一種人骨巨細(xì)胞瘤小鼠動(dòng)物模型及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種動(dòng)物模型及其構(gòu)建方法，骨巨細(xì)胞瘤（GCT）在我國的發(fā)病率較高，目前尚未成功構(gòu)建人骨巨細(xì)胞瘤動(dòng)物模型。本發(fā)明提供了一種人骨巨細(xì)胞瘤小鼠動(dòng)物模型及其構(gòu)建方法，是將從人骨巨細(xì)胞瘤組織分離培養(yǎng)的原代細(xì)胞注射到裸小鼠的脛骨內(nèi)，得到的人骨巨細(xì)胞瘤小鼠動(dòng)物模型。本發(fā)明所建立的人骨巨細(xì)胞瘤骨損傷小鼠動(dòng)物模型中的溶骨性損害特征與臨床上骨巨細(xì)胞瘤的病理特征相似，存活的細(xì)胞為來源于人的骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞。應(yīng)用本發(fā)明的動(dòng)物模型可以用于系統(tǒng)研究骨巨細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)一步篩選治療骨巨細(xì)胞瘤的藥物。
【專利說明】一種人骨巨細(xì)胞瘤小鼠動(dòng)物模型及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種動(dòng)物模型及其構(gòu)建方法，尤其是涉及一種人骨巨細(xì)胞瘤小鼠動(dòng)物模型及其構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]骨巨細(xì)胞瘤(giant cell tumor of bone,GCT)在我國的發(fā)病率較高，占全部骨腫瘤的20%左右，其中脊柱是GCT好發(fā)部位之一(參見文獻(xiàn)Sung H.W.，Kuo D.P.，Shu W.P.，etal.Giant-cell tumor of bone:analysis of two hundred and eight cases in Chinesepatients[J], J Bone Joint Surg Am, 1982，64(5):755-761.)。長征醫(yī)院骨腫瘤科近 5 年平均每年收治脊柱GCT患者在60例以上。GCT具有較強(qiáng)的侵襲性和高復(fù)發(fā)性，術(shù)后局部復(fù)發(fā)率高達(dá) 30-50% (參見文獻(xiàn) Hart R.A., Boriani S., Biagini R., et al.A system forsurgical staging and management of spine tumors.A clinical outcome study ofgiant cell tumors of the spine[J].Spine(Phila Pal976)，1997，22(15):1773-1782;discussionl783.)。對(duì)于脊柱GCT術(shù)后復(fù)發(fā)的患者，由于局部解剖結(jié)構(gòu)的改變，腫瘤惡性程度的升級(jí)，使得再次手術(shù)切除的難度明顯加大，甚至無法進(jìn)行手術(shù)。
[0003]因此，預(yù)防和治療脊柱GCT已成為脊柱腫瘤外科領(lǐng)域的一大難題，亟需探尋新的治療方法。
[0004]探 尋新的治療方法和靶向藥物，首先需要對(duì)GCT的生物學(xué)特征進(jìn)行深入的剖析并建立相應(yīng)的動(dòng)物模型。組織學(xué)研究表明，GCT包含三種特征的細(xì)胞，即具有腫瘤特性的紡錘形基質(zhì)細(xì)胞、破骨細(xì)胞特征的多核巨細(xì)胞和圓形的單核細(xì)胞。多核巨細(xì)胞其具有CD14+和 CD68+ (參見文獻(xiàn) Huang T.S., Green A.D., Beattie C.ff., et al.Monocytenacrophagelineage of giant cell tumor of bone.Establishment of a multinucleated cellline [J].Cancer, 1993，71 (5): 1751-1760.；Liao T.S.，Yurgelun M.B.，Chang S.S.，etal.Recruitment of osteoclast precursors by stromal cell derived factor-1 (SDF-1)in giant cell tumor of bone [J].J Orthop Res，2005，23 (I): 203-209.)，CD14 是外周血單核細(xì)胞的特異性標(biāo)記物之一，而CD68是巨噬細(xì)胞的標(biāo)記物。由此表明，GCT多核巨細(xì)胞來源于血液中的單核細(xì)胞融合而成?；|(zhì)細(xì)胞由于表達(dá)成骨細(xì)胞的早期標(biāo)記物(參見文獻(xiàn) Salerno M., Avnet S., Alberghini M., et al.Histogenetic characterization ofgiant cell tumor of bone[J].Clin Orthop Relat Res，2008，466(9):2081-2091.)被認(rèn)為來源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。通過氣標(biāo)記和DNA陣列、端粒酶活性、染色體拷貝數(shù)等技術(shù)證明了 GCT基質(zhì)細(xì)胞具有遺傳不穩(wěn)定性的特征(參見文獻(xiàn)Roessner A.，von BassewitzD.B.，Schlake W.，et al.Biologic characterization of human bone tumors.1I1.Giant cell tumor of bone.A combined electron microscopical，histochemical，andautoradiographical study [J].Pathol Res Practj 1984，178(5):431-440.；MoskovszkyL., Szuhai K., Krenacs T.,et al.Genomic instability in giant cell tumor ofbone.A study of 52cases using DNA ploidy,relocalization FISH, and array-CGHanalysis[J].Genes Chromosomes Cancer，2009，48(6):468-479.；Gorunova L，Vult vonSteyern F., Storlazzi C.T., et al.Cytogenetic analysis of IOlgiant cell tumorsof bone:nonrandom patterns of telomeric associations and other structuralaberrations[J].Genes Chromosomes Cancer, 2009，48(7):583-602.；Forsyth R.G.，DeBoeck G.,Bekaert S.,et al.Telomere biology in giant cell tumour of bone [J].J Pathol,2008，214(5):555-563.;Gebre-Medhin S.，Broberg K.,Jonson T.，etal.Telomeric associations correlate with telomere length reduction and clonalchromosome aberrations in giant cell tumor of bone[J].Cytogenet GenomeRes，2009，124 (2): 121-127.)。因此，基質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為是GCT中的腫瘤成分。
[0005]然而，采用分離后的基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行裸鼠體內(nèi)荷瘤實(shí)驗(yàn)并不能復(fù)制出臨床GCT的病理學(xué)特征(參見文獻(xiàn) Haque A.U., Moatasim A.Giant cell tumor of bone:a neoplasm ora reactive condition?[J].1nt J Clin Exp Pathol, 2008，I (6):489-501.)。另外，通過將組織塊直接接種在雞胚絨毛囊膜上可短期維持GCT組織的存活，但周期只有10天(參見文獻(xiàn) Balke M., Neumann A., Szuhai K., et al.A short-term in vivo model for giantcell tumor of bone[J].BMC Cancer, 2011，11:241.)。所以，目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道有關(guān)成功構(gòu)建人骨巨細(xì)胞瘤動(dòng)物模型。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種人骨巨細(xì)胞瘤小鼠動(dòng)物模型。
[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種人骨巨細(xì)胞瘤小鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建。
[0008]本發(fā)明的主要技術(shù)方案是，將從人骨巨細(xì)胞瘤組織分離培養(yǎng)的原代細(xì)胞注射到裸小鼠的脛骨內(nèi)，得到的人骨巨細(xì)胞瘤小鼠動(dòng)物模型。
[0009]本發(fā)明的第一方面，是提供了一種人骨巨細(xì)胞瘤小鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，該方法包括如下步驟:
[0010](A)從骨巨細(xì)胞瘤的臨床手術(shù)標(biāo)本中分離出人的骨巨細(xì)胞瘤原代細(xì)胞；
[0011](B)將原代培養(yǎng)的骨巨細(xì)胞瘤細(xì)胞用PBS洗滌，經(jīng)0.25%胰酶消化，血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，采用PBS重懸，使細(xì)胞終濃度為5 XlO4AAil人骨巨細(xì)胞瘤原代細(xì)胞；
[0012](C)采用顯微注射器在X線觀察下，將10~30ul步驟(B)得到的人骨巨細(xì)胞瘤原代細(xì)胞注射到裸小鼠的脛骨內(nèi)；
[0013](D)采用X線觀察裸小鼠脛骨的骨質(zhì)變化情況。
[0014]所述的步驟(B)，具體為:將原代培養(yǎng)的骨巨細(xì)胞瘤細(xì)胞用PBS洗滌2遍，經(jīng)0.25%胰酶37°C消化3分鐘，用等體積含有10%FBS的a -MEM中和，800rmp離心5min，血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，去上清后采用PBS重懸,使細(xì)胞終濃度為5 X IO4個(gè)/ul人骨巨細(xì)胞瘤原代細(xì)胞。
[0015]所述的步驟(C)，具體為:采用顯微注射器在X線觀察下，將20ul步驟(B)得到的人骨巨細(xì)胞瘤原代細(xì)胞注射到裸小鼠的脛骨內(nèi)。
[0016]所述的步驟(D)之后，還包括步驟(E)即:取出裸小鼠脛骨，經(jīng)4%多聚甲醛固定后石蠟包埋，再經(jīng)切片制成4uM組織切片，采用HE、TRAP和抗人線粒體染色，觀察骨組織大體形態(tài)、破骨細(xì)胞活性及細(xì)胞來源。
[0017]所述的步驟(E),具體為:胚骨內(nèi)注射原代骨巨細(xì)胞瘤細(xì)胞2個(gè)月后,麻醉處死裸小鼠，取出脛骨經(jīng)4%多聚甲醛固定24h后，經(jīng)0.5M的EDTA脫鈣10天，再經(jīng)梯度乙醇、二甲苯、石蠟浸泡(即脫水至蠟處理)，石蠟包埋，切成4uM厚度切片。采用HE、TRAP及抗人線粒體免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)人骨巨細(xì)胞瘤骨損傷模型中的溶骨性損害特征與臨床上骨巨細(xì)胞瘤的病理特征相似，可激活大量的破骨細(xì)胞從而導(dǎo)致溶骨性破壞，存活在裸小鼠脛骨內(nèi)的細(xì)胞經(jīng)抗人線粒體免疫熒光染色顯示為陽性，表明其來源于人的骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞。
[0018]本發(fā)明的第二方面，是提供了一種根據(jù)上述構(gòu)建方法得到的人骨巨細(xì)胞瘤小鼠動(dòng)物模型，該人骨巨細(xì)胞瘤小鼠動(dòng)物模型具有以下特征:
[0019]1、經(jīng)注射人骨巨細(xì)胞瘤原代細(xì)胞后的裸小鼠脛骨的溶骨性損害特征與骨巨細(xì)胞瘤的臨床X線表現(xiàn)一致，即為單純性的溶骨性破壞，無骨膜反應(yīng)；
[0020]2、HE染色可觀察到與X線部位一致的溶骨性破壞；TRAP染色顯示原代骨巨細(xì)胞瘤細(xì)胞可引起裸小鼠脛骨近端破骨細(xì)胞活化，引起溶骨性破壞；抗人線粒體免疫熒光染色可觀察到骨破壞區(qū)域的細(xì)胞具有抗人線粒體免疫熒光陽性染色，表明其來源于人的骨巨細(xì)胞瘤細(xì)胞。
[0021 ] 本發(fā)明的第三方面，是提供了上述人骨巨細(xì)胞瘤小鼠動(dòng)物模型在篩選治療人骨巨細(xì)胞瘤的藥物中的應(yīng)用。
[0022]本發(fā)明的構(gòu)建方法獨(dú)特，技術(shù)操作簡(jiǎn)便，動(dòng)物模型成功率高。實(shí)驗(yàn)資料證明:所建立的人骨巨細(xì)胞瘤骨損傷小鼠動(dòng)物模型中的溶骨性損害特征與臨床上骨巨細(xì)胞瘤的病理特征相似，存活的細(xì)胞為來源于人的骨巨細(xì)胞瘤基質(zhì)細(xì)胞。應(yīng)用此種骨巨細(xì)胞瘤骨損傷小鼠動(dòng)物模型可以用于系統(tǒng)研究骨巨細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)一步篩選治療骨巨細(xì)胞瘤的藥物。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為體外培養(yǎng)的原代骨巨細(xì)胞瘤細(xì)胞相差圖；
[0024]其中A-C為3個(gè)骨巨細(xì)胞瘤患者腫瘤組織分離培養(yǎng)的原代細(xì)胞，圖中*所示為多核的巨細(xì)胞，>所示為單核細(xì)胞，一所示為梭形或紡錘形的基質(zhì)細(xì)胞。由圖可見，分離培養(yǎng)的骨巨細(xì)胞瘤原代細(xì)胞包含骨巨細(xì)胞瘤各種細(xì)胞成分。
[0025]圖2為裸小鼠脛骨內(nèi)注射方法示意圖；
[0026]基中A為脛骨注射的示意圖；B為乂線下觀察到的顯微注射針的進(jìn)針位置。脛骨注射時(shí)，采用阿弗丁將裸小鼠麻醉后，暴露脛骨，采用纖維注射針緩慢左右旋轉(zhuǎn)進(jìn)針，經(jīng)X線確定顯微注射針已進(jìn)入脛骨髓腔，緩慢將20ul的骨巨細(xì)胞瘤原代細(xì)胞注射到脛骨髓腔內(nèi)，縫合切口。
[0027]圖3為骨巨細(xì)胞瘤原代細(xì)胞注射到裸小鼠脛骨前后的X線表現(xiàn)圖；
[0028]X線可觀察到，在裸小鼠脛骨近端(即干骺端)部位出現(xiàn)了單純性溶骨性破壞。
[0029]圖4為脛骨切片的HE染色圖。
[0030]圖5為脛骨切片的TRAP染色圖；
[0031]其中A和D為4倍物鏡觀察到的裸小鼠注射原代骨巨細(xì)胞瘤細(xì)胞后的TRAP染色結(jié)果和E為局部放大TRAP染色結(jié)果；(:和F為B和E對(duì)應(yīng)的HE染色結(jié)果。由圖可見，裸小鼠注射原代骨巨細(xì)胞瘤細(xì)胞后可引起TRAP染色增強(qiáng)，表明破骨細(xì)胞活性明顯升高。
[0032]圖6為抗人線粒體(ant1-human mitochondria)免疫突光染色圖；[0033]其中A為抗人線粒體免疫熒光染色(綠色)；B為DAPI染色(藍(lán)色)，即所有細(xì)胞核著色；C為々和B的疊加圖片山為C對(duì)應(yīng)的HE染色。由圖可見，在骨損傷部位可觀察到抗人線粒體陽性染色的細(xì)胞，提示該細(xì)胞來源于人。
【具體實(shí)施方式】
[0034]下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。但下列實(shí)施例不應(yīng)看作對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
[0035]下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0036]實(shí)施例1:本發(fā)明的人骨巨細(xì)胞瘤骨損傷小鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建
[0037]1、骨巨細(xì)胞瘤原代細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
[0038]將臨床組織活檢診斷為骨巨細(xì)胞瘤的手術(shù)標(biāo)本放置于生理鹽水中，在無菌條件下清除腫瘤組織表面血塊、壞死組織、脂肪和結(jié)締組織，用滅菌后的眼科剪將組織剪碎，經(jīng)無菌PBS洗2-3次，加入少量PBS，用彎頭眼科剪，反復(fù)剪切組織，直到組織成糊狀，約Imm3大小。加入II型膠原酶，370C消化30min，加入5ml含10%FBS的a -MEM培養(yǎng)基終止消化，經(jīng)IOOum過濾網(wǎng)過濾,800rmp離心5min,去除上清,加入IOml含10%FBS的a -MEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種于IOcm的培養(yǎng)皿中，置于5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)，37°C靜置培養(yǎng)，兩天換液一次，待細(xì)胞生長至80%時(shí)，經(jīng)0.25%胰酶37°C消化，按1:3傳代培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后倒置相差顯微鏡可觀察到原代分離的骨巨細(xì)胞瘤細(xì)胞包含骨巨細(xì)胞瘤的三種細(xì)胞成分。(如圖1所示)
[0039]2、人骨巨細(xì)胞瘤裸小鼠動(dòng)物模型的制備
[0040]將原代培養(yǎng)的骨巨細(xì)胞瘤細(xì)胞采用PBS洗滌2遍，經(jīng)0.25%胰酶37°C消化3分鐘，倒置相差顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞變圓、收縮突起時(shí)，以等體積含有10%FBS的a -MEM終止消化，收集細(xì)胞懸液，800rmp離心5min，經(jīng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)后，去除上清后采用PBS重懸，使細(xì)胞終濃度為5 X IO4個(gè)/ul人骨巨細(xì)胞瘤原代細(xì)胞。
[0041]如圖2所示的方法，采用眼科剪剪開裸小鼠膝關(guān)節(jié)處皮膚，暴露脛骨，在X線觀察下顯微注射器針頭插入裸小鼠脛骨內(nèi)，將20ul上述人骨巨細(xì)胞瘤原代細(xì)胞注射到裸小鼠的脛骨髓腔內(nèi)，每周經(jīng)X線觀察一次裸小鼠脛骨的骨質(zhì)變化情況。
[0042]實(shí)施例2:實(shí)施例1構(gòu)建方法得到的人骨巨細(xì)胞瘤小鼠動(dòng)物模型的特征研究
[0043]實(shí)施例1胚骨內(nèi)注射原代骨巨細(xì)胞瘤細(xì)胞2個(gè)月后,麻醉處死裸小鼠,取出胚骨經(jīng)4%多聚甲醛固定24h后，0.5M的EDTA脫鈣處理10天，再經(jīng)梯度乙醇、二甲苯、石蠟浸泡(即脫水至蠟處理)，石蠟包埋，切成4uM厚度切片。采用HE、TRAP及抗人線粒體免疫熒光染色，觀察裸小鼠脛骨大體形態(tài)學(xué)變化、破骨細(xì)胞活性及細(xì)胞來源的情況。
[0044]1、經(jīng)注射人骨巨細(xì)胞瘤原代細(xì)胞后的裸小鼠脛骨的溶骨性損害特征與骨巨細(xì)胞瘤的臨床X線表現(xiàn)一致，即為單純性的溶骨性破壞，無骨膜反應(yīng)(如圖3所示)；
[0045]2,HE染色可觀察到與X線部位一致的溶骨性破壞(如圖4所示);TRAP染色顯示原代骨巨細(xì)胞瘤細(xì)胞可引起裸小鼠脛骨近端破骨細(xì)胞活化，引起溶骨性破壞(如圖5所示);抗人線粒體免疫熒光染色可觀察到骨破壞區(qū)域的細(xì)胞具有抗人線粒體免疫熒光陽性染色，表明其來源于人的骨巨細(xì)胞瘤細(xì)胞(如圖6所示)。
[0046] 以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同物界定 。
【權(quán)利要求】
1.一種人骨巨細(xì)胞瘤小鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: (A)從骨巨細(xì)胞瘤的臨床手術(shù)標(biāo)本中分離出人的骨巨細(xì)胞瘤原代細(xì)胞； (B)將原代培養(yǎng)的骨巨細(xì)胞瘤細(xì)胞用PBS洗滌，經(jīng)0.25%胰酶消化，血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，采用PBS重懸，使細(xì)胞終濃度為5 X 1O4個(gè)/ul人骨巨細(xì)胞瘤原代細(xì)胞； (C)采用顯微注射器在X線觀察下，將10~30ul步驟(B)得到的人骨巨細(xì)胞瘤原代細(xì)胞注射到裸小鼠的脛骨內(nèi)； (D)采用X線觀察裸小鼠脛骨的骨質(zhì)變化情況。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人骨巨細(xì)胞瘤小鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的步驟(B)，具體為:將原代培養(yǎng)的骨巨細(xì)胞瘤細(xì)胞用PBS洗滌2遍，經(jīng)0.25%胰酶37°C消化3分鐘，用等體積含有10%FBS的a -MEM中和，800rmp離心5min，血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，去上清后采用PBS重懸，使細(xì)胞終濃度為5 X 1O4個(gè)/ul人骨巨細(xì)胞瘤原代細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人骨巨細(xì)胞瘤小鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的步驟(C)，具體為:采用顯微注射器在X線觀察下，將20ul步驟(B)得到的人骨巨細(xì)胞瘤原代細(xì)胞注射到裸小鼠的脛骨內(nèi)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人骨巨細(xì)胞瘤小鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的步驟(D)之后，還包括步驟(E)即:取出裸小鼠脛骨，經(jīng)4%多聚甲醛固定后石蠟包埋，再經(jīng)切片制成4uM組織切片，采用HE、TRAP和抗人線粒體染色，觀察骨組織大體形態(tài)、破骨細(xì)胞活性及細(xì)胞來源。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種人骨巨細(xì)胞瘤小鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的步驟(E)，具體為:脛骨內(nèi)注射原代骨巨細(xì)胞瘤細(xì)胞2個(gè)月后，麻醉處死裸小鼠，取出脛骨經(jīng)4%多聚甲醛固定24h后，經(jīng)0.5M的EDTA脫鈣10天，再經(jīng)梯度乙醇、二甲苯、石蠟浸泡，石蠟包埋，切成4uM厚度切片。
6.一種如權(quán)利要求1至5任一所述的人骨巨細(xì)胞瘤小鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法得到的人骨巨細(xì)胞瘤小鼠動(dòng)物模型。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的人骨巨細(xì)胞瘤小鼠動(dòng)物模型在篩選治療人骨巨細(xì)胞瘤的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A01K67/02GK103911342SQ201310006583
【公開日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2013年1月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月8日
【發(fā)明者】肖建如, 徐樂勤, 吳志鵬, 楊興海, 周振華, 黃權(quán), 林在俊, 萬維, 矯健, 蔡小攀, 陳素, 許煒, 祝傾, 劉鐵龍, 嚴(yán)望軍, 楊誠, 錢明, 李珍惜, 周旺 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)