專利名稱：一種東北紅豆杉試管內(nèi)一步成苗方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物種植技術(shù)，即東北紅豆杉試管內(nèi)一步成苗方法。
背景技術(shù)：
在現(xiàn)有技術(shù)中，東北紅豆杉ijaxus cuspidata Sieb. et Zucc.)又稱紫杉、赤板松，紅豆杉科紅豆杉屬常綠喬木，該種在長(zhǎng)白山區(qū)數(shù)量稀少，分布區(qū)域十分狹窄，僅在吉林省石湖自然保護(hù)區(qū)內(nèi)有較大的種群面積，其他區(qū)域僅有零星分布。被《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄(第一批)》定為國(guó)家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物。被《中國(guó)物種紅色名錄》定為易危種(VU)。在《吉林省野生動(dòng)植物保護(hù)管理暫行條例》一文中被定為省級(jí)一類重點(diǎn)保護(hù)植物。東北紅豆杉不僅是材用植物，也是重要的藥用植物，其莖、枝、葉和根可入藥，主要成分含紫杉醇、紫杉?jí)A、雙萜類化合物。有抗癌功能，并有抑制糖尿病及治療心臟病的效用。此外種子還可以榨油等。也可作東北及華北地區(qū)的綠化及造林樹種。東北紅豆杉通常以插條扦插或種子繁殖為主，但其果實(shí)成熟后，種子中的種胚處于心形胚后期或子葉胚初期階段，種子播種后當(dāng)年不萌發(fā)，加之種皮堅(jiān)硬，種胚成熟后很難破殼發(fā)芽，2 3年后僅極少數(shù)萌發(fā)；所以，插條扦插繁殖不僅生根率和移栽成活率極低，而且導(dǎo)致野生資源受到滅絕性威脅。因此，大規(guī)模人工栽培、開發(fā)和利用受到極大限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)上述不足而提供一種東北紅豆杉試管內(nèi)高效、一步成苗的東北紅豆杉試管內(nèi)一步成苗方法。 本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種東北紅豆杉試管內(nèi)一步成苗方法，其步驟如下
(1)取東北紅豆杉野生實(shí)生苗主干上的新發(fā)主莖，切割成段作為外植體備用；
(2)莖段生根同時(shí)腋芽萌發(fā)生長(zhǎng)培養(yǎng)基成分和含量培養(yǎng)基+吲哚乙酸IAA(O.03 O. 04 mg · L O + 蔡乙酸 NAA(O. 02 O. 03 mg · L O + 激動(dòng)素 KT (O. 11 O. 12 mg · L O +赤霉素 GA3 (2. 60 2. 80 mg .171);培養(yǎng)基:110. O mg *L_1 (NH4) 2S04, 560. O mg ^L-1KNO3,40. 5mg · L-1CaCl2 · 2H20,1. 20 mg · L-1MgSO4 · 7H20,95. 0 mg · L-1KH2PO4,1. 00 mg · L-1ZnSO4 · 7H20,
0.2 mg · L-1KLO. 4 mg · [1H3BO3 ；4. 64 mg · L-1FeSO4 · 7H20，6. 22 mg · L-1Na2 · EDTA · 2H20 ；3. 70 mg · L 1MnSO4 · 4H20 ；0. 3 mg · L 1 煙酸，0. 5 mg · L 1 鹽酸批口多醇(VB6),1. 50 mg · L 1 甘氨酸；添加瓊脂粉8.0 g ·Ι^，添加蔗糖20. O g 調(diào)節(jié)pH值至5. 6，嫩莖段在光照周期
6h · Cf1、光照強(qiáng)度700 Ix和溫度20 ±2°C條件下培養(yǎng)。在步驟(2)之后將種苗植株栽植到腐熟草炭土、腐爛松針和珍珠巖基質(zhì)中，混合比例3: 2:1，溫度控制在20±2°C，保持相對(duì)濕度在70%，自然光照8 h · Cf1。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1、本發(fā)明利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，采用東北紅豆杉野生實(shí)生苗主干上的新發(fā)莖尖為材料，在試管內(nèi)調(diào)控莖段生根同時(shí)腋芽萌發(fā)生長(zhǎng)，以達(dá)到莖節(jié)增殖的一步快繁目標(biāo)，解決了種子繁殖困難和扦插繁殖生根率低、移栽成活率及野生資源受滅絕性威脅等問題。本發(fā)明為進(jìn)一步人工規(guī)?；敝澈驮耘鄸|北紅豆杉提供優(yōu)質(zhì)種苗。2、當(dāng)種苗擴(kuò)繁到一定數(shù)量后，進(jìn)行煉苗移栽，小植株成活率可達(dá)到95. 2%以上。下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
具體實(shí)施例方式I材料與方法
1.1材料及處理
7月上旬，采取東北紅豆杉野生實(shí)生苗主干上的新發(fā)主莖(2. O 3. O cm)，并將主莖剪成段(長(zhǎng)度為O. 5 cm)后，摘去嫩針葉及短小葉柄，用70%乙醇(體積分?jǐn)?shù))涮洗40 S，移至飽和次氯酸鈉溶液中浸泡10 min，無(wú)菌水沖洗5次，無(wú)菌濾紙吸干表面水分，去除被乙醇和次氯酸鈉毒傷的組織后切割成段作為外植體備用。1. 2東北紅豆杉莖段生根同時(shí)腋芽萌發(fā)生長(zhǎng)、植株快速再生體系建立和栽培
培養(yǎng)基成分和含量110. O mg · I^1(NH4)2SO4JeO. O mg · L-1KNO3,40. 5mg · L-1CaCl2 · 2H 20,1. 20 mg · L-1MgSO4 · 7H20,95. 0 mg · L-1KH2PO4,1. 00 mg · L-1ZnSO4 · 7H20,0. 2 mg · L-1KLO. 4 mg · [1H3BO3 ；4. 64 mg · L-1FeSO4 · 7H20，6. 22 mg · L-1Na2 · EDTA · 2H20 ；3. 70 mg .L-1MnSO4 ·4Η20 ；0. 3 mg *L_1 煙酸,0. 5 mg *L_1 鹽酸卩比卩多醇(VB6),1. 50 mg *L_1 甘氨酸。培養(yǎng)基中附加吲哚乙酸IAA (O. 07 O. 12 mg .171)、萘乙酸NAA (O. 05 O. 10 mg .171)、激動(dòng)素 KT (O. 03 O. 08 mg · L-1)和赤霉素 GA3 (1. 30 2. 40 mg · L—1)，瓊脂粉 8. O g · L-1，添加蔗糖20. O g · L—1，調(diào)節(jié)pH值至5. 6，嫩莖段在光照周期6 h · cf1、光照強(qiáng)度700 Ix和溫度(20±2) °C條件下培養(yǎng)。為提高東北紅豆杉嫩莖段生根的速度及生根率和腋芽萌發(fā)生長(zhǎng)速度，通過均勻設(shè)計(jì)法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，選用U12 (124)均勻表，每個(gè)處理接種10個(gè)嫩莖段，重復(fù)3次，篩選確定影響東北紅豆杉莖段生根同時(shí)腋芽萌發(fā)生長(zhǎng)的吲哚乙酸、萘乙酸、激動(dòng)素和赤霉素最佳濃度配比。莖段培養(yǎng)45 d統(tǒng)計(jì)生根率和長(zhǎng)度，以均出現(xiàn)莖段生根和腋芽萌發(fā)生長(zhǎng)的苗為準(zhǔn)。生根率=(生根的莖段數(shù)/接種的莖段總數(shù))X 100%，生長(zhǎng)率=(苗總長(zhǎng)度-O. 5) /苗總長(zhǎng)度X 100%，莖段腋芽長(zhǎng)度為I個(gè)培養(yǎng)周期過程中，莖段腋芽萌發(fā)生長(zhǎng)后的腋芽長(zhǎng)度(不包括原莖段長(zhǎng)度)。莖段生根后腋芽萌發(fā)生長(zhǎng)至2. 00 cm，腋芽發(fā)出10 12片針葉時(shí)，在無(wú)菌條件下打開培養(yǎng)瓶，將莖段留2葉剪下苗干，并將苗干切割成I 2葉I段(O. 5 cm左右)，再次將小莖段轉(zhuǎn)接到莖段生根同時(shí)腋芽萌發(fā)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，計(jì)算出每個(gè)莖段生根同時(shí)腋芽萌發(fā)生長(zhǎng)的每瓶增殖倍數(shù)和周期。當(dāng)種苗擴(kuò)繁到需要數(shù)量后，且小植株長(zhǎng)至1. 50 cm時(shí)，將小植株從培養(yǎng)瓶中取出，放在殺毒礬溶液(濃度為2 mg · L-1)中洗凈根上的瓊脂，將小植株栽植到經(jīng)殺毒礬(100倍液)消毒過的腐熟草炭土、腐爛松針和珍珠巖(3: 2:1)的基質(zhì)中，覆蓋塑料薄膜(透性好)進(jìn)行保溫保濕，溫度控制在(20±2) °C，保持相對(duì)濕度在70%，自然光照8 h · Cf1，溫度升高時(shí)，適當(dāng)通風(fēng)換氣。2結(jié)果與分析
2.1吲哚乙酸、萘乙酸、激動(dòng)素和赤霉素對(duì)東北紅豆杉莖段生根的影響
數(shù)據(jù)(表I)經(jīng)均勻設(shè)計(jì)軟件分析處理后可得回歸方程為7=111 - 275^ - 33ΖΤ2 +288為，顯著性水平a = ο. 05，復(fù)相關(guān)系數(shù)TP= O. 9795，剩余標(biāo)準(zhǔn)差S=1.8800，檢驗(yàn)值=63. 05 >臨界值/Vo5，3，8) = 4. 066，回歸方程具有顯著性，吲哚乙酸、萘乙酸和激動(dòng)素對(duì)莖段的生根影響具有顯著性，赤霉素對(duì)莖段的生根影響不顯著。通過計(jì)算吲哚乙酸、萘乙酸和激動(dòng)素對(duì)生根的貢獻(xiàn)值和貢獻(xiàn)率可知，U1 = 290，UJU = 43. 4% 'U2 = 305，UjU = 45. 7% ；U, = 209，UJU= 31. 4%，但從數(shù)值來(lái)看，吲哚乙酸、萘乙酸和激動(dòng)素三者對(duì)生根率的貢獻(xiàn)差距不大，說明吲哚乙酸、萘乙酸和激動(dòng)素均在東北紅豆杉莖段生根起同等不可缺少的重要作用。因激動(dòng)素與生根率呈正相關(guān)，而吲哚乙酸和萘乙酸與生根率呈負(fù)相關(guān)。由此推測(cè)，激動(dòng)素質(zhì)量濃度高于O. 08 mg · L-1的，吲哚乙酸和萘乙酸質(zhì)量濃度分別低于O. 07 mg · Γ1和O. 05 mg · L—1可能有更高的生根率。為驗(yàn)證此推測(cè)，又以激動(dòng)素為O. 08、0. 09、0. 10、0. 11、O. 12,0. 13,0. 14 和 O. 15 mg · Λ 吲哚乙酸質(zhì)量濃度為 O. 07,0. 06,0. 05,0. 04,0. 03,0. 02、O. 01 和 O. 00 mg .Γ1，萘乙酸質(zhì)量濃度為 O. 05,0. 04,0. 03,0. 02,0. 01 和 O. 00 mg .171 開展8個(gè)水平的補(bǔ)充試驗(yàn)，重復(fù)3次。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，吲哚乙酸質(zhì)量濃度為(O. 03 O. 06 mg Γ1)、萘乙酸質(zhì)量濃度為(O. 02 O. 04 mg · Γ1)和激動(dòng)素質(zhì)量濃度為(O. 10 O. 13 mg · Γ1)時(shí)，東北紅豆杉嫩莖段生根率最高，平均生根率達(dá)99. 3%以上。均高于表I所列12個(gè)處理的生根率。表I影響東北紅豆杉嫩莖段生根和腋芽生長(zhǎng)的因素篩選U12 (124)試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種東北紅豆杉試管內(nèi)一步成苗方法，其特征在于步驟如下(1)取東北紅豆杉野生實(shí)生苗主干上的新發(fā)主莖，切割成段作為外植體備用；(2)莖段生根同時(shí)腋芽萌發(fā)生長(zhǎng)培養(yǎng)基成分和含量培養(yǎng)基+吲哚乙酸IAAO. 03 O.04 mg *L 1 +蔡乙酸 NAA O. 02 O. 03 mg *L 1 + 激動(dòng)素 KT O. 11 O. 12 mg *L 1 +赤霉素 GA3 2. 60 2. 80 mg · L-1 ;培養(yǎng)基:110.0 mg · L-1 (NH4) 2S04, 560. O mg · L-1KNO3,40. 5 mg · L-1CaCl2 · 2H20,1. 20 mg · L-1MgSO4 · 7H20,95. 0 mg · L-1KH2PO4,1. 00 mg · L-1ZnSO4 · 7H20,0.2 mg · L-1KLO. 4 mg · [1H3BO3 ；4. 64 mg · L-1FeSO4 · 7H20，6. 22 mg · L-1Na2 · EDTA · 2H20 ； 3. 70 mg · L 1MnSO4 · 4H20 ；0. 3 mg · L 1 煙酸，0. 5 mg · L 1 鹽酸批口多醇(VB6),1. 50 mg · L 1 甘氨酸；添加瓊脂粉8.0 g ·Ι^，添加蔗糖20. O g 調(diào)節(jié)pH值至5. 6，嫩莖段在光照周期 6 h · Cf1、光照強(qiáng)度700 Ix和溫度20 ±2°C條件下培養(yǎng)。
2.按照權(quán)利要求1所述的東北紅豆杉試管內(nèi)一步成苗方法，其特征在于在步驟(2)之后將種苗植株栽植到腐熟草炭土、腐爛松針和珍珠巖基質(zhì)中，混合比例3: 2: 1，溫度控制在20 ±2 °C，保持相對(duì)濕度在70%，自然光照8 h · Cf1。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種植物種植技術(shù)，即東北紅豆杉試管內(nèi)一步成苗方法。其步驟如下(1)取東北紅豆杉野生實(shí)生苗主干上的新發(fā)主莖，切割成段作為外植體備用；(2)莖段生根同時(shí)腋芽萌發(fā)生長(zhǎng)培養(yǎng)基成分和含量培養(yǎng)基＋吲哚乙酸IAA(0.03～0.04mg·L-1)＋萘乙酸NAA(0.02～0.03mg·L-1)＋激動(dòng)素KT(0.11～0.12mg·L-1)＋赤霉素GA3(2.60～2.80mg·L-1)；添加瓊脂粉8.0g·L-1，添加蔗糖20.0g·L-1，調(diào)節(jié)pH值至5.6，嫩莖段在光照周期6h·d-1、光照強(qiáng)度700lx和溫度20±2℃條件下培養(yǎng)。本發(fā)明為進(jìn)一步人工規(guī)?；敝澈驮耘鄸|北紅豆杉提供優(yōu)質(zhì)種苗。煉苗移栽成活率可達(dá)到95.2%以上。
文檔編號(hào)A01H4/00GK103039365SQ20131001895
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2013年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月18日
發(fā)明者朱俊義, 顧地周, 顧川岳, 姜云天, 楊麗娟, 郭志欣, 梁宇, 潘雨, 張學(xué)士 申請(qǐng)人:通化師范學(xué)院