專利名稱：一種杉木體細(xì)胞胚胎發(fā)生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬林業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種杉木體細(xì)胞胚胎發(fā)生方法，對杉木體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系進(jìn)行優(yōu)化，提高杉木體胚發(fā)生頻率。
背景技術(shù)：
衫太XCunninghamialanceolata (Lamb.) Hook)隸屬杉科(Taxodiaceae)杉木屬(Cunninghamia)，是我國特有的常綠針葉樹種之一，廣泛分布于我國南方山區(qū)。杉木生長快，干形通直圓滿，耐腐蝕，且木材紋理十分美觀，是重要的商品用材和造林樹種。我國杉木的栽培歷史可以追溯到3000多年前。經(jīng)過“六五”至“九五”杉木攻關(guān)計劃的系統(tǒng)研究，用常規(guī)育種手段已選育出一大批杉木優(yōu)良種源、家系和優(yōu)良無性系供生產(chǎn)使用，為我國速生豐產(chǎn)林建設(shè)作出了重要貢獻(xiàn)。由于杉木造林形勢的迫切需求，一種快速有效的杉木優(yōu)良種質(zhì)資源的無性繁殖技術(shù)一體胚發(fā)生技術(shù)應(yīng)運而生。體胚發(fā)生技術(shù)是指在體外條件下，未經(jīng)性細(xì)胞融合的體細(xì)胞模擬合子胚發(fā)育過程再生植株的一種技術(shù)。這種技術(shù)不受自然條件的約束，能大大縮短培養(yǎng)周期，快速繁育一大批品質(zhì)穩(wěn)定的優(yōu)良種苗，是實現(xiàn)杉木優(yōu)良種苗的商業(yè)化和工廠化經(jīng)營的重要手段。目前，陳金慧等(ZL 201010275858.0)已經(jīng)建立了以杉木優(yōu)樹未成熟合子胚誘導(dǎo)ESM、通過液體增殖ESM、并誘導(dǎo)體胚發(fā)生這一間接體胚發(fā)生途徑并實現(xiàn)植株再生的成功方法，然而受杉木自然屬性的影響，杉木次生代謝物豐富，而且其EMS結(jié)構(gòu)較松散，受液體剪切力作用后，胚柄結(jié)構(gòu)極易遭到破壞，通過液體增殖EMS時褐化嚴(yán)重，所以增殖效率十分有限，誘導(dǎo)體胚發(fā)生時，配`方還不夠完善，受材料狀態(tài)影響很大，誘導(dǎo)頻率不穩(wěn)定，距離產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)有很大差距。PSK能有效抑制EMS褐化的現(xiàn)象，提高其增殖效率。不管從間接體胚方式還是直接體胚發(fā)生方式都能有效提高體胚發(fā)生的頻率，縮短培養(yǎng)時間。植物磺肽素(Phytosulfokine, PSK),是新近在植物中發(fā)現(xiàn)的硫酸酯化的短肽類生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。已有研究表明其具有促進(jìn)懸浮細(xì)胞生長和增殖、導(dǎo)管分化、胚性細(xì)胞形成及提高花粉的群體效應(yīng)和植物耐熱性等生理效應(yīng)。PSK以兩種形式存在，分別是PSK-a [Tyr (SO3H) -1le-Tyr (SO3H) -Thr-Gln]和 PSK- β [Tyr (SO3H) -1le-Tyr (SO3H) -Thr]。已有研究多集中于PSK-α。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的:針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種杉木體細(xì)胞胚胎發(fā)生方法，通過對杉木體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系進(jìn)行優(yōu)化，提高杉木體胚發(fā)生頻率，以建立穩(wěn)定高效的杉木體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系。技術(shù)方案:為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
一種杉木體細(xì)胞胚胎發(fā)生方法，包括以下步驟:
(I)胚性胚柄細(xì)胞團(tuán)的起始誘導(dǎo)
采集的未成熟杉木優(yōu)樹球果于4°c保存一周后，經(jīng)表面滅菌后接種到添加了 PSK的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，23°C、暗培養(yǎng)20-25天；其中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為:DCR(Gupta and Durzan基本培養(yǎng)基)，2 6mg/L 2,4-D (2，4-二氯苯氧乙酸)，0.5 1.0mg/L 6-BA (6-芐氨基腺嘌呤)，0.5mg/L KT (6-呋喃氨基嘌呤)，I Omg/L Vc (維生素C)，0.5g/L水解酪蛋白，15g/L麥芽糖，
2.5g/L Ac (活性炭)，2.3g/L水晶洋菜。(2) EMS的維持與增殖
將誘導(dǎo)后的球果轉(zhuǎn)移至添加了 PSK的增殖培養(yǎng)基上，23°C、暗培養(yǎng)15-25天；其中，增殖培養(yǎng)基的配方為:DCR, 0.5 2mg/L 2，4-D，0.2 0.5mg/L 6-BA, I Omg/L 維生素 C，0.5g/L水解酪蛋白，30g/L麥芽糖；
(3)體胚發(fā)育與成熟
采用間接體胚發(fā)生方式或直接體胚發(fā)生方式；其中，間接體胚發(fā)生方式如下:
a.液體懸浮系的建立
先將維持與增殖后的EMS轉(zhuǎn)入液體增殖培養(yǎng)基，建立液體懸浮細(xì)胞系，進(jìn)行加速增殖，培養(yǎng)細(xì)胞的初始V/V密度為1.20%,搖床轉(zhuǎn)速為85 90r.p.m, 23°C、暗培養(yǎng)7天，然后轉(zhuǎn)入預(yù)處理培養(yǎng)基進(jìn)行預(yù)處理，搖床轉(zhuǎn)速仍然控制在85r.p.m左右，23°C、暗培養(yǎng)7天；其中，液體增殖培養(yǎng)基為:DCR,0.5 2mg/L 2，4-D, 0.2mg/L 6-BA, 0.5g/L 水解酪蛋白，2g/L 肌醇，30g/L 麥芽糖，0.0Tlmg/L PSK ;預(yù)處理培養(yǎng)基:DCR，5 I Omg/L ΑΒΑ, 0.1 1.0mg/L GA,I Omg/L 維生素 C，0.5g/L 水解酪蛋白，30g/L 麥芽糖，0.0flmg/L PSK0b.體胚的成熟培養(yǎng)
預(yù)處理后的懸 浮細(xì)胞系轉(zhuǎn)移到成熟培養(yǎng)基，23°C，暗培養(yǎng)60-80天，其中，成熟培養(yǎng)基的配方為:DCR,3 8mg/L ABA (脫落酸)，I 5mg/L GA (赤霉素)，I Omg/L維生素C, 100 200g/L聚乙二醇(PEG 8000),0.5g/L水解酪蛋白，30g/L麥芽糖，2g/L活性炭，2.8g/L水晶洋菜。直接體胚發(fā)生方式如下:
將繼代2(Γ25天的增殖培養(yǎng)基上的EMS團(tuán)直接平鋪到體胚成熟培養(yǎng)基上進(jìn)行萌發(fā)，直至體胚成熟；成熟培養(yǎng)基的配方為:DCR, 3 8mg/L ΑΒΑ, I 5mg/L GA, I Omg/L維生素C,100 200g/L聚乙二醇，0.5g/L水解酪蛋白，30g/L麥芽糖，2g/L活性炭，2.8g/L水晶洋菜；
(4)體胚萌發(fā)成苗
將發(fā)育成熟的體胚轉(zhuǎn)移到DCR基本培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)萌發(fā)，即可實現(xiàn)植株的再生和培育成苗。步驟(I)中，PSK的添加量為0.0rimg/Lo步驟(2)中，PSK的添加量為0.0rimg/Lo步驟(3)中，體胚發(fā)育與成熟采用直接體胚發(fā)生方式進(jìn)行。有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的杉木體細(xì)胞胚胎發(fā)生方法，能有效改善常規(guī)液體懸浮系建立過程中的褐化現(xiàn)象，啟動低密度條件下的細(xì)胞分裂，維持胚柄細(xì)胞的穩(wěn)定性，從而建立穩(wěn)定增殖的液體懸浮細(xì)胞系；通過直接和間接的體胚發(fā)生方式，可以將杉木體胚發(fā)生的頻率最多提高20倍左右，很好地解決了因杉木體胚發(fā)生體系不完善而引起的體胚發(fā)生頻率低的問題，節(jié)約了成本，為實現(xiàn)杉木工廠化生產(chǎn)準(zhǔn)備了條件，加速其實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的步伐。


圖1是初始EMS從胚珠孔增殖而出顯微照片 圖2是PSKa對第一批未成熟合子胚胚性材料誘導(dǎo)和早熟萌發(fā)的影響結(jié)果圖；橫坐標(biāo)表示PSK濃度-預(yù)處理處理時間，其中2w表示2周，3w表示3周。圖3是PSKa對第二批未成熟合子胚胚性材料誘導(dǎo)和早熟萌發(fā)的影響結(jié)果 圖4是PSKa對第三批未成熟合子胚胚性材料誘導(dǎo)和早熟萌發(fā)的影響結(jié)果 圖5 PSKa β對液體懸浮系增殖的影響結(jié)果 圖6是添加PSK的懸浮EMS顯微照片 圖7是液體懸浮系兩周添加PSK與未添加對比 圖8是PSK a及處理時間對間接體胚發(fā)生頻率的影響結(jié)果 圖9是添加PSK直接體胚發(fā)生照片；
圖10是添加PSK直接體胚發(fā)生照片。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。以下實施例中，使用的DCR (Gupta and Durzan medium)基本培養(yǎng)基的構(gòu)成和標(biāo)準(zhǔn)配方為:340 mg/L KNO3, 556 mg/L Ca (NO3) 2.4Η20，400 mg/L NH4NO3,170 mg/L KH2PO4,85mg/L CaCl2.2H20，370 mg/L MgSO4*7H20, 37.3 mg/L Na2_EDTA.H20，27.9 mg/L FeS04.7H20，6.2 mg/L H3BO3,22.3 mg/L MnSO4*4H20,8.6 mg/L ZnS04*7H20,0.25 mg/L Na2MoO4*2H20,0.25mg/L CuS04*5H20, 0.83 mg/L KI, 0.025 mg/L CoCl2,200 mg/L MyO-1nositol, 2.0 mg/LGlycine,1.0 mg/L Thiamine1HCl,0.5 mg/L Nictinic*acid,0.5 mg/L Pyridoxine*HCl。實施例1胚性胚柄團(tuán)(EMS)的誘導(dǎo)。供試材料為6-7月每周分別采自福建順昌和衛(wèi)閩兩地的杉木無性系嫁接種子園的杉木優(yōu)樹的未成熟球果。各個采種時間點相對應(yīng)的種子發(fā)育階段分別為幼胚至成熟胚發(fā)育階段進(jìn)程。球果采集后，現(xiàn)場置預(yù)凍好的冰盒中，濕潤紗布包裹防止失水；隨后速置于4°C冰箱冷藏保存?zhèn)溆?。接種前，將備用球果從冰箱取出，用解剖刀和鑷子取出球果中帶種翅、發(fā)育良好的未成熟種子，用雕牌洗潔精富含高效復(fù)合活性劑，配成1:50濃度的洗液浸泡清洗lOmin，然后流水沖洗30min。在無菌環(huán)境中，將經(jīng)過初步清洗的未成熟種子轉(zhuǎn)移到高壓滅菌的三角瓶中，75%酒精中速泡30秒，再用0.l%HgCl2滅菌9min，最后用無菌水沖洗3遍，置于無菌濾紙上吸干，隨后用解剖刀和鑷子去除種皮，接種于分別添加PSK 0,0.01,0.l，lmg/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每皿接種8粒種子，每個處理接種5皿?？販?3°C、暗培養(yǎng)20-25天為一個繼代周期。本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基以DCR為基本培養(yǎng)基，附加2，4-D 2飛mg/L, 6-BA
0.5^1.0mg/L, KT 0.5mg/L, Vc 10 mg/L，水解酪蛋白 0.5 g/L，麥芽糖 15g/L，Ac 2.5g/L，水晶洋菜2.3 g/L。未成熟胚接種至上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，添加PSK的7天即可見誘導(dǎo)的ESM呈半透明狀含水量高的物質(zhì)從胚珠孔增殖而出后在培養(yǎng)基上擴(kuò)展，如圖1所示，而未添加的對照則要15天左右才可見誘導(dǎo)出的EMS。一個月后統(tǒng)計誘導(dǎo)出EMS及早熟萌發(fā)的頻率，如圖2、3、4所示，添加PSK后其EMS誘導(dǎo)率最多可提高40%左右， 而早熟萌發(fā)的頻率也相對提高。同時，PSK對EMS誘導(dǎo)的促進(jìn)作用隨未成熟合子胚的發(fā)育狀態(tài)變化。利用早期合子胚誘導(dǎo)EMS較易成功，PSK的促進(jìn)作用相對削弱，隨著合子胚的發(fā)育，至子葉胚時，其更易早熟萌發(fā)，PSK對EMS誘導(dǎo)的促進(jìn)作用更加顯現(xiàn)。誘導(dǎo)ESM增殖的繼代周期約為25天，23°C、暗培養(yǎng)。實施例2 EMS的維持與增殖培養(yǎng)。EMS的維持和增殖培養(yǎng)基，組成成分與誘導(dǎo)EMS的基本培養(yǎng)基相同，但將生長素濃度降低。杉木ESM維持和增殖培養(yǎng)以DCR為基本培養(yǎng)基，附加2，4-D 2飛mg/L，6_BA0.5^1.0mg/L, KT 0.5mg/L, Vc 10 mg/L，水解酪蛋白 0.5 g/L，麥芽糖 15g/L，Ac 2.5g/L，水晶洋菜2.3 g/L的固體培養(yǎng)基，添加PSK (0.0fl mg/L)，繼代周期25天，23°C、暗培養(yǎng)?？梢杂^察到添加了 PSK的增殖培養(yǎng)基上，其EMS胚柄細(xì)胞發(fā)育更好，同時材料分散性更好。實施例3體胚的發(fā)育與成熟。(I)間接體胚發(fā)生方式 A、液體懸浮培養(yǎng)
液體增殖培養(yǎng)基同以DCR為基本培養(yǎng)基，附加2，4-D 0.5^2 mg/L，6_BA 0.2mg/L，谷氨酰胺0.45 g/L，水解酪蛋白0.5 g/L，麥芽糖30 g/L。培養(yǎng)細(xì)胞的初始密度為1.20%(V/V)，搖床轉(zhuǎn)速為85 90r.p.m，23°C、暗培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)的時間控制為7天左右。并在液體增殖培養(yǎng)基中添加不同濃度的PSK (0.0f lmg/L)，進(jìn)行培養(yǎng)試驗。液體預(yù)處理培養(yǎng)基(DCR,5 10mg/L ΑΒΑ, 0.1 1.0mg/L GA, I Omg/L 維生素 C,
0.5g/L水解酪蛋白，30g/L麥芽糖)去除所有附加的激素，添加ABA (脫落酸)5 10mg/L，終止ESM繼續(xù)裂生,轉(zhuǎn)向體胚的成熟發(fā)育進(jìn)程。搖床轉(zhuǎn)速仍然控制在85r.p.m左右,23°C、暗培養(yǎng)7天左右。杉木次生代謝物十分豐富，且其EMS結(jié)構(gòu)很容易被液體的剪切力破壞，建立液體懸浮系時不像其他裸子植物那么容易。按常規(guī)方法建立液體懸浮系時，材料很容易褐化，且對搖床轉(zhuǎn)速很苛刻，高于85rpm褐化加劇，只能通過提前添加ABA進(jìn)行成熟前預(yù)處理才能抑制材料的褐化現(xiàn)象，盡管如此，褐化現(xiàn)象還是不能有效制止。添加了 PSK后能有效抑制褐化，同時明顯提高了增殖效率，如圖5，材料對搖床轉(zhuǎn)速也不嚴(yán)格，特別是其能在添加2，4-D的培養(yǎng)基中建立液體快速增殖體系。添加了 0.lmg/L PSK后，當(dāng)轉(zhuǎn)速為95rpm時也能穩(wěn)定增殖并獲得較分散的胚性胚柄團(tuán)結(jié)構(gòu)，如圖6，而未加PSK的懸浮系一周后嚴(yán)重褐化，兩周后即死亡，如圖7所示。B、體胚的成熟培養(yǎng)
體胚的成熟培養(yǎng)，采用DCR基本培養(yǎng)基，附加:T8mg/L ABA和f 5 mg/L赤霉素GA，活性炭2g/L，水晶洋菜2.8g/L。為了調(diào)節(jié)滲透壓，添加10(T200g/L PEG (聚乙二醇)8000，另外加入試劑級純度的麥芽糖30g/L，水解酪蛋白0.5 g/L。體胚的成熟培養(yǎng)時間控制為60-80天，23°C，暗培養(yǎng)。并在培養(yǎng)基中添加不同濃度的PSK ((Tl.0mg/L)，進(jìn)行培養(yǎng)試驗。如圖8所示，添加了 PSK后，體胚成熟時間提前，30-50天即有大量成熟體胚，且體胚發(fā)生頻率可提高20倍左右。同時，PSK的處理時間也對體胚發(fā)生有明顯作用，處理2周的材料其體胚發(fā)生能力明顯高于處理3周的材料。(2)直接體胚發(fā)生 將繼代20天左右的增殖培養(yǎng)基上的EMS團(tuán)直接平鋪到體胚成熟培養(yǎng)基(成熟培養(yǎng)基的配方為:DCR,3 8mg/L ΑΒΑ, I 5mg/L GA, I Omg/L 維生素 C, 100 200g/L 聚乙二醇，
0.5g/L水解酪蛋白，30g/L麥芽糖，2g/L活性炭，2.8g/L水晶洋菜)上進(jìn)行萌發(fā)。23 °C，暗培養(yǎng)。如圖9和圖10所示，添加了 lmg/L PSK的成熟培養(yǎng)基上的EMS的體胚發(fā)生頻率比未添加的高出10多倍。其省去了液體繼代等繁瑣的過程，且發(fā)生頻率非常高，易于工廠化生產(chǎn)的實施。

實施例4體胚萌發(fā)成苗
將發(fā)育成熟的體胚(實施例3培育)轉(zhuǎn)移到DCR基本培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)萌發(fā)，即可實現(xiàn)植株的再生和培育成苗。
權(quán)利要求
1.一種杉木體細(xì)胞胚胎發(fā)生方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)胚性胚柄細(xì)胞團(tuán)的起始誘導(dǎo) 采集的未成熟杉木優(yōu)樹球果于4°c保存一周后，經(jīng)表面滅菌后接種到添加了 PSK的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，23°C、暗培養(yǎng)20-25天；其中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為:DCR，2 6mg/L 2，4_D，0.5^1.0mg/L 6-BA,0.5mg/L ΚΤ，10mg/L Vc, 0.5g/L 水解酪蛋白，15g/L 麥芽糖，2.5g/LAc, 2.3g/L水晶洋菜； (2)EMS的維持與增殖 將誘導(dǎo)后的球果轉(zhuǎn)移至添加了 PSK的增殖培養(yǎng)基上，23 °C、暗培養(yǎng)15-25天；其中，增殖培養(yǎng)基的配方為:DCR, 0.5 2mg/L 2，4-D，0.2 0.5mg/L 6-BA，I Omg/L 維生素 C，0.5g/L水解酪蛋白，30g/L麥芽糖； (3)體胚發(fā)育與成熟 采用間接體胚發(fā)生方式或直接體胚發(fā)生方式；其中，間接體胚發(fā)生方式如下: a.液體懸浮系的建立 先將維持與增殖后的EMS轉(zhuǎn)入液體增殖培養(yǎng)基，建立液體懸浮細(xì)胞系，進(jìn)行加速增殖，培養(yǎng)細(xì)胞的初始V/V密度為1.20%,搖床轉(zhuǎn)速為85 90r.p.m，23°C、暗培養(yǎng)7天，然后轉(zhuǎn)入預(yù)處理培養(yǎng)基，搖床轉(zhuǎn)速仍然控制在85r.p.m左右，23 °C、暗培養(yǎng)7天；其中，液體增殖培養(yǎng)基為:DCR，0.5 2mg/L 2，4_D，0.2mg/L 6-BA, 0.5g/L 水解酪蛋白，2g/L 肌醇，30g/L 麥芽糖，0.0Tlmg/L PSK ;預(yù)處理培養(yǎng)基:DCR，5 I Omg/L ΑΒΑ, 0.1 1.0mg/L GA, I Omg/L 維生素 C，0.5g/L 水解酪蛋白，30g/L 麥芽糖，0.0flmg/L PSK ；` b.體胚的成熟培養(yǎng) 預(yù)處理后的懸浮細(xì)胞系轉(zhuǎn)移到成熟培養(yǎng)基，23°C，暗培養(yǎng)60-80天，其中，成熟培養(yǎng)基的配方為:DCR,3 8mg/L ΑΒΑ, I 5mg/L GA, 10mg/L 維生素 C, 100 200g/L 聚乙二醇，0.5g/L水解酪蛋白，30g/L麥芽糖，2g/L活性炭，2.8g/L水晶洋菜； 直接體胚發(fā)生方式如下: 將繼代2(Γ25天的增殖培養(yǎng)基上的EMS團(tuán)直接平鋪到體胚成熟培養(yǎng)基上進(jìn)行萌發(fā)，直至體胚成熟；成熟培養(yǎng)基的配方為:DCR, 3 8mg/L ΑΒΑ, I 5mg/L GA, 10mg/L維生素C,100 200g/L聚乙二醇，0.5g/L水解酪蛋白，30g/L麥芽糖，2g/L活性炭，2.8g/L水晶洋菜； (4)體胚萌發(fā)成苗 將發(fā)育成熟的體胚轉(zhuǎn)移到DCR基本培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)萌發(fā)，即可實現(xiàn)植株的再生和培育成苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的杉木體細(xì)胞胚胎發(fā)生方法，其特征在于:步驟(I)中，PSK的添加量為0.01 lmg/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的杉木體細(xì)胞胚胎發(fā)生方法，其特征在于:步驟(2)中，PSK的添加量為0.01 lmg/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的杉木體細(xì)胞胚胎發(fā)生方法，其特征在于:步驟(3)中，體胚發(fā)育與成熟采用直接體胚發(fā)生方式進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種杉木體細(xì)胞胚胎發(fā)生方法，包括胚性胚柄細(xì)胞團(tuán)的起始誘導(dǎo)，EMS的維持與增殖和體胚發(fā)育與成熟；其中，體胚發(fā)育與成熟可采用間接體胚發(fā)生方式或直接體胚發(fā)生方式該杉木體細(xì)胞胚胎發(fā)生方法，能有效改善常規(guī)液體懸浮系建立過程中的褐化現(xiàn)象，啟動低密度條件下的細(xì)胞分裂，維持胚柄細(xì)胞的穩(wěn)定性，從而建立穩(wěn)定增殖的液體懸浮細(xì)胞系；通過直接和間接的體胚發(fā)生方式，可以將杉木體胚發(fā)生的頻率最多提高20倍左右，很好地解決了因杉木體胚發(fā)生體系不完善而引起的體胚發(fā)生頻率低的問題，節(jié)約了成本，為實現(xiàn)杉木工廠化生產(chǎn)準(zhǔn)備了條件，加速其實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的步伐。
文檔編號A01H4/00GK103070074SQ201310035599
公開日2013年5月1日 申請日期2013年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月30日
發(fā)明者施季森, 周小紅, 陳金慧, 趙芳芳 申請人:南京林業(yè)大學(xué)