利用檸檬酸廢水生產(chǎn)解淀粉芽孢桿菌生防菌劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用檸檬酸廢水低成本生產(chǎn)防治植物病害、促進(jìn)植物生長的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus?amyloliquefaciens）生防菌劑的方法，屬于微生物農(nóng)藥和微生物肥料【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明是采用生物質(zhì)熱電廠的富含碳酸鉀的草木灰作為檸檬酸廢水的預(yù)處理添加劑，在通過好氧培養(yǎng)，大規(guī)模獲得解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液，再以生物碳為載體制備具有防治植物病害、促進(jìn)植物生長的菌劑，該工藝生產(chǎn)成本低廉，操作簡單，還可以使檸檬酸廢水得到資源化利用，減少污染排放。本發(fā)明生產(chǎn)的菌劑用于蔬菜的生產(chǎn)，不僅可以提高產(chǎn)量，而且可以改善蔬菜的品質(zhì)，顯示出廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】利用檸檬酸廢水生產(chǎn)解淀粉芽孢桿菌生防菌劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株拮抗植物病原菌、促進(jìn)植物生長的解淀粉芽孢桿菌農(nóng)用微生物菌劑的低成本生產(chǎn)方法，屬于農(nóng)用微生物菌劑和廢水資源化【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]檸檬酸作為一種重要的化工原料和食品添加劑被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等行業(yè)。目前，中國有檸檬酸生產(chǎn)廠近百家，總年產(chǎn)能力約80萬噸，是全球最大的檸檬酸生產(chǎn)國和出口國，出口量在全球檸檬酸貿(mào)易總量中的比重超過60%。檸檬酸的生產(chǎn)是以薯干或玉米為原料，依次經(jīng)原料處理、發(fā)酵、提取、精制等工序制得產(chǎn)品。檸檬酸廢水主要來自發(fā)酵和提取工序產(chǎn)生的中和液、洗糖水、洗罐水和洗濾布水。廢水中主要含有淀粉、蛋白質(zhì)、碳水化合物、各種有機(jī)酸、氨氮和脂肪等，COD濃度為20000~30000 mg/L，屬于高濃度有機(jī)廢水。據(jù)統(tǒng)計，每生產(chǎn)I噸檸檬酸，產(chǎn)生高濃度廢水7.5~15噸。直接排放會對環(huán)境將造成嚴(yán)重污染，處理達(dá)標(biāo)排放費(fèi)用高昂。
[0003]解淀粉芽孢桿菌(feci77w5.amyloli quefaci ens )以其具備產(chǎn)淀粉酶的潛力而得名。解淀粉芽孢桿菌在自然界中分布廣泛，是一種重要的生防菌，它通過產(chǎn)生抗生素、抗菌蛋白或多肽等活性物質(zhì)來抑制植物病原細(xì)菌、真菌、病毒、線蟲，從而起到生物防治的作用；同時它也是一類重要的植物根際促生細(xì)菌，表現(xiàn)出對多種植物促進(jìn)生長的作用。例如，Idriss等報道解淀粉芽孢桿菌FZB45菌株具有肌醇六磷酸酶(phytase)活性，可以在缺磷的條件下刺激植物生長( Microbiology, 2002, 148: 2097-2109)。申莉莉等報道解淀粉芽孢桿菌Ba33菌株可以促進(jìn)煙草生產(chǎn)并且抑制煙草花葉病毒的增殖(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，32:383~386)。李超等還報道了一株具有溶藻作用的解淀粉芽孢桿菌菌株DCl (環(huán)境科學(xué)學(xué)報，31: 1602-1608)。
[0004]中國發(fā)明專利(申請?zhí)?201010518034.1)中公開了一株解淀粉芽孢桿菌Lx-1l菌株，保藏編號為CGMCC N0.3789，對水稻細(xì)菌性條斑病有良好的防治效果，培養(yǎng)該菌株采用的培養(yǎng)基為:大豆粉1%，豆餅粉2%，淀粉0.5%，酵母膏0.2%，玉米漿0.22%，氯化鈉0.1%，碳酸氫鈣0.18%。中國發(fā)明專利(申請?zhí)?200810231406.5)中公開了一株解淀粉芽孢桿菌YN-1菌株，保藏編號為CGMCC N0.2328，能有效防治蘋果褐斑病、小麥紋枯病等真菌病害，并篩選出了成本低廉的工業(yè)用培養(yǎng)基，組成包括:葡萄糖8~12g/L，玉米粉l(Tl6g/L，黃豆餅粉l(Tl6g/L。中國發(fā)明專利(申請?zhí)?200910070709.8)中公開了一株解淀粉芽孢桿菌HN菌株，保藏編號為CGMCC N0.3261，能使養(yǎng)殖水體中的硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮、COD等含量明顯降低，該菌株的培養(yǎng)采用肉湯培養(yǎng)基。中國發(fā)明專利(申請?zhí)?201010264520.5)中公開了一株植物內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌TF28菌株，保藏編號為CGMCC N0.4038，它能在植物體內(nèi)定殖、繁殖和傳導(dǎo)，可產(chǎn)生抗菌蛋白和脂肽類抗生素兩種抗菌物質(zhì)，具有防病促生作用，其液體培養(yǎng)基每1000mL由IOg胰蛋白胨、5g酵母浸粉、IOg NaCl配制而成。中國發(fā)明專利(申請?zhí)?200910273498.8)中公開了一株解淀粉芽孢桿菌EA19菌株，保藏編號為CCTCC M209316，對小麥根腐病菌、小麥根腐葉枯病菌、小麥全蝕病菌、小麥白絹病菌和小麥紋枯病菌均具有明顯的抑菌活性，其發(fā)酵培養(yǎng)基組成:葡萄糖20克，牛肉膏8克，L-谷氨酸鈉5克，MgSO4 0.5克，KCl 0.5 克，KH2PO4 I 克，F(xiàn)eSO4.6H20 0.15 毫克，MnSO4.H2O 5 毫克，CuSO4.5H20 0.16毫克，水1000毫升。中國發(fā)明專利(申請?zhí)?201110095116.4)中公開了一株解淀粉芽孢桿菌B-004菌株，保藏編號為CGMCC N0.4557，它對番茄采后早疫病菌具有明顯拮抗效果，其培養(yǎng)基中，碳源可為可溶性淀粉、藕粉、葡萄糖、乳糖、海藻糖、蔗糖等，氮源可為蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、NH4NO3^ NH4Cl, (NH4)2SO4等，其他營養(yǎng)源可為含鉀、鐵、鋅、鈉、錳、鎂及鈣之類的金屬鹽等。
[0005]綜上所述，具有拮抗植物病害的解淀粉芽孢桿菌的菌株較多，其培養(yǎng)方法也各不相同，但是，未見采用檸檬酸廢水培養(yǎng)解淀粉芽孢桿菌并生產(chǎn)生防菌劑的報道。
[0006]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種能夠資源化利用檸檬酸廢水生產(chǎn)高效拮抗植物病原菌、促進(jìn)植物生長的解淀粉芽孢桿菌農(nóng)用生防菌劑的方法。
[0008]本發(fā)明所使用的菌株是由發(fā)明人從水草根際土壤中分離篩選出來的一株高效促進(jìn)植物生長、拮抗植物病原菌的解淀粉芽孢桿菌{Bacillus amyloli quefaci ens ) A3菌株，該菌株于2012年10月15日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為=CGMCC N0.6676，保藏單位地址:北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編:100101o
[0009]本發(fā)明所述的解淀粉芽孢桿菌微生物菌劑的生產(chǎn)方法如下:
1、檸檬酸廢水預(yù)處理:用生物質(zhì)熱電廠的富含碳酸鉀的草木灰調(diào)節(jié)廢水的PH到7.0~8.0，于110~121°C滅菌10~30分鐘。
[0010]2、液體種子制備:向裝有預(yù)處理好的檸檬酸廢水的三角瓶中接種斜面保藏的解淀粉芽孢桿菌，于25~37°C，120~200轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)24~36小時，得到液體種子。
[0011]3、液態(tài)發(fā)酵:向裝有預(yù)處理好的檸檬酸廢水發(fā)酵罐中接種體積比為2%~15%的液體種子，于25~37°C，通無菌空氣培養(yǎng)15~36小時；培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)平板細(xì)菌計數(shù)，活菌數(shù)達(dá)到1.5 X IO9 CFU/毫升以上，所得發(fā)酵液可以作為液體菌劑直接使用。
[0012]4、固體菌劑制備:以過30目篩的生物碳(生物質(zhì)熱解后剩余的固體物質(zhì)，主要成分是碳)為載體，按照發(fā)酵液:生物碳為1: 1.5~1: 5的重量比，將發(fā)酵液添加到生物碳中，充分混合均勻，得到固態(tài)菌劑，通風(fēng)干燥至菌劑含水量30%以下，包裝，存放在陰涼干燥處,備用。
[0013]本發(fā)明所述的解淀粉芽孢桿菌生防菌劑的使用方法如下:
1、將發(fā)酵液或固體菌劑用灌溉用水稀釋到活菌數(shù)為2XIO6 CFU/毫升~5X IO7 CFU/毫升，混合均勻，按照每畝I~3立方米稀釋液的用量溝施入作物根部附近的土壤中；
2、將發(fā)酵液或固體菌劑加入有機(jī)肥中，混合均勻，使有機(jī)肥中的解淀粉芽孢桿菌活菌數(shù)為2 X IO6 CFU/克~IXlO8 CFU/克，按照每畝I~3噸的用量作為基肥施入土壤中。
[0014]【具體實(shí)施方式】[0015]由本發(fā)明提供的解淀粉芽孢桿菌生防菌劑能有效防治多種土傳植物病害，并能夠促進(jìn)作物對養(yǎng)分的吸收和利用，還能提供一定量的鉀肥；本發(fā)明提供的技術(shù)方案生產(chǎn)的農(nóng)用微生物菌劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)可以減少化肥和農(nóng)藥的使用量，從而改善農(nóng)田環(huán)境質(zhì)量；而且生產(chǎn)成本很低，使高濃度廢水得到資源化利用，減少污染物排放?！揪唧w實(shí)施方式】如下:
實(shí)施例1:檸檬酸廢水生產(chǎn)解淀粉芽孢桿菌生防菌劑
檸檬酸廢水預(yù)處理:用生物質(zhì)熱電廠的富含碳酸鉀的草木灰調(diào)節(jié)廢水的PH到7.5左右，于115°C滅菌15分鐘。
[0016]液體種子制備:向裝有預(yù)處理好的檸檬酸廢水的三角瓶中接種斜面保藏的解淀粉芽孢桿菌，于35°C，150轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)28小時，得到液體種子。
[0017]3、液態(tài)發(fā)酵:向裝有預(yù)處理好的檸檬酸廢水發(fā)酵罐中接種體積比為10%的液體種子，于35°C，通無菌空氣培養(yǎng)18小時；培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)平板細(xì)菌計數(shù)，活菌數(shù)達(dá)到
1.5 X IO9 CFU/毫升以上，所得發(fā)酵液可以作為液體菌劑直接使用。
[0018]4、固體菌劑制備:以過30目篩的生物碳(生物質(zhì)熱解后剩余的固體物質(zhì)，主要成分是碳)為載體，按照發(fā)酵液:生物碳為1: 2的重量比，將發(fā)酵液添加到生物碳中，充分混合均勻，得到固態(tài)菌劑，通風(fēng)干燥至菌劑含水量30%以下，包裝，存放在陰涼干燥處，備用。
[0019]實(shí)施例2:解淀粉芽孢桿菌微生物菌劑用于防止黃瓜猝倒病
黃瓜猝倒病是由真菌 侵染引起的病害。采集多年種植黃瓜的溫室大棚中的土壤，接種瓜果腐霉菌iPythium aphani derma turn ),混合均勻,裝入花盆中，設(shè)置2組花盆,每組10盆，至于15°C~20°C的溫室中，保持較高濕度和較低的光照強(qiáng)度。第I組花盆直接播種黃瓜種子，每盆15粒，作為對照。第2組播種黃瓜種子前向土壤中拌入重量比為0.3%的解淀粉芽孢桿菌生防菌劑，然后每盆播種15粒種子。幼苗出土后統(tǒng)計總數(shù)，幼苗長出I片真葉后，2片真葉前統(tǒng)計倒伏苗總數(shù)。結(jié)果表明，對照幼苗倒伏率超過65%，而添加菌劑的實(shí)驗(yàn)組，幼苗倒伏率低于10%。
【權(quán)利要求】
1.一種利用檸檬酸廢水生產(chǎn)高效拮抗植物病原菌、促進(jìn)植物生長的解淀粉芽孢桿菌{Bacillus amyloliquefaciens)生防菌劑的方法,其特征在于:生產(chǎn)解淀粉芽孢桿菌生防菌劑包括如下步驟: (O檸檬酸廢水預(yù)處理:用生物質(zhì)熱電廠的富含碳酸鉀的草木灰調(diào)節(jié)廢水的PH到7.0~8.0，于110~121°C滅菌10~30分鐘； (2)液體種子制備:向裝有預(yù)處理好的檸檬酸廢水的三角瓶中接種斜面保藏的解淀粉芽孢桿菌，于25~37°C，120~200轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)24~36小時，得到液體種子； (3)液態(tài)發(fā)酵:向裝有預(yù)處理好的檸檬酸廢水發(fā)酵罐中接種體積比為2%~15%的液體種子，于25~37°C，通無菌空氣培養(yǎng)15~36小時；培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)平板細(xì)菌計數(shù)，活菌數(shù)達(dá)到1.5X IO9 CFU/毫升以上，所得發(fā)酵液可以作為液體菌劑直接使用； (4)固體菌劑制備:以過30目篩的生物碳(生物質(zhì)熱解后剩余的固體物質(zhì)，主要成分是碳)為載體，按照發(fā)酵液:生物碳為1: 1.5~1: 5的重量比，將發(fā)酵液添加到生物碳中，充分混合均勻，得到固態(tài)菌劑，通風(fēng)干燥至菌劑含水量30%以下，包裝，存放在陰涼干燥處。
2.權(quán)利要求1所述的地衣芽孢桿菌生防菌劑的使用方法，其特征在于，使用方法包括以下步驟: (I)將發(fā)酵液或固體菌劑用灌溉用水稀釋到活菌數(shù)為2X IO6 CFU/毫升~5X IO7 CFU/毫升，混合均勻，按照每畝 I~3立方米稀釋液的用量溝施入作物根部附近的土壤中； (2 )將發(fā)酵液或固體菌劑加入有機(jī)肥中，混合均勻，使有機(jī)肥中的解淀粉芽孢桿菌活菌數(shù)為2 X IO6 CFU/克~I X IO8 CFU/克，按照每畝I~3噸的用量作為基肥施入土壤中。
【文檔編號】A01P21/00GK103931660SQ201310017340
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2013年1月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月17日
【發(fā)明者】王棟, 關(guān)曉歡, 馬雙龍, 焦海華, 姜華, 白志輝 申請人:無錫中科活力生物技術(shù)有限公司, 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心