專利名稱：一種飼料添加劑，預(yù)混料及配合料的制作方法
一種飼料添加劑，預(yù)混料及配合料技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于動(dòng)物飼料領(lǐng)域，具體涉及一種地衣芽孢桿菌與丁酸鈉的組合物作為飼 料添加劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
丁酸作為哺乳動(dòng)物大腸中的厭氧微生物發(fā)酵產(chǎn)生的一種短鏈脂肪酸(SCFA)，能為 結(jié)腸提供能量，增加小腸絨毛高度，同時(shí)丁酸也是腸粘膜細(xì)胞的主要能量來(lái)源。傳統(tǒng)的飼料 添加劑使用丁酸，具有游離性和揮發(fā)性的特點(diǎn)，飼料生產(chǎn)中將其制成相對(duì)穩(wěn)定的鈉鹽-丁 酸鈉。丁酸鈉無(wú)腐蝕性，無(wú)臭味，無(wú)有害殘留性，能夠到達(dá)更遠(yuǎn)的腸道，是熱門的抗生素替代 品之一。
地衣芽孢桿菌在有氧及無(wú)氧環(huán)境中均能迅速生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)消耗腸道內(nèi)的游離 氧，造成腸道內(nèi)低氧環(huán)境，抑制腸道需氧致病菌的生長(zhǎng)，并促進(jìn)腸道有益菌群如雙歧桿菌、 擬桿菌、乳酸菌等的生長(zhǎng)。
針對(duì)當(dāng)前養(yǎng)殖過(guò)程中面臨的對(duì)動(dòng)物長(zhǎng)期、大量使用抗生素，造成的動(dòng)物免疫力下 降、藥物殘留，從而嚴(yán)重威脅動(dòng)物機(jī)體及人類健康等問(wèn)題，開(kāi)創(chuàng)無(wú)毒副作用、無(wú)殘留、益生功 能顯著的飼料添加劑成為了必然趨勢(shì)。目前，還未見(jiàn)地衣芽孢桿菌與丁酸鈉的飼料添加劑 出現(xiàn)的相關(guān)報(bào)道，因此，本發(fā)明的添加劑組合物，具有重要意義。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種含有地衣芽孢桿菌CGMCC No. 7030與丁酸鈉的飼料添 加劑，使益生菌與丁酸鈉共同發(fā)揮作用，可有效改善動(dòng)物健康狀況，提高飼料轉(zhuǎn)化率。
本發(fā)明提供的飼料添加劑是由地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis) CGMCC No. 7030凍干粉、丁酸鈉及載體按重量比為O. 25 1. 25 :0. 5 1:1. 75 2混合配制而成的組合 物。
其中，所述地衣芽孢桿菌CGMCC No. 7030每克凍干粉的活菌數(shù)為100億飛00億。
其中，所述載體為玉米芯粉和/或稻殼粉。
本發(fā)明的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)為申請(qǐng)人從鴨腸道中分離得 到。其營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞桿狀，其芽孢為橢圓或長(zhǎng)筒形，產(chǎn)生中生的橢圓形芽孢，孢囊膨大。革蘭氏 染色為陽(yáng)性。在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上形成白色，不透明，不規(guī)則菌落，邊緣毛發(fā)狀，無(wú)褶 皺。接觸酶陽(yáng)性，能利用丙酸鹽。能產(chǎn)生多種活性酶，如蛋白酶、纖維素酶等，提高飼料利 用率，增強(qiáng)動(dòng)物消化酶的活性，促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物的生長(zhǎng)。本發(fā)明的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)申請(qǐng)人已于2012年12月25日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普 通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCCJia :北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研 究所，保藏編號(hào)為CGMCC No. 7030。
本發(fā)明的飼料添加劑可添加到常規(guī)的畜禽預(yù)混料中，如礦物質(zhì)維生素預(yù)混料，因 此，本發(fā)明還提供含有所述飼料添加劑的預(yù)混料。優(yōu)選的，所述預(yù)混料中飼料添加劑的添加量為4 10%。
本發(fā)明的飼料添加劑可添加到常規(guī)的畜禽基礎(chǔ)日糧中，因此，本發(fā)明還提供含有所述飼料添加劑的配合料。優(yōu)選的，所述配合料中飼料添加劑的添加量為O. 5 1%。。
本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)為本發(fā)明的地衣芽孢桿菌CGMCC No. 7030，能夠通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生高活性的纖維素酶與蛋白酶，添加進(jìn)動(dòng)物飼料中可以增加飼料中蛋白質(zhì)、纖維素和半纖維素等成分的分解，提高飼料營(yíng)養(yǎng)成分利用率。
地衣芽孢桿菌CGMCC No. 7030與丁酸鈉共同作用，可調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道結(jié)構(gòu)與菌群，并為動(dòng)物腸粘膜細(xì)胞提供能量。在基礎(chǔ)日糧中添加本發(fā)明的飼料添加劑，可減少抗生素用量， 無(wú)毒副作用、無(wú)藥物殘留，促進(jìn)飼料轉(zhuǎn)化率降低疾病發(fā)生率，有益于動(dòng)物與人類健康。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1地衣芽孢桿菌CGMCC No. 7030發(fā)酵液酶活的測(cè)定
將供試菌接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)24h后挑取菌種，懸于O.85%生理鹽水中，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)調(diào)節(jié)濃度約5. O X IO7個(gè)/mL在裝有20mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基的 IOOmL三角瓶?jī)?nèi)接入菌懸液2mL，自然補(bǔ)給氧30°C，170r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)24h，液體發(fā)酵液在5000r/min條件下離心分離15min,取上清液,即為粗酶液。
纖維素酶產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方為蛋白胨O. 9%，酵母膏1. 0%，CMC-NaO. 5%, pH8. O.
蛋白酶產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方為蛋白胨1. 0%,酵母膏O. 5%,葡萄糖1. 0%,可溶性淀粉O.5%, KH2P040. 2%, MgSO4 · 7H200. 05%, CaCl2 · 2H200. 02%, ρΗ7· 2。
(I)纖維素酶活力測(cè)定
纖維素酶活力測(cè)定按照國(guó)標(biāo)ΝΥ/Τ912-2004繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用DNS法測(cè)定發(fā)酵液中的纖維素酶活性。以ImL含l%(w/v)CMC-Na的pH8. O磷酸緩沖液為底物，加入O. 2mL粗酶液，50°C保溫30min，然后加入2. 5mL DNS試劑，沸水浴5min，冷卻至室溫后定容至5. OmL, 利用分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)540nm處的吸光度；以煮沸滅活粗酶液加入上述底物反應(yīng)液作為空白對(duì)照，以底物溶液作為陰性對(duì)照；將ImL酶液每分鐘產(chǎn)生Ig葡萄糖量定義為I個(gè)酶活力單位，U/mL。
經(jīng)測(cè)定，地衣芽孢桿菌CGMCC7030的發(fā)酵粗酶液的纖維素酶活為230. 5U/mL。
(2)蛋白酶活力測(cè)定
蛋白酶活力的測(cè)定采用國(guó)標(biāo)SB/T10317-1999蛋白酶活力測(cè)定法中的福林法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品測(cè)定取15X IOOmm試管3支，編號(hào)1，2，3，每管內(nèi)加入粗酶液ImL，置于40°C水浴中預(yù)熱2min，再各加入經(jīng)同樣預(yù)熱的2%酪蛋白溶液(pH7. 2) ImL,精確保溫 lOmin，時(shí)間到后，立即再各加入0.4mol三氯乙酸2m L，以終止反應(yīng)，繼續(xù)置于水浴中保溫 20min,使殘余蛋白質(zhì)沉淀后離心或過(guò)濾，然后另取15X 150mm試管3支，編號(hào)1，2，3，每管內(nèi)加入濾液ImL,再加O. 4mol碳酸鈉5mL,已稀釋的福林試劑ImL搖勻,40°C保溫發(fā)色20min 后在540nm下測(cè)定OD值?？瞻自囼?yàn)也取試管3支，編號(hào)(I)，(2)，(3)，測(cè)定方法同上，唯在加2%酪蛋白之前先加O. 4mol三氯乙酸2mL，使酶失活，再加入2%酪蛋白。
蛋白酶活力單位定義為lmL酶 液在40°C，pH7的條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生 I μ g酪氨酸的酶量為一個(gè)酶活力單位，以(U/ml)表示。
福林試劑(Folin試劑)的配制方法于200mL磨口回流裝置內(nèi)，加入鎢酸鈉 (Na2WO4 ·2Η20) IOOg,鑰酸鈉(Na2MO4 ·2Η20) 25g，蒸餾水 700mL，85%磷酸 50mL，濃鹽酸 lOOmL， 文火回流10h。取去冷凝器，加入硫酸鋰(Li2SO4) 50g，蒸餾水50m L,混勻，加人幾滴液體溴，再煮沸15min，以驅(qū)逐殘溴除去顏色，溶液應(yīng)呈黃色而非綠色。若溶液仍有綠色，需要再加幾滴澳液，再煮沸除去之。冷卻后，定容至IOOOmL,用細(xì)菌濾器(2. 2μπι)過(guò)濾，置于棕色瓶中保存。此溶液使用時(shí)加2倍蒸餾水稀釋。即成已稀釋的福林試劑。
經(jīng)測(cè)定，每毫升地衣芽孢桿菌CGMCC7030發(fā)酵粗酶液的蛋白酶活力為1500U/mL。
產(chǎn)酶試驗(yàn)表明，本發(fā)明的地衣芽孢桿菌CGMCC No. 7030,能夠通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生高活性的纖維素酶與蛋白酶，添加進(jìn)動(dòng)物飼料中可以增加飼料中蛋白質(zhì)、纖維素和半纖維素等成分的分解，提高飼料營(yíng)養(yǎng)成分利用率，同時(shí)降低動(dòng)物糞便中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量，減輕對(duì)環(huán)境的污染，具有很高的飼用價(jià)值。
實(shí)施例2地衣芽孢桿菌CGMCC No. 7030凍干粉的制備
地衣芽孢桿菌菌粉的制備方法，包括如下的步驟
(I)平板培養(yǎng)復(fù)壯將地衣芽孢桿菌菌種接種于平板培養(yǎng)基上，于30°C培養(yǎng)18h， 使地衣芽孢桿菌復(fù)壯，并形成單菌落，挑取單菌落于接種平板培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)24h ；
所述平板培養(yǎng)基配方為胰蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%，氯化鈉1%，瓊脂2%， ρΗ7· 0±0· 2。
(2)—級(jí)種子液的制備將步驟(I)培養(yǎng)的地衣芽孢桿菌菌種轉(zhuǎn)接至裝有IOmL培養(yǎng)基的試管中，30°C搖床培養(yǎng)16h，轉(zhuǎn)速為170rpm，使處于對(duì)數(shù)后期，得一級(jí)種子液；
(3) 二級(jí)種子液的制備將步驟(2)制備的一級(jí)種子液按1%接種量接種于裝有 75ml培養(yǎng)基的容量為250ml的錐形瓶中，30°C恒溫?fù)u床培養(yǎng)16h，轉(zhuǎn)速為170rpm，得二級(jí)種子液；
種子培養(yǎng)基配方為胰蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%，氯化鈉1%，pH7. 0±0. 2。
(4)地衣芽孢桿菌發(fā)酵液的制備將步驟(3)中的種子液按接種量為1%接種到 100L的發(fā)酵罐中，裝樣量20%,溫度30°C，轉(zhuǎn)速250rpm好氧培養(yǎng)至芽孢生成率80%以上，活菌數(shù)為101(lCFU/ml以上，則放罐終止發(fā)酵，得地衣芽孢桿菌發(fā)酵液；
所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為麩皮2%，玉米粉I %、豆柏2%，硫酸銨2%，硫酸鎂0. 03% ;檸檬酸銨 0. 5%，pH 為 7. 0-7. 4。
(5)地衣芽孢桿菌凍干菌粉的制備將步驟(4)制備的發(fā)酵液離心后，在菌泥中加入10%的凍干保護(hù)劑(凍干保護(hù)劑配方為脫脂奶粉10%，乳糖10%，甘油0. 5%，維生素 CO. 2%，蒸餾水79. 3%)，混勻后冷凍干燥，得到水分含量< 5%的地衣芽孢桿菌菌粉，每克凍干菌`粉中活菌數(shù)約為400億。
實(shí)施例3飼料添加劑的制備
將實(shí)施例1制備的地衣芽孢桿菌CGMCC No. 7030凍干粉與丁酸鈉和玉米芯粉按0.25 1 2的重量比混合均勻，得到一種飼料添加劑。
本例配方比較適合仔豬用，試用效果很好。以本飼料添加劑進(jìn)行斷奶仔豬試驗(yàn)。
L I試驗(yàn)設(shè)計(jì)
將72頭健康的30日齡三元雜交斷奶仔豬(杜X長(zhǎng)X大)，體重平均為7. 6kg，按公母各半的原則隨機(jī)分為4組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6頭豬，組1、組2、組3、組4在飼喂基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上分別添加本飼料添加劑0、0. 5%。、0. 8%。、1%。。
1. 2實(shí)驗(yàn)日糧
實(shí)驗(yàn)采用玉米-豆柏型日糧，參照NRC (1998)豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行配制。
1. 3飼養(yǎng)管理
試驗(yàn)豬飼養(yǎng)在封閉式豬舍內(nèi)，水泥地面，通風(fēng)良好，舍溫保持在18_22°C，每天上午和下午各加料至少2次，保證料槽中始終有料，自由采食和自由飲水。按照豬場(chǎng)常規(guī)方法進(jìn)行免疫。
1. 4測(cè)定指標(biāo)
試驗(yàn)進(jìn)行過(guò)程中每日觀察仔豬精神狀況、排糞情況以及持續(xù)時(shí)間。腹瀉的判斷以采集糞樣含水量大于10%，不成形為準(zhǔn)，分別記錄各重復(fù)每天仔豬腹瀉數(shù)，試驗(yàn)第28天晚上停止喂料，照常供水，于次日早上對(duì)豬只空腹逐個(gè)稱重，試驗(yàn)結(jié)束后，記錄耗料量，計(jì)算出平均日增重(ADG)，平均日采食量(ADFI)與腹瀉率。
腹瀉頻率=(腹瀉仔豬頭數(shù)X腹瀉天數(shù))/ (試驗(yàn)仔豬頭數(shù)X試驗(yàn)期天數(shù))X 100%
1. 5數(shù)據(jù)分析
采用SPSS16. O軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。
試驗(yàn)結(jié)果用平均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因子方差分析，各處理間平均值的比較采用LSD多重比較進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，以p〈0. 05為差異顯著。
2試驗(yàn)結(jié)果
本飼料添加劑對(duì)仔豬生產(chǎn)性能的影響見(jiàn)下表
表I本飼料添加劑對(duì)仔豬生產(chǎn)性能的影響
權(quán)利要求
1.一種飼料添加劑，其特征在于，該飼料添加劑是由地衣芽孢桿菌(BacillusLicheniformis)CGMCC No. 7030 凍干粉、丁酸鈉及載體按重量比 O. 25 1. 25 :0. 5 1:1. 75 2混合配制而成的組合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的飼料添加劑，其特征在于，地衣芽孢桿菌CGMCCNo. 7030每克凍干粉的活菌數(shù)為100億 500億。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的飼料添加劑，其特征在于，所述的載體為玉米芯粉和/或稻殼粉。
4.含有權(quán)利要求f3任一項(xiàng)所述的飼料添加劑的預(yù)混料，其特征在于，所述預(yù)混料中飼料添加劑的添加量為4 10%。
5.含有權(quán)利要求Γ3所述的飼料添加劑的配合料，其特征在于，所述配合料中飼料添加劑的添加量為O. 5 1%。。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種飼料添加劑，該飼料添加劑是由地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis)CGMCC No.7030凍干粉、丁酸鈉及載體按重量比0.25~1.250.5~11.75~2混合配制而成的組合物。本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)為地衣芽孢桿菌CGMCC No.7030能夠通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生高活性的纖維素酶與蛋白酶，添加進(jìn)動(dòng)物飼料中可以增加飼料中蛋白質(zhì)、纖維素和半纖維素等成分的分解，提高飼料營(yíng)養(yǎng)成分利用率。地衣芽孢桿菌CGMCC No.7030與丁酸鈉共同作用，可調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道結(jié)構(gòu)與菌群，并為動(dòng)物腸粘膜細(xì)胞提供能量。在基礎(chǔ)日糧中添加本發(fā)明的飼料添加劑，可減少抗生素用量，無(wú)毒副作用、無(wú)藥物殘留，促進(jìn)飼料轉(zhuǎn)化率降低疾病發(fā)生率，有益于動(dòng)物與人類健康。
文檔編號(hào)A23K1/16GK103039716SQ20131000932
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2013年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月10日
發(fā)明者王凡, 李曉清, 劉婷, 陳麗仙, 王安如 申請(qǐng)人:北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司, 漳州大北農(nóng)農(nóng)牧科技有限公司, 哈爾濱大北農(nóng)牧業(yè)科技有限公司