專利名稱：一種假單胞菌發(fā)酵上清液的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種假單胞菌發(fā)酵上清液在制備治療或預(yù)防植物根結(jié)線蟲病藥物中的應(yīng)用，還涉及一種假單胞菌發(fā)酵上清液在制備治療或預(yù)防辣椒灰霉病藥物中的應(yīng)用，還涉及一種假單胞菌發(fā)酵上清液在辣椒促生長中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
根結(jié)線蟲病是一種世界性分布的土傳病害，給許多國家的農(nóng)林、園藝等產(chǎn)業(yè)造成很大損失。根結(jié)線蟲(Meloidogyne.spp)遍布于各地的土壤，在較溫暖的地域繁殖特別普遍。根結(jié)線蟲是分布最廣、為害最重的植物寄生線蟲，已引起世界各國的關(guān)注。到目前為止，已報(bào)道的根結(jié)線蟲有80多種，不僅為害許多經(jīng)濟(jì)作物如大豆、花生、柑桔、香蕉等，而且為害多種蔬菜作物如黃瓜、絲瓜、豇豆、菜豆、茄子、辣椒、番茄及十字花科蔬菜。一般年份減產(chǎn)10% 15%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)30% 40%，甚至絕收。近年來，隨著保護(hù)地蔬菜種植面積的擴(kuò)大，受保護(hù)地密閉、高溫、高濕和復(fù)種指數(shù)增加等因素影響，蔬菜根結(jié)線蟲病呈逐年加重趨勢，并上升為蔬菜生產(chǎn)上的重要病害，在黑龍江、遼寧、北京、河南、湖北、江蘇、云南和海南等地都有過根結(jié)線蟲病嚴(yán)重發(fā)生和流行的報(bào)道。目前，國內(nèi)尚無大量推廣應(yīng)用的抗根結(jié)線蟲病的番茄品種，對番茄根結(jié)線蟲病缺乏有效的防治措施。因此，對番茄根結(jié)線蟲病進(jìn)行系統(tǒng)的研究勢在必行。番茄根結(jié)線蟲病的防治方法包括農(nóng)業(yè)防治、物理防治、化學(xué)防治和生物防治。(I)農(nóng)業(yè)防治:包括水旱輪作、嫁接、改 良土壤、調(diào)節(jié)播種期、種植抗病品種等。(2)物理防治:主要有夏季進(jìn)行土壤熱處理(蒸氣消毒、高溫悶棚、日光暴曬及灌注熱水消毒等)和種子汰選(利用汰選機(jī)或用鹽水、泥漿水漂選，去除帶蟲的種子)，另外還包括水淹兩周以上、射線或超聲波處理等。(3)化學(xué)防治:施用殺線蟲劑仍然是目前防治根結(jié)線蟲病的主要方法，其中溴甲烷土壤消毒在我國占有較大比例，對蔬菜根結(jié)線蟲病防治效果優(yōu)異。但溴甲烷對大氣臭氧層具有破壞作用，目前一些發(fā)達(dá)國家已經(jīng)禁止使用溴甲烷。另外，利用石灰氮土壤消毒，對番茄、西瓜根結(jié)線蟲病防治有明顯效果。(4)生物防治:生物防治是近年來發(fā)展較迅速的一種防治方法。根結(jié)線蟲的天敵主要有真菌、細(xì)菌、病毒、立克氏體、放線菌、捕食性線蟲、渦蟲和原生動物等，其中對細(xì)菌和真菌的生物防治作用研究較多，如巴氏桿菌是一種菌絲型和內(nèi)生孢子型的植物線蟲專性寄生細(xì)菌，在溫室試驗(yàn)中已被證實(shí)可作為一種有效的植物線蟲生防因子，使農(nóng)業(yè)有害線蟲種群密度明顯降低，其中尤以穿刺巴氏桿菌研究最為深入，并在番茄根結(jié)線蟲病防治上取得良好的效果。雖然生物防治已經(jīng)展現(xiàn)出可喜的應(yīng)用前景，但開發(fā)出來的生防制劑還很少，離大規(guī)模推廣應(yīng)用還有距離?；颐共∈锹兜?、保護(hù)地作物常見且比較難防治的一種真菌性病害，屬低溫高濕型病害，病原菌生長溫度為2 30°C，溫度20 25°C、濕度持續(xù)90%以上時(shí)為病害高發(fā)期?；颐共∮苫移咸焰呔秩舅?，該病菌寄主廣泛，可侵染黃瓜、茄子、菜豆番茄，在溫室、大棚較易發(fā)生，尤其以侵染辣椒嚴(yán)重，具有發(fā)病時(shí)間早，面積大，危害重的特點(diǎn)。發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，發(fā)病率達(dá)70% 90%，病葉率達(dá)30%以上，嚴(yán)重者達(dá)到60%以上，造成落葉、落果或果實(shí)腐爛。目前生產(chǎn)上主要依賴于殺菌劑防治灰霉病，由于病菌能在相對較短的時(shí)間里對一些系菌劑產(chǎn)生抗性，加之化學(xué)農(nóng)藥本身具有黔高污染特點(diǎn)，一些農(nóng)業(yè)措施如升溫降濕，遇到連續(xù)陰雨天時(shí)無法實(shí)施，人工加溫又大大增加生產(chǎn)成本；長期以米，病害防治中仍以化學(xué)防治為主，依賴于多菌靈、腐酶利等化學(xué)農(nóng)藥，導(dǎo)致其抗藥性的迅速產(chǎn)生以及對人類對環(huán)境產(chǎn)生不良影響，生物農(nóng)藥有許多互補(bǔ)優(yōu)勢，它能降低灰霉病菌對殺菌劑的選擇性，降低蔬菜中的農(nóng)藥殘留量，同時(shí)也降低了生產(chǎn)成本，因此生物防治灰霉病已成為病原菌綜合治理的重要措施之一，特別是用拮抗微生物防治病害具有重要意義。生物防治由于其低污染、低殘留的特性成為近年研究的重點(diǎn)。無致病假單胞菌是活躍在植物根際的一類微生物，屬Plant Growth-promotingRhizobacteria(PGPR) 一大類,假單胞菌的促生長作用機(jī)理一是產(chǎn)生活性物質(zhì)或改善礦質(zhì)營養(yǎng)直接促進(jìn)植物生長；二是產(chǎn)生代謝物質(zhì)或競爭作用抑制或阻礙根區(qū)病原微生物的發(fā)展，間接促進(jìn)植物的生長。其生防作用機(jī)理包括有效的根部定殖、抗生作用、根際營養(yǎng)競爭(特別是對Fe的競爭)、誘導(dǎo)植物抗性和分泌降解微生物的酶等。最近研究發(fā)現(xiàn)類產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas pseodoalcaligenes)還具有殺蟲作用。從類產(chǎn)堿假單胞菌代謝分泌物中分離到I種殺蟲蛋白，含I種亞基，其分子量為25100道爾頓，等電點(diǎn)5.16，含17種氨基酸(其中谷氨酸含量最高，胱氨酸含量最低)，最大吸收峰為278，在pH值為6.0 10及40°C以下殺蟲蛋白的活性穩(wěn)定，對胃蛋白酶敏感，對胰蛋白酶不敏感，不具溶血性。美國、英國、瑞士、日本、印度、中國等均有人報(bào)道分離到可抗植物病害的熒光假單胞菌，而且常是一株菌能產(chǎn)生幾種活性物質(zhì)抗多種植物病害。美國棉花病理研究所國家實(shí)驗(yàn)室的Howel 1-CR(1980)分離到Pseudomonas fluorescent Pf-5可產(chǎn)生藤黃綠膿素(pyolutorin Pit),卩比咯菌素(pyrrolnitrin Prn), 2，4-二乙?；g苯三酹(2, 4-diacetyIphlorglucinoI PhlD)，嗤鐵素(Siderophores)，氫氰酸(HCN)等抗生素及其它活性物質(zhì)可抗Pythium ultimum等重要植物病原菌。突光假單胞菌的抗病機(jī)理主要是通過產(chǎn)生抗生素等生物活性物質(zhì)來抑制病原菌的生長。假單胞菌具有殺蟲、改善植物營養(yǎng)、降解有毒物質(zhì)、產(chǎn)生抗生素和植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、改善植物微環(huán)境和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性等生物防治作用，其產(chǎn)品開發(fā)對象包括微生物活菌制劑、抗生素及其基因等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供了一種假單胞菌發(fā)酵上清液在制備治療或預(yù)防植物根結(jié)線蟲病藥物中的應(yīng)用，該發(fā)酵上清液對南方根結(jié)線蟲有很強(qiáng)的抑制作用，離體防治效果為100%，活體防效為71.3%。而已知的有防治效果的假單胞菌CHAO發(fā)酵上清液防治效果為52.01%。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供了一種假單胞菌發(fā)酵上清液在制備治療或預(yù)防辣椒灰霉病藥物中的應(yīng)用，該發(fā)酵上清液液對辣椒灰霉病的防治效果達(dá)85.7%，陽性對照多菌靈防治效果為71.4%，說明本發(fā)明的A316發(fā)酵上清液對辣椒灰霉病有更好的抑制作用。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供了一種假單胞菌發(fā)酵上清液在辣椒促生長中的應(yīng)用，本發(fā)明制備的發(fā)酵上清液液對植物有顯著的促生長作用。為了達(dá)到以上目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施:
一種假單胞菌發(fā)酵上清液，其制備步驟如下:
申請人于2010年9月從國家海洋局第三海洋研究所，中國海洋微生物菌種保藏管理中心(MCCC)獲得了一株假單胞菌Pseudomonas sp.MCCC N0.1A00316 ;經(jīng)形態(tài)觀察，生理生化和16S rDNA鑒定,該菌株在分類學(xué)上屬于假單胞菌(Pseudomonas sp.),將該假單胞菌菌株A316 (以下簡稱A316)平板劃線活化，取平板上的單菌落接種到裝有2216E培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)溫度28°C ;搖床轉(zhuǎn)數(shù)180rpm ;培養(yǎng)時(shí)間48h (OD600=L 85)，8000rpm離心15min得到假單胞菌A316發(fā)酵上清液，(以下簡稱A316發(fā)酵上清液)；一種假單胞菌發(fā)酵上清液在制備治療或預(yù)防植物根結(jié)線蟲病藥物中的應(yīng)用，其應(yīng)用過程是:UA316發(fā)酵上清液對南方根結(jié)線蟲的離體實(shí)驗(yàn)I)用96孔板進(jìn)行毒力測定，每孔吸取實(shí)驗(yàn)用二齡線蟲30頭；2)加入上述制得的A316發(fā)酵上清液160ul，用無菌水補(bǔ)充至約200ul ；3)實(shí)驗(yàn)設(shè)置三組:處理組(M+A):A316發(fā)酵上清液+南方根結(jié)線蟲；陽性對照(CK(+)):已知有防效的假單胞菌CHA0( Imran A.Siddiqui, S.Shahid Shaukat, Suppressionof root—knot disease by Pseudomonas fluorescens CHAO in tomato:1mportance ofbacterial secondary metabolite,2，4-diacetylpholoroglucino1.Soil Biology&Biochemistry (2003) 35:1615-1623)發(fā)酵上清液+南方根結(jié)線蟲；陰性對照(CK (-)):清水+南方根結(jié)線蟲；；4) 20°C溫育24h統(tǒng)計(jì)死亡率；12h觀察一次；5)根據(jù)目測觀察以及染色觀察確定死蟲數(shù)量。
權(quán)利要求
1.一種假單胞菌發(fā)酵上清液在制備治療或預(yù)防植物根結(jié)線蟲病藥物中的應(yīng)用； 所述的一種假單胞菌發(fā)酵上清液，其制備步驟是: 將假單胞菌株平板劃線活化，取平板上的單菌落接種到裝有2216E培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)溫度28 °C;搖床轉(zhuǎn)數(shù)180 rpm;培養(yǎng)時(shí)間48 h，至OD6tltl=L 85，8000 rpm離心15 min即得到一種假單胞菌發(fā)酵上清液； 所述的假單胞菌iPseudomonas sp.),保藏在中國海洋微生物菌種保藏管理中心,MCCCN0.1A00316。
2.—種權(quán)利要求1所述的假單胞菌發(fā)酵上清液制備治療或預(yù)防辣椒灰霉病藥物中的應(yīng)用。
3.—種權(quán)利要求1所 述的假單胞菌發(fā)酵上清液在辣椒促生長中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種假單胞菌(Pseudomonassp.)發(fā)酵上清液的應(yīng)用，將假單胞菌菌株平板劃線活化，取平板上的單菌落接種到裝有2216E培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)溫度28℃；搖床轉(zhuǎn)數(shù)180rpm；培養(yǎng)時(shí)間48h，8000rpm離心15min得到一種A316發(fā)酵上清液，該發(fā)酵上清液可用于南方根結(jié)線蟲(Meloidogyneincognita)的防治；其上清在離體可拮抗由灰葡萄孢(Botrytiscinerea)引起的辣椒灰霉病，在溫室活體實(shí)驗(yàn)中有較好防效；對于辣椒具有促生長的作用；具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號A01P3/00GK103109870SQ20131000616
公開日2013年5月22日 申請日期2013年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月8日
發(fā)明者張吉斌, 邵宗澤, 張智濤, 唐佳頻, 李光玉, 景雪萍, 孫鳳芹, 喻子牛 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 國家海洋局第三海洋研究所