
[0022] c)與以下任一序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或至少95% 同一性的蛋白酶：SEQ ID N0:1，和/或SEQ ID N0:2。
[0023] 為了計(jì)算百分?jǐn)?shù)同一性，可以使用本領(lǐng)域已知的任何計(jì)算機(jī)程序。此類(lèi)計(jì)算機(jī) 程序的實(shí)例是Clustal V算法（Higgins，D.G·，和Sharp，P.M. (1989)，基因（阿姆斯特 丹（Amsterdam)) 73, 237-244 ;以及GAP程序，由GCG第8版程序包提供（威斯康辛數(shù)據(jù) 包的程序操作（Program Manual for the Wisconsin Package)，第8版，遺傳計(jì)算機(jī)基團(tuán) (Genetics Computer Group)，575 科學(xué)驅(qū)動(dòng)（Science Drive)，麥迪遜（Madison)，威斯康 辛州（Wisconsin)，美國(guó) 53711) (Needleman, S. B.和 Wunsch, C. D.，（1970)，分子生物學(xué)雜志 (ournal of Molecular Biology,)48,443-453。
[0024] 在一個(gè)特定的實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明所使用的蛋白酶是一種微生物蛋白酶，該術(shù) 語(yǔ)微生物是指該蛋白酶衍生自或源自一種微生物，或是衍生自一種微生物的類(lèi)似物、片段、 變體或合成的蛋白質(zhì)。它可以在該原始野生型微生物菌株、在另一種微生物菌株或一種植 物中產(chǎn)生或表達(dá)，即該術(shù)語(yǔ)涵蓋了野生型、自然發(fā)生的蛋白質(zhì)的表達(dá)，以及任一重組、基因 工程處理或合成蛋白質(zhì)在宿主中的表達(dá)。
[0025] 微生物的實(shí)例是細(xì)菌，例如放線菌門(mén)的細(xì)菌，例如綱I的：放線菌綱，例如亞綱V 的：放線菌亞綱，例如目I的：放線菌目，例如亞目XII的：鏈孢囊菌亞目，例如科II的：擬 諾卡氏菌科，例如屬I(mǎi)的：擬諾卡氏菌屬，例如擬諾卡氏菌屬物種NRRL18262和無(wú)色擬諾卡 氏菌，例如芽胞桿菌屬物種，或它們的展示出蛋白酶活性的突變體或變體。這種分類(lèi)法的根 據(jù)是伯杰氏細(xì)菌系統(tǒng)分類(lèi)學(xué)手冊(cè)（Berge's Manual of Systematic Bacteriology),第二 版，2000,斯普林格（Springer)(預(yù)印本：伯杰氏路線圖（Road Map to Bergey's))。
[0026] 微生物的其他實(shí)例是真菌，例如酵母或絲狀真菌。
[0027] 在根據(jù)本發(fā)明的用途中，該蛋白酶可以在經(jīng)球蟲(chóng)疫苗接種的鳥(niǎo)類(lèi)食物之前、之后 或同時(shí)喂給動(dòng)物。后者是優(yōu)選的。
[0028] 在本文中，術(shù)語(yǔ)酸穩(wěn)定的是指該純蛋白酶的蛋白酶活性，以相當(dāng)于A28(l = 1. 0的稀 釋?zhuān)⑶译S后在以下緩沖液中在37C孵育2小時(shí)：
[0029] · 100mM 琥珀酸、100mM HEPES、100mM CHES、
[0030] · 100mM CABS、lmM CaCl2、150mM KC1、0. 01%Triton? Χ-1〇〇、ρΗ3· 5，
[0031] 是參比活性的至少40%，如使用在此實(shí)例1中所說(shuō)明的測(cè)定所測(cè)量（底物： Suc-AAPF-pNA, pH9. 0, 25〇C )〇
[0032] 在以上酸穩(wěn)定性定義的特定實(shí)施例中，該蛋白酶活性是該參比活性的至少45%、 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或至少 97%。
[0033] 術(shù)語(yǔ)參比活性是指相同蛋白酶，按照對(duì)應(yīng)于A28(l= 1.0的稀釋、以純化形式在5C 下在以下緩沖液中孵育2小時(shí)后的蛋白酶活性：100mM琥珀酸、lOOmM HEPES、100mM CHES、 100mM CABS、lmM CaCl2、150mM KCl、0.01%Trit〇n?X-l〇〇、pH9.0,其中該活性如以上說(shuō)明確 定。
[0034] 換言之，確定酸穩(wěn)定性的方法包括以下步驟：
[0035] a)有待測(cè)試的蛋白酶樣本（處于純化形式，A28(l = 1. 0)被分成兩等份（I和II);
[0036] b)等份I在37°C和pH3. 5下孵育2小時(shí)；
[0037] c)測(cè)量等份I的殘余活性（ρΗ9· 0和25°C );
[0038] d)等份II在5°C和pH9. 0下孵育2小時(shí)；
[0039] e)測(cè)量等份II的剩余活性（ρΗ9· 0和25°C );
[0040] f)計(jì)算等份I的殘余活性相對(duì)于等份II的殘余活性的百分?jǐn)?shù)。
[0041] 可替代地，在酸穩(wěn)定性的以上定義中，步驟b)緩沖液pH值可以是1.0、1.5、2.0、 2· 5、3· 0、3· 1、3· 2、3· 3 或 3. 4。
[0042] 在與以上可替代的步驟b)緩沖液pH值相關(guān)的以上酸穩(wěn)定性定義的其他可替代 的實(shí)施例中，該殘余蛋白酶活性與參比值相比，是至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、 35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或至少 97%。
[0043] 在可替代的實(shí)施例中，口!1值6.0、6.5、7.0、7.5、8.0或8.5可以應(yīng)用至步驟(1)緩 沖液。
[0044] 在以上酸穩(wěn)定性的定義中，術(shù)語(yǔ)A28(l= 1.0是指所述純蛋白酶的此類(lèi)濃度（稀 釋?zhuān)?，它?80nm下在lcm路徑長(zhǎng)度的比色皿中相對(duì)于一種緩沖液空白產(chǎn)生1. 0的吸收。
[0045] 并且在以上酸穩(wěn)定性的定義中，術(shù)語(yǔ)純蛋白酶是指一個(gè)樣本，它的A28(i/A 26(i比率大 于或等于1.70。
[0046] 在另一個(gè)特定的實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明所使用的蛋白酶除了酸穩(wěn)定之外，還是熱 穩(wěn)定的。
[0047] 術(shù)語(yǔ)熱穩(wěn)定的是指以下情況中的一種或多種：該溫度最適宜是至少50°C、52°C、 54。〇、561：、581：、601：、621：、641：、661：、681：、或至少701：。
[0048] 當(dāng)然，該蛋白酶應(yīng)當(dāng)以一個(gè)有效的量值來(lái)應(yīng)用，即以一個(gè)量值，它足以用于改進(jìn)用 一種抗球蟲(chóng)疫苗來(lái)接種的禽的飼料轉(zhuǎn)化率。
[0049] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)例中，該蛋白酶的預(yù)期劑量是每千克最終飼料0.01_200mg蛋白 酶。
[0050] 術(shù)語(yǔ)飼料轉(zhuǎn)化率是根據(jù)一個(gè)生長(zhǎng)試驗(yàn)確定的，該試驗(yàn)包括一個(gè)第一處理，其中根 據(jù)本發(fā)明的組合物按照每千克飼料適宜的濃度添加至動(dòng)物飼料中，以及一個(gè)第二處理（對(duì) 照），沒(méi)有將該組合物添加至動(dòng)物飼料中。
[0051] 如通常所知，改進(jìn)的FCR比對(duì)照FCR低。在特定的實(shí)施例中，與對(duì)照相比，F(xiàn)CR被 改進(jìn)（即減少）至少1.0%或5%。
[0052] 對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的用途，該蛋白酶不需要那么純；它可以是例如包括其他酶類(lèi)，甚 至其他酸穩(wěn)定的蛋白酶，其中它可以被命名為一種酶或蛋白酶制品。然而，一種很好定義的 酶/蛋白酶制品是具有優(yōu)勢(shì)的。例如，它更容易將一種蛋白酶劑量正確地加入到飼料中，該 蛋白酶基本上不會(huì)干擾或污染其他蛋白酶。術(shù)語(yǔ)劑量正確地加入尤其是指獲得一致且恒定 結(jié)果的目的，以及根據(jù)所希望的效果優(yōu)化劑量的能力。
[0053] 在家禽飼養(yǎng)概念的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，該蛋白酶以一種飼料添加劑的形式使用。
[0054] 將如以上在此示例的飼料添加劑的組合物合并到家禽飼料中在實(shí)際情況下是使 用一種濃縮劑或一種預(yù)混料進(jìn)行的。預(yù)混料是指一種或多種微小成分與稀釋劑和/或載體 的一種優(yōu)選地均勻的混合物。預(yù)混料用于促進(jìn)微小成分在較大混合物中均勻分散。根據(jù)本 發(fā)明的一種預(yù)混料可以作為固體（例如作為水溶性粉末）或液體添加到飼料成分或飲用水 中。
[0055] 本發(fā)明的酸穩(wěn)定的蛋白酶的一部分，本發(fā)明的動(dòng)物飼料添加劑含有至少一種-脂 溶性維生素、和/或至少一種水溶性維生素、和/或至少一種痕量礦物質(zhì)、和/或至少一種 巨量礦物質(zhì)。
[0056] 此外，任選的飼料添加劑成分是著色劑，例如類(lèi)胡蘿卜素像β_胡蘿卜素、蝦 青素、角黃素、阿卜酯以及葉黃素；芳香化合物；穩(wěn)定劑；抗微生物肽類(lèi)；多不飽和脂肪 酸（PUFAs);產(chǎn)生活性氧的物質(zhì)；和/或至少一種選自下組的酶：植酸酶（EC3. 1.3. 8 或3. 1. 3. 26);木聚糖酶（EC3. 2. 1. 8);半乳聚糖酶（EC3. 2. 1. 89) ; α -半乳糖苷酶 (EC3. 2. 1. 22);蛋白酶（EC3. 4.，磷脂酶 A1(EC3. 1. 1. 32);磷脂酶 A2(EC3. 1. 1. 4);溶血磷 脂酶（EC3. 1. 1. 5);磷脂酶C(EC3. 1. 4. 3);磷脂酶D(EC3. 1. 4. 4);淀粉酶例如像α -淀粉酶 (EC3. 2. 1. 1);和 / 或 β -葡聚糖酶（EC3. 2. 1. 4 或 EC3. 2. 1. 6)。
[0057] 抗微生物肽類(lèi)（AMP)的實(shí)例是CAP18、林可霉素 A(Leucocin A)、Protegrin-1、 Thanatin、死亡素（Defensin)、Lactoferrin、牛乳鐵蛋白抗菌膚（Lactoferricin)、以及 Ovispirin 例如 Novispirin (Robert Lehrer, 2000)、Plectasins、以及他汀類(lèi)。
[0058] 多不飽和脂肪酸的實(shí)例是C18、C20和C22多不飽和脂肪酸，例如花生四烯酸、 二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸以及亞油酸。
[0059] 產(chǎn)生活性氧的物質(zhì)的實(shí)例是化學(xué)物質(zhì)例如過(guò)硼酸鹽、過(guò)硫酸鹽、或過(guò)碳酸鹽；以及 酶類(lèi)例如氧化酶、加氧酶或合成酶。
[0060] 通常，脂溶-和水溶-性維生素、以及痕量礦物質(zhì)形成了一種所謂的旨在添加到飼 料中的預(yù)混料的一部分，其中巨量礦物質(zhì)通常被分開(kāi)地添加到飼料中。
[0061] 以下是這些組分的實(shí)例的非排外性列表：
[0062] -脂溶性-維生素的實(shí)例是維生素 A、維生素 D3、維生素 E和維生素 K，例如維生素 K3〇
[0063] -水溶性-維生素的實(shí)例是維生素 Β12,生物素和膽堿、維生素 Β1、維生素 Β2、維生 素 Β6、煙酸、葉酸和泛酸鹽，例如Ca-D-泛酸鹽。
[0064] -痕量礦物質(zhì)的實(shí)例是錳、鋅、鐵、銅、碘、硒和鈷。
[0065]-巨量礦物質(zhì)的實(shí)例是鈣、磷和鈉。
[0066] 預(yù)混料（每噸家禽飼料）可以包含，例如50至200g這些活性化合物的混合物的丙 二醇溶液，20至1000g的一種乳化劑，50至900g谷物和副產(chǎn)品，20至100g的一種蛋白質(zhì)支 持物（奶粉、酪蛋白等）以及50至300g的一種礦物質(zhì)組分（多空娃膠（expanded silica)、 飼料質(zhì)量石灰、二鈣磷酸鹽等）。
[0067] 如以上說(shuō)明的一種飼料添加劑或預(yù)混料最終被添加到動(dòng)物飼料組合物。該組合物 如此制備并添加，使得該蛋白酶的量值對(duì)應(yīng)于每千克飼料預(yù)期添加0. 01-200mg蛋白酶蛋 白質(zhì)。
[0068] 動(dòng)物飼料組合物或食物具有較高含量的蛋白質(zhì)。根據(jù)以上所提及的美國(guó)國(guó)家研究 委員會(huì)（NRC)的公開(kāi)文件，家禽和豬食物可以如W001/58276的表B所指描述。根據(jù)本發(fā)明 的動(dòng)物飼料組合物的粗蛋白含量是50-800g/kg，并且進(jìn)一步含有如在此主張的至少一種蛋 白酶。
[0069] 此外，或可替代（以上指出的粗蛋白含量），本發(fā)明的動(dòng)物飼料組合物的可代謝 能量的含量是10_30MJ/kg ;和/或鈣含量是0. l-200g/kg ;和/或可獲得的磷的含量是 0. l-200g/kg ;和/或甲硫氨酸的含量是0. l-100g/kg ;和/或甲硫氨酸加半胱氨酸的含量 是0· l-150g/kg ;和/或賴(lài)氨酸的含量是0· 5-50g/kg。
[0070] 在特定的實(shí)施例中，可代謝能量、粗蛋白質(zhì)、鈣、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨 酸、和/或賴(lài)氨酸的含量在如W001/58276的表B所披露的2、3、4或5范圍中的任何一個(gè)。
[0071] 為了確定每千克飼料的蛋白酶蛋白質(zhì)的mg，該蛋白酶從該飼料組合物純化，并且 使用一種相對(duì)測(cè)定來(lái)確定該純化的蛋白酶的特異活性（參見(jiàn)蛋白酶活性、底物和測(cè)定部 分）。此類(lèi)飼料組合物的蛋白酶活性還使用同一測(cè)定來(lái)確定，并且根據(jù)這兩個(gè)確定結(jié)果，計(jì) 算每kg飼料的蛋白酶mg的劑量。
[0072] 相同的原理用于確定飼料添加劑中的蛋白酶蛋白質(zhì)mg。
[0073] 根據(jù)本發(fā)明的擬諾卡氏菌屬NRRL18262的蛋白酶可以使用常規(guī)方法準(zhǔn)備，如通常 在W001/58276中說(shuō)明。一種含有擬諾卡氏菌屬NRRL18262的蛋白酶的飼料添加劑也是可商 購(gòu)的（例如像R〇n〇zyme?ProAct，由帝斯曼營(yíng)養(yǎng)品公司（DSM Nutritional Products)， 凱澤勞斯特（Kaiseraugst)，瑞士提供）或可以很容易由技術(shù)人員使用本領(lǐng)域所熟知的步 驟和方法制備。
[0074] 在此說(shuō)明并主張的本發(fā)明并非局限于在此披露的特定的實(shí)施例的范圍之內(nèi)，因?yàn)?這些實(shí)施例旨在闡述本發(fā)明的某些方面。任何等價(jià)的實(shí)施例旨在處于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。 實(shí)際上，除了在此顯示并說(shuō)明的那些之外，本發(fā)明的各種修改將在之前的說(shuō)明書(shū)對(duì)本領(lǐng)域 的普通技術(shù)人員而言應(yīng)當(dāng)是顯而易見(jiàn)的。此類(lèi)修改還旨在處于所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。 [0075] 以下實(shí)例進(jìn)一步闡明了本發(fā)明。
[0076] 實(shí)例
[0077] 實(shí)例ΙρΗ穩(wěn)定性測(cè)定
[0078] Suc-AAPF-pNA(Sigma S-7388)用來(lái)獲取 pH 穩(wěn)定性特征。
[0079] 測(cè)定緩沖液：100mM 琥珀酸、lOOmM HEPES、100mM CHES、100mM CABS、lmM CaCl2、 150mM KC1、0. 01%Trit〇n*:X-100,使用 HC1 或NaOH將 pH值調(diào)整至 2· 0、2· 5、3· 0、3· 5、4· 0、 4· 5、5· 0、60、7· 0、8· 0、9· 0、10· 0 或 11. 0。
[0080] 每個(gè)蛋白酶樣品（在ImM琥珀酸、2mM CaCl2、100mM NaCl中、ρΗ6. 0并且A28Q吸收 >10)在每個(gè)pH值下用該測(cè)定緩沖液稀釋至A28(l= 1.0。經(jīng)稀釋的蛋白酶樣品在37°C孵育 2小時(shí)。
[0081] 孵育后，蛋白酶樣品在 lOOmM 琥珀酸、lOOmM HEPES、100mM CHES、100mM CABS、lmM CaCl2、150mM KC1、0. Ol^Tritoi^' X-100, ΡΗ9· 0 稀釋?zhuān)袠悠返?pH 變成 ρΗ9· 0。
[0082] 在以下活性測(cè)量過(guò)程中，溫度為25°C。
[0083] 300 μ 1經(jīng)稀釋的蛋白酶樣品與1. 5ml pH9. 0的測(cè)定緩沖液混合，并且該活性反應(yīng) 通過(guò)加入1. 5ml pNA底物（50mg溶解在1. 0ml DMS0中，并進(jìn)一步用0· Ol^THton^X-lOO 稀釋45x)起始，并且，混合后，通過(guò)分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)?％的增加，作為該（殘余）蛋白酶活 性的測(cè)量值。
[0084] 37C孵育在不同pH值條件下進(jìn)行，并且活性測(cè)量值按照殘余活性對(duì)比pH作圖。將 殘余活性用平行孵育（對(duì)比）的活性歸一化，其中該蛋白酶在該測(cè)定緩沖液中在PH9.0被 稀釋至A 28(1 = 1. 0,并且在活性測(cè)量前在5°C孵育2小時(shí)，正如其他孵育。在活性測(cè)量前將 蛋白酶樣品稀釋?zhuān)源_保所有活性測(cè)量值處于該測(cè)定的劑量-反應(yīng)曲線的線性部分內(nèi)。
[0085] 實(shí)例2-用酸穩(wěn)定的蛋白酶飼養(yǎng)疫苗接種的禽
[0086] 使用日齡雄性禽R〇ss708進(jìn)行地面圍欄試驗(yàn)。該試驗(yàn)中使用了共計(jì)27欄，每欄在 1日齡放置禽10只。圍欄在三次處理中隨機(jī)分配，9重復(fù)/處理。這些禽飼以基于玉米/ 大豆食物的營(yíng)養(yǎng)足夠的基本食物，并且通過(guò)從第1至21天飼以一種起始食物，并且從第22 至42天飼一種生長(zhǎng)飼料來(lái)調(diào)整禽齡。
[0087] 處理1 :某本會(huì)物
[0088] Cocci Vac? B在1日齡+食譜Monteban? (球蟲(chóng)抑制劑）80ppm。所有禽在1 日齡在禽舍中經(jīng)鼻飼給藥接受Cocci Vac? B。
[0089] 處理 2 ：
[0090] Cocci Vac? B在 1 日齡，沒(méi)有Monteban'
[0091] 處理 3 ：
[0092] 如處理2加400ppm RONOZYME?酶混合物（由帝斯曼營(yíng)養(yǎng)品公司，凱澤勞斯 特，瑞士提供提供）
[0093] 飼以Monteban，以便抑制Cocci Vac的效果。Cocci Vac通過(guò)造成低水平的疾病 來(lái)誘導(dǎo)對(duì)球蟲(chóng)病的免疫。
[0094] 該酶混合物包括：
[0095] -200ppmR〇N〇ZY!V[EK ProAct(酸穩(wěn)定的蛋白酶）以及
[0096] -lOOpprn RONOZYME WX+50ppm RONOZYME A+50ppm R0XAZYME G2(=酶混合物，包括 木聚糖酶、淀粉酶、纖維素、β-葡聚糖酶以及其他）
[0097] 在該試驗(yàn)?zāi)诘?2天，確定平均鳥(niǎo)重量以及平均飼料消耗，并且通過(guò)飼料攝入 除以每一處理的體重增加來(lái)計(jì)算飼料轉(zhuǎn)化配給（FCR)。
[0098] 這些結(jié)果總結(jié)在下表中，其中表1列舉了第42天的體重，表2列舉了第42天FCR。
[0099] 表1平均42天體重
[0100]
[0101] abcP<0. 05

【權(quán)利要求】
1. 與禽的抗球蟲(chóng)疫苗接種相結(jié)合的至少一種酸穩(wěn)定的蛋白酶的用途，用于增加體重增 加和/或改進(jìn)該動(dòng)物的飼料轉(zhuǎn)化率（FCR)，其中該蛋白酶與以下各項(xiàng)具有至少70%的同一 性⑴ SEQ ID ΝΟ:1，和 / 或（ii)SEQ ID NO:2。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中該蛋白酶用于在針對(duì)禽的飼料中使用，包括家禽例如 火雞、鴨和雞。
3. 如權(quán)利要求2所述的用途，其中該蛋白酶的預(yù)期劑量是每千克飼料0. 01-200mg蛋白 酶蛋白質(zhì)。
4. 一種針對(duì)疫苗接種的禽的動(dòng)物飼料添加劑，包括（a)至少一種酸穩(wěn)定的蛋白酶以及 (b)至少一種脂溶性維生素，和/或（c)至少一種水溶性維生素，和/或（d)至少一種痕量 礦物質(zhì)，和/或（e)至少一種巨量礦物質(zhì)；其中該蛋白酶與以下各項(xiàng)具有至少70%的同一 性⑴ SEQ ID ΝΟ:1，和 / 或（ii)SEQID NO:2。
5. 如權(quán)利要求4所述的動(dòng)物飼料添加劑，其中該蛋白酶的量值對(duì)應(yīng)于每千克飼料預(yù)期 添加0. 01-200mg蛋白酶蛋白質(zhì)。
6. 如權(quán)利要求4或5所述的動(dòng)物飼料添加劑，進(jìn)一步包括植酸酶、木聚糖酶、半乳聚糖 酶、β -葡聚糖酶、淀粉酶和/或纖維素。
7. -種針對(duì)疫苗接種的禽的動(dòng)物飼料組合物，其具有50-800g/kg的粗蛋白質(zhì)含量并 且包括至少一種酸穩(wěn)定的蛋白酶，其中該蛋白酶與以下各項(xiàng)具有至少70%的同一性（i)SEQ ID ΝΟ:1，和 / 或（ii)SEQ ID NO:2。
8. 如權(quán)利要求7所述的動(dòng)物飼料組合物，其中該蛋白酶的量值是每千克飼料 0.01-200mg蛋白酶蛋白質(zhì)。
【文檔編號(hào)】A23K1/18GK104114034SQ201280056288
【公開(kāi)日】2014年10月22日 申請(qǐng)日期:2012年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月17日
【發(fā)明者】N.沃德, I.奈普 申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司, 諾維信公司